2010药典 拉曼光谱法指导原则

拉曼光谱法指导原则

拉曼光谱法是研究化合物分子受光照射后所产生的散射，散射光与入射光能 级差和化合物振动频率、转动频率的关系的分析方法。

与红外光谱类似，拉曼光谱是一种振动光谱技术。所不同的是，前者与分子 振动时偶极矩变化相关，而拉曼效应则是分子极化率改变的结果，被测量的是非 弹性的散射辐射。

拉曼光谱通常采用激光作为单色光源，将样品分子激发到某一虚态，随后受 激分子弛豫跃迁到一个与基态不同的振动能级，此时，散射辐射的频率将与入射 频率不同。这种频率变化与基态和终态的振动能级差相当。这种“非弹性散射” 光就称之为拉曼散射。频率不变的散射称为弹性散射，即所谓瑞利散射。如果产 生的拉曼散射频率低于入射频率，则称之为斯托克散射。反之，则称之为反斯托 克散射。实际上，几乎所有的拉曼分析都是测量斯托克散射。

拉曼光谱与红外吸收光谱相似。用散射强度对拉曼位移作图。拉曼位移（以 cm-1 为单位）等于激发光的波数减去散射辐射的波数。由于功能团或化学键的拉 曼位移与它们在红外光谱中的吸收波数相一致，所以谱图的解析也与红外吸收光 谱相同。然而，通常在拉曼光谱中出现的强谱带在红外光谱中却成为弱谱带甚至 不出现，反之亦然。所以，这两种光谱技术常互为补充。

拉曼光谱的优点在于它的快速，准确，测量时通常不破坏样品（固体，半固 体，液体或气体），样品制备简单甚至不需样品制备。谱带信号通常处在可见或 近红外光范围，可以有效地和光纤联用。这也意味着谱带信号可以从包封在任何 对激光透明的介质，如玻璃，塑料内，或将样品溶于水中获得。现代拉曼光谱仪 使用简单，分析速度快（几秒到几分钟），性能可靠。因此，拉曼光谱与其他分 析技术联用比其他光谱联用技术从某种意义上说更加简便（可以使用单变量和多 变量方法以及校准）。

除常规的拉曼光谱外，还有一些较为特殊的拉曼技术。它们是共振拉曼，表 面增强拉曼光谱， 拉曼旋光，相关-反斯托克拉曼光谱，拉曼增益或减失光谱以 及超拉曼光谱等。其中，在药物分析应用相对较多的是共振拉曼和表面增强拉曼 光谱法。

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⑴ 共振拉曼光谱法

当激光频率接近或等于分子的电子跃迁频率时，可引起强列的吸收或共振， 导致分子的某些拉曼谱带强度急剧增强数百万倍，这就是共振拉曼效应。

许多药物在紫外-可见光区有强的电子跃迁。某些含发色团化合物的拉曼光 谱因共振而增强，而其基体物质的光谱却不会增强。共振拉曼技术与常规拉曼光 谱技术不同之处在于要求光源可变，可调谐染料激光器是获得共振拉曼光谱的必 要条件。

有些化合物可通过化学反应改变其结构，使之最大吸收峰接近激发光频率， 如生成有色化合物，然后再进行共振拉曼光谱测定也是一个提高灵敏度的较有效 的方法。

共振拉曼技术由于灵敏度高而特别适用于药物和生物大分子的研究。但伴随 样品本身或由杂质引起的荧光，以及为这一特殊光谱所需的激光和光学设计费 用，限制了共振拉曼光谱的应用。

⑵ 表面增强拉曼光谱法（SERS） 吸附在极微小金属颗粒表面或其附近的化合物（或离子）的拉曼散射要比该

化合物的正常拉曼散射增加 103～106 倍。这种表面增强拉曼散射(SERS)在银表 面上最强，在金或铜的表面上也可观察到。

SERS 现象主要由金属表面基质受激而使局部电磁场增强所引起。效应的强 弱取决于与光波长相对应的表面粗糙度大小，以及和波长相关的复杂的金属电介 质作用的程度。许多 SERS 基质可以用于药物分析，最常用的包括溶胶，电极， 电介质表面金属膜等。

带孤对电子或 π 电子云的分子呈现的 SERS 效应最强，其他芳氮或含氧化合 物，如芳胺和酚，也具有强的 SERS 活性，这一效应在其他电负性功能团如羧酸 中也能观察到。

从少数分子获得大量结构信息的可能性使得 SERS 可用于解决高灵敏度化 学分析的许多问题。在表面增强拉曼光谱中，荧光的干扰可有效地得到抑制。

定性和含量测定

1、定性鉴别 拉曼光谱可提供有关样品分子中存在何种功能团的结构信息。所以可用于鉴

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别试验和结构解析。 在相同的测定条件下，绘制供试品与对照品的拉曼光谱进 行比对，若两光谱相同，即鉴别为同一化合物。如遇多晶现象，可参照红外鉴别 的相关内容进行处理。

2、含量测定 拉曼谱带的强度与待测物浓度的关系遵守比尔定律：

I V = KLCI 0

其中 I V 是给定波长处的峰强，K 代表仪器和样品的参数，L 是光路长度，C 是样 品中特定组分的摩尔浓度，I 0 是激光强度。实际工作中，光路长度被更准确的描 述为样品体积，这是一种描述激光聚焦和采集光学的仪器变量。上述等式是拉曼 定量应用的基础。

3、影响定量测定的因素 最主要的干扰因素是荧光、样品的热效应和基质或样品自身的吸收。在拉曼

光谱中，荧光干扰表现为一个典型的倾斜宽背景。因此，荧光对定量的影响主要 为基线的偏离和信噪比下降，荧光的波长和强度取决于荧光物质的种类和浓度。 与拉曼散射相比，荧光通常是一种量子效率更高的过程，甚至很少量不纯物质的 荧光也可以导致显著的拉曼信号降低。使用更长的波长例如 785nm 或 1064nm 的 激发光可使荧光显著减弱。然而，拉曼信号的强度与λ

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成比例，λ是激发波长。

通过平衡荧光干扰、信号强度和检测器响应可获得最佳信噪比。

测量前将样品用激光照射一定时间，固态物质的荧光也可得以减弱。这个过 程被称为光致漂白，是通过降解高吸收物质来实现的。光致漂白作用在液体中并 不明显，可能是由于液体样品流动性，或荧光物质不是痕量。

样品加热会造成一系列的问题，例如物理状态的改变（熔化），晶型的转变 或样品的烧灼。这是有色的、具强吸收或低热传导的小颗粒物质常出现的问题。 样品加热的影响通常是可观察的，表现在一定时间内拉曼光谱或样品的表观变 化。除了减少激光通量，有许多种方法可用来降低热效应，例如在测量过程中移 动样品或激光，或者通过热接触或液体浸入来改善样品的热传导。

基质或样品本身也可吸收拉曼信号。在长波傅里叶变换拉曼系统中，拉曼信 号可以与近红外的泛频吸收重叠。这种影响与系统的光学以及样品的形态有关。 装填和颗粒大小的差异而引起的固体散射的可变性与这种效应有关。然而，由于

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在拉曼光谱中样品的有限穿透深度和相对狭窄的波长范围，所有这些效应的大小 都没有近红外光谱严重。 定量拉曼光谱与许多其它的光谱技术不同，它是单光

束零背景测量。谨慎地

进行样品测定以及使用设计合理的仪器可以使这种变异减到最小，但是并不能全 部消除。所以，绝对的拉曼信号强度很难直接用于待测物的定量。变异的潜在来 源是样品的不透明性和样品的不均匀性、照射样品的激光功率的变化以及光学几 何学或样品位置的变化。这些影响可以通过能重复的或有代表性的样品处置方式 予以减小。

由于拉曼信号绝对强度的波动，使用内标是最普通和有效的减少可变性的方 法。内标方法有几种变通选择。可以有目的地加入一种内标，该内标应具有与待 测物互不干扰的独特谱带以便检测。在溶液中，也可利用溶剂的独特谱带，因为 溶剂随样品不同将相对保持不变。另外，在制剂中，如果赋形剂量大大超过待测 组分，则可以使用该赋形剂的峰。在假设激光和样品定位的改变将会同等地影响 全光谱的前提下，全光谱同样可以用作参比。

样品测定中需考虑的重要因素还有光谱的污染。拉曼是一种可以被许多外源 影响掩蔽的弱效应。普通的污染源包括样品支持物（容器或基质）和周围光线。 通常，这些问题可以通过细致的实验方法来识别和解决。

仪器装置

根据获得光谱的方式，拉曼光谱仪可分为 FT 拉曼光谱仪和色散型拉曼光谱 仪，但所有的现代拉曼光谱仪均包括激光光源、样品装置、滤光器、单色器（或 干涉仪）和检测器等组成。

⑴激光光源

表 1 列出几种在药学应用中经常使用的激光。紫外激光有时也有特殊应用， 但是由于种种原因在常规分析中很少采用。

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表 1：药学应用中的主要激光

激光波长 λ ，纳 类型 米（近似整数） 近红外激光 1064 激光典 波长范围（纳米）斯托（100cm –1～3000 注释 型功率 克区域cm –1） 固态（钕：YAG） 最大 3W 1075–1563 常在傅里叶 变换仪器中 使用 在多数色散 拉曼中广泛 存在 785 二极管 最 大 791–1027 500MW 紫外-可见光 488–632.8 紫外-可见

荧光风险 荧光风险 离子气和固态， 最大 1W 488–781 双频率激光 染料激光器 可调 在紫外和可见光区可调 ⑵ 样品装置

可有各种各样的样品放置方式，包括直接的光学界面，显微镜，光纤维探针 （不接触或光学浸入）和样品室（包括特殊的样品盛器和自动样品转换器）。样 品光路也可被设计成能获得偏振相关拉曼光谱，这种光谱通常包含附加信息。样 品装置的选择应根据待测物的具体情况（如样品的状态、体积等）以及测量的速 度，激光的安全性和样品图谱的质量要求等决定。

⑶ 滤光装置 激光波长的散射光（瑞利光）要比拉曼信号强几个数量级，必须在进入检测

器前滤除。陷波滤波器几乎被普遍应用于这个目的，它具有滤波效果好和体积小 等优点。另外，为防止样品不被外辐射源（例如：房间的灯光，激光等离子体） 照射，需要设置适宜的滤波器或者物理屏障。

⑷ 光波处理装置 光波信号可通过色散或者干涉（傅里叶变换）来处理。任何合格仪器都适用

于定性鉴别。然而，选择定量测定用仪器时，应注意色散和线性响应可能在整个 波谱范围内并不均衡（例如当使用阶梯光栅分光镜时）。

⑸ 检测器

硅质 CCD 是色散仪器中最常用的检测器。这种冷却的阵列检测器允许在低 噪声下的快速全光谱扫描。常与通常使用的 785 纳米二极管激光器配合使用。傅 里叶变换仪器通常采用单通道锗或铟－镓－砷化合物(InGaAs)检测器以配合钕：

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钇－铝－石榴红(Nd:YAG)1064 纳米的激光器在近红区使用。

仪器校正

拉曼仪器的校准包括三个要素：初始波长（X 轴）,激光波长以及强度（Y 轴）。 仪器供应商应该提供一种由用户可以执行的，对仪器相关参数校准的方

法，

除另有规定外，使用者应根据仪器所提供的校准方法制定具体的 SOP，并严格按 照 SOP 对上述参数进行验证。

特别需要注意到，激光波长变化可影响仪器的波长精度和光度（强度）精度。 即使是最稳定的激光器在使用过程中，其输出波长也会有轻微变化。所以，激光 波长必须被校正以确保拉曼位移的准确性。可以使用仪器公司提供的拉曼位移标 准参考物质进行定期校正。某些仪器可以用一种拉曼内标物与初级光路分离，外 在校准装置通过散射辐射准确地重现这一光路。

推荐使用外部参考标准对仪器进行校正。 方法验证 对拉曼方法进行验证是必须的，至少应考察准确度，精密度等主要指标，然

而，这些指标受诸多可变因素的影响，其中荧光可能是影响方法适用性的主要变 量。样品中荧光杂质的存在完全随样品而异。所以，方法必须能适应不同样品体 系，必须足以将杂质的影响降到最小。

检测器的线性必须适应可能的信号水平范围。荧光可能使信号基线比验证时 高，这时必须设法将荧光减弱或者使验证的方法适应较高的荧光水平。这一要求 对方法的精密度，检测限（LOD）和定量限（LOQ）同样适用，因为基线噪声 的增加会对这些数值产生影响。

由于荧光使基线漂移可能同样会影响定量，所以使用时，同样需要在不同的 光漂白作用水平进行可接受的定量验证。

必须确定激光是否对样品造成影响。在不同激光功率和暴露时间的条件下， 对样品目视检查和仔细审视测得的拉曼光谱测量可以确定样品是否改变（而不是 光漂白作用）。观察到依据是谱带的位置、峰强和谱带宽度是否改变或者背景强 度是否有明显的变化。

影响方法精密度的因素还包括样品的位置。样品的形态对于固体或液体都是

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非常重要的因素，在校正模型中必须严密控制或说明。样品的制备方法或样品试 架的形状可能影响测量灵敏度，而且，该灵敏度会随着仪器的激发光和采集光学 设置的不同而不同。

测定法 获得拉曼光谱可以采用下述任一物质态：结晶态、无定型、液体、气体或等

离子体。 液体能够在玻璃管或石英管中直接测量。无定型和微晶固体也可充填

入玻璃

管或石英管中直接测定。为了获得较大的拉曼散射光强度，通常使照射在样品上 的入射光与所检测的拉曼散射光之间的夹角为 0o，90o 和 180o。样品池的放置可 有多种方式。

除另有规定外，一般用作鉴别的样品不必制样，用作晶型、异构体限度检查 或含量测定时，供试品的制备和具体测定方法可按正文中各品种项下有关规定操 作。

某些特殊样品技术可被应用于表面增强拉曼光谱和显微拉曼光谱测量。 为防止样品分解常采用的一种办法是旋转技术，利用特殊的装置使激光光束 的焦点和样品的表面做相对运动，从而避免了样品的局部过热现象。样品旋转技 术除能防止样品分解外，还能提高分析的灵敏度。

常采用内标法定量，在激光照射下，加入的内标也产生拉曼光谱，选择其一 条拉曼谱带作为标准，将样品的拉曼谱带强度与内标谱带的强度进行比较(通常 比较谱带的面积或高度)。由于内标和样品完全处于相同的实验条件下，一些影 响因素可以相互抵消。

所选择的内标应满足以下要求：

① 化学性质比较稳定，不与样品中被测成分或其它成分发生化学反应，② 内标拉曼谱带和待测物的拉曼谱带互不干扰，③ 内标应比较纯，不含有被测成 分或其他干扰成分。对于非水溶液，常用的内标为四氯化碳(459cm-1)；而对于水 溶液，常用的内标是硝酸根离子(1050cm-1)和高氯酸根离子。对于固体样品，有 时选择样品中某一拉曼谱带作为自身对照内标谱带。

具有多晶现象的固体药品，由于晶型的不同，可能导致所收集供试品的光谱

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图与对照品光谱图或与标准光谱集所收载的光谱图不一致，遇此情况，应按该品 种项下规定的方法进行预处理后再绘制比对。 光谱的形状与所用的仪器型号和

性能、激发波长、样品测定状态、及吸水程

度等因素相关。因此，进行光谱比对时，应考虑各种因素可能造成的影响。

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