大肠杆菌培养感受态制备质粒转化及鉴定

大肠杆菌的培养

1. LB培养基配制： （液体培养基） ① 取1L的烧杯，加入适量的一蒸水（＜1000ml），称取胰蛋白胨 10g , 酵母提取物 5g , Nacl 10 g 倒入烧杯中

② 加入磁子搅拌，至完全溶解 ③ 用NaoH调PH=7.0，定容至1L ④ 分装后高压蒸汽灭菌 （固体培养基） ① 在液体培养基的基础上加入琼脂糖：1L液体培养基→15g琼脂糖（用水先溶解） ② 在电炉子上边加热边搅拌至煮沸溶解 ③ 分装后高压灭菌

抗生素的加入温度要求：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 注意事项：

① 电炉子温度不要太高，烧杯直接加热时电炉子上要加石棉网 高压灭菌时，瓶盖上要插上针头，防止灭菌时瓶盖喷出 2. 倒平板：

培养皿要提前进行灭菌、烘干，在超净工作台里，打开酒精灯，在酒精灯的火焰旁进行操作，倒完后做好标记

3. 接种（平板划线分离法）：

接种环挑取大肠杆菌进行接种：图式：

注意：每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。 4. 37°恒温培养箱培养：

接种好的培养皿正置15分钟，然后倒置放入培养箱过夜培养

倒置培养原因：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸汽的形式蒸发，倒置培养皿则会使水蒸汽凝结成水滴留在盖上。如果正方，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。

大肠杆菌感受态的制备及转化

感受态：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化：是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 一、制备：步骤

从大肠杆菌DH5α的培养平板上挑取一个单菌落接于2mL

LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

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以1%的接种量将以上过夜培养物接种于液体培养基中

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37℃振荡培养2～3h

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将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min

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4000rpm，离心10min回收细胞

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倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽

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用冰冷的0.1mol/L CaCl 2 10mL，悬浮沉淀

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立即放在冰上保温30min

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4℃，4000rpm，离心10min，回收细胞

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用冰冷的0.1mol/L CaCl 2 2mL悬浮细胞（务必放冰上）

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分装细胞，每200μl一份。此细胞为感受态细胞。

二、转化：步骤：

在200μl新鲜配制的感受态细胞中加入质粒 DNA2μl(≤50ng)，

混匀同时做以下对照管

（受体菌对照：200μl感受态细菌+2μl无菌水 质粒对照：200μl 0.1mol/L CaCl 2溶液+2μl质粒）

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冰上放置30min

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将管放到42℃循环水浴热冲击90s

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取出，迅速冰浴2min

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每管加800μl LB液体培养基，37℃慢摇复苏1h

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取50μl已转化的感受态细胞或对照样品， 各分别涂在含有或不含有氨苄青霉素的培养皿中

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待吸干菌液后，倒置培养皿，于37℃培养过夜

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次日在含氨苄青霉素的培养皿上长的菌落即为含有质粒的大肠杆菌（即转化成功）

质粒DNA的提取

1.溶液：

溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖 、25 mmol/L Tris （pH=8.0）、10 mmol/L EDTA 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaoH、2% SDS 溶液Ⅲ：5mol/L醋酸钾（KAc）：60ml、冰醋酸：11.5 ml、H2O： 28.5 ml 2.步骤：

在锥形瓶中加入100mL液体培养基，向培养基中加入100ul氨苄青霉素

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挑取单菌落接种于锥形瓶中，37℃培养过夜

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次日，取1.5ml培养物于EP管中，4000rpm离心2min

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吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥

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将细菌沉淀悬浮于100ul溶液Ⅰ中，充分混匀，室温放置10min

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加200ul溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，轻柔混匀混合物，冰上放置5min

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加入150ul预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置15min

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12000rpm离心15min，将上清转移至另一EP管

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向上清中加入等体积的氯仿（去蛋白），反复混匀， 12000rpm离心5min，将上清转移至另一EP管

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向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min， 12000rpm离心5min，倒去上清液，把EP管倒扣在吸水纸上，吸干液体

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用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，震荡并离心，

倒去上清液，真空抽干或空气中干燥

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加入20ul TE缓冲液或无菌水，溶解DNA，-20℃保存

3.注意事项：

①在混匀时，不能剧烈震荡，动作一定要轻柔。

②氯仿抽提完，转移上清时，一定不要吸到中间蛋白层，宁少勿多。

质粒DNA的鉴定

琼脂糖凝胶电泳检测DNA

步骤：

1.制备琼脂糖凝胶电泳：在锥形瓶中加入45 ml 0.5×TBE缓冲液，称取0.45g琼脂糖放入

锥形瓶中，置微波炉中2min，中火加热至完全熔化，取出摇匀，则为1%的琼脂糖凝胶。 2.待琼脂糖凝胶冷却至70℃时，加入10ul溴化乙锭（Eb）

3.取有机玻璃内槽，洗净晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好，一定要封严，放好梳子

4.将冷到60℃琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）

5.目视凝胶凝固后，再过半个小时，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内，加入0.5×TBE缓冲液至电泳槽中，加至液面刚没过胶板约1mm

6.加样：将buffer（染料）与被测DNA混合，用移液枪将样品加入到梳子孔中，对照滴在最下面的孔

7.电泳：接通电源，调节电压120V、电流80mA

8.观察结果：在将胶板放在紫外灯下，连接电脑，拍照。

氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）

溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml）

溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林（methicillin）（100mg/ml）

溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml）

溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）

溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素（streptomycin）（50mg/ml）

溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml）

溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素（tetracyyline）（10mg/ml）

溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/gac3.html