几种主要稀有放线菌的选择性分离

文章编号:100128751(2002)0120018205

几种主要稀有放线菌的选择性分离

李文均1　张忠泽2　姜成林1　　综述

(1云南大学教育部微生物资源开放研究重点实验室,　昆明650091;

2中国科学院沈阳应用生态研究所,　沈阳110015)

摘要:　放线菌是具有巨大工业价值的一类微生物,但一百多年来人们只分离到自然界实有总数的10%～

20%。之所以绝大多数的微生物未被发现,主要原因是受分离条件和技术的限制。因此放线菌尤其是稀有放线菌的

选择分离技术仍然是放线菌生物学研究和资源开发中的重大课题。作者根据自己在放线菌分离方面的多年经验,对一些主要的可产生生物活性物质的稀有放线菌(小单孢菌、小双孢菌、小四孢菌,链孢囊菌、指孢囊菌,游动放线菌,马杜拉放线菌,双孢放线菌)常用的选择性分离方法进行系统介绍。

关键词:　稀有放线菌;　选择分离;　方法中图分类号:　Q 939.13+2　　　文献标识码:　A

收稿日期:2001204226;　修订日期:2001210205

基金项目:教育部微生物资源开放研究重点实验室开放研究基金资助项目。

作者简介:李文均,男,生于1973年,在读博士研究生,助理研究员,主要从事放线菌的分离、分类研究。

张忠泽,男,生于1939年,研究员,博士研究生导师,主要从事微生物资源应用基础研究。姜成林,男,生于1942年,研究员,博士研究生导师,主要从事微生物资源应用基础研究。

放线菌作为新的生物活性代谢产物的主要来源早已成为人们关注的焦点。然而由于大多数放线菌菌株已被反复研究,因此从中发现新化合物的机率在逐渐降低。新菌种必然有新的基因,新基因必然产生新的代谢产物[1],这一观点早已为微生物学及微生物药物学工作者所接受。

由W ak s m an 建立的抗生素筛选系统主要是从土壤微生物,且主要是从放线菌中的链霉菌的代谢产物中来寻找新的抗生素,但其发现新抗生素的频率逐渐下降。自从20世纪50年代发现有价值的抗生素,如紫色小单孢菌及其它小单孢菌产生的庆大霉素,诺卡氏菌产生的利福霉素,马杜拉放线菌产生的马杜拉霉素、洋红霉素等以后,人们发现稀有放线菌也具有产生抗生素的潜力[2]。

放线菌的最主要分离源是土壤,链霉菌是其优势菌群,而非链霉菌的分布密度相对来说非常低。过去常用的传统的稀释涂布平板法主要分离的放线菌大多数是较为常见的链霉菌。因而大多数稀有放线菌的分离必须用特殊的具有高度选择性的分离条件才能分离到。现代的以寻找新的生物活性物质为主要目的的微生物资源开发研究也要求我们必须采用较为新的或改进的筛选手段去选择分离特殊的或稀有的非链霉菌菌株。近年来国内外学者在对稀有放线菌进行选择性分离的研究方面也取得了较大的进展[3～7],同时也用这

些特殊的分离方法分离到不少的稀有放线菌。本文介绍了几种主要的且能产生生物活性物质的稀有放线菌及其高选择分离方法。

1　高选择性分离小单孢菌、小双孢菌和小四孢菌1.1　小单孢菌的选择性分离

小单孢菌通常无气生菌丝,偶见稀疏气生菌丝;基内菌丝发育良好,有分枝;孢子单个生长,无或有柄。小单孢菌是抗生素的重要产生菌,临床上应用的许多氨基糖苷类抗生素(如庆大霉素等)都由小单孢菌产生,目前从小单孢菌代谢物中发现的抗生素种类仅次于链霉菌。小单孢菌的生存环境十分广泛,在土壤及水生环境、高低温环境、碱性环境均有分布。在湖底泥中,小单孢菌占放线菌总数的30%～90%,是优势菌,对湖泊及贝壳类沉淀物及有毒物的分解起重要作用[8]。

高选择性分离小单孢菌的程序为:土样自然风干→制成土壤悬浮液(10-1)→1.5%苯酚30℃处理30m in (10-2)→(10-4,0.2m l )涂布平板(HV 琼脂+萘啶酸20m g L +衣霉素20m g L )。分离平板的总菌落数随土样而不同,有60%～100%是小单孢菌[3]。衣霉素和萘啶酸作为细菌、真菌和非目的放线菌的抑制剂。1.2　小双孢菌的选择性分离

小双孢菌的特征在于在气生菌丝上形成成纵对的孢子。基内菌丝上不产生孢子。大多数小双孢菌生长需要B 族维生素,特别是硫胺素。

干,研细→100℃干热处理15m in→制备土壤悬浮液(10-1)→1.5%苯酚+0.03%葡糖酸氯己啶30℃处理15m in(10-2)→(10-3,0.1m l)涂布平板(HV琼脂+萘啶酸20m g L)。

1.3　小四孢菌的选择性分离

小四孢菌气生菌丝、基内菌丝均发育良好。在气生菌丝上产生短孢子链,有些有4个孢子,也有的为2、3个,甚至超过10个以上的短孢子链。有的菌种需要维生素才能生长。

高选择分离小四孢菌的程序为:土样自然风干→110℃干热预处理1h→制备土壤悬浮液(10-1)→0.05%苄索氯铵30℃处理30m in→(10-2,0.2m l)涂布平板(L SV2SE琼脂+卡那霉素20m g L+诺氟沙星20m g L+萘啶酸10m g L)。

L SV2SE琼脂培养基是H ayaka w a和N onom ura 在HVA培养基[9]基础上新设计的一种培养基,主要以木质素为主要碳源,以豆饼粉为氮源,其它微量成分均与HVA培养基相同。木质素能有效促进小四孢菌的孢子萌发及生长。在L SV2SE琼脂培养基中添加一定量的抗菌剂(卡那霉素,萘啶酸用来抑制细菌和非目的放线菌的生长,放线酮主要抑制真菌的生长),再加上事先采用110℃干热及0.05%苄索氯铵处理土样,就可大大降低细菌及非目的放线菌的生长。

HVA培养基(1L)组成:腐殖酸1.0g,CaCO30.02 g,N a2H PO40.5g,M gSO4?7H2O0.5g,KC l1.7g, FeSO4?7H2O0.01g,核黄素0.5m g,硫胺素0.5m g,维生素B60.5m g,烟酸0.5m g,肌醇0.5m g,泛酸0.5m g,生物素0.25m g,对2氨基苯甲酸0.5m g,琼脂18g,放线酮50m g,pH7.2。

L SV2SE培养基(1L)组成:木质素1.0g,豆饼粉0.2g,CaCO30.02g,N a2H PO40.5g,M gSO4?7H2O0.5 g,KC l1.7g,FeSO4?7H2O0.01g,核黄素0.5m g,硫胺素0.5m g,维生素B60.5m g,烟酸0.5m g,肌醇0.5 m g,泛酸0.5m g,生物素0.25m g,对2氨基苯甲酸0.5 m g,琼脂18g,pH7.2。添加的抑制剂有:卡那霉素20m g L,诺氟沙星20m g L,萘啶酸10m g L,放线酮50m g L,制霉菌素50m g L。

H asaka w a等[10]用上述方法对采自日本的26份样品进行分离,其中18份样品(16份为耕地和森林土样,2份为小溪和湖泊里的沉淀物)中仅青色小四孢菌类群的检出率就占其总菌落数的2%～27%,而且所有的小四孢菌均具有分解木质纤维的能力,其中14%～16%的小四孢菌具有抗菌活性。2.1　选择性分离链孢囊菌

链孢囊菌属是1955年由Couch建立的。链孢囊菌的气生菌丝发育良好,产生球形孢囊,其大小变化很大。有的菌种需要维生素才能生长。由于其能够产生多种有用的代谢产物,成为微生物资源研究和抗生素研究的一个热点。已发现链孢囊菌能产生多种具有抗菌、抗肿瘤活性的抗生素,其产生抗生素的种类和数量居放线菌中的第4位,且不少抗生素具有很高的生物活性。此外,链孢囊菌还可以产生溶菌酶、葡萄糖异构酶、溶纤维蛋白酶、天冬酰胺酶等多种生物活性物质,是极有开发潜力的微生物资源。

选择性分离链孢囊菌的程序为:土样自然风干→120℃干热预处理1h→制备土壤悬浮液(10-1)→0.01%苄索氯铵30℃处理30m in→(10-3,0.1m l)涂布平板(HV琼脂+萘啶酸20m g L+吉他霉素1m g L)。

2.2　选择性分离指孢囊菌

指孢囊放线菌属由T h ie mm ann等1976年建立。无真正的气生菌丝,基内菌丝长成丛或单个指状或棒状的孢囊,多分枝。广泛分布在土壤与湖泊的沉积物中。主要产生氨基糖苷类、核苷类、多烯类抗生素,如吡啶霉素(pyridom ycin)、dacti m icin、tiacum icins[19]等。

选择性分离指孢囊菌的程序为:土样自然风干→100℃干热预处理15m in→制备土壤悬浮液(10-1)→0.03%苄索氯铵30℃处理30m in→(10-3,0.1m l)涂布平板(HV琼脂+萘啶酸20m g L+衣霉素10m g L)。3　高选择性分离游动放线菌

阎逊初及其它学者都把小单孢菌和有孢囊的游动放线菌、小瓶菌、嗜毛水生菌等属分在不同的科。实际上根据数值分类、DNA同源性及rRNA相似性研究的结果,这些放线菌的亲缘关系比较相近,应归为一个类群,它们均是抗生素的重要产生菌。游动放线菌无气生菌丝,在基内菌丝上着生的短小孢囊柄顶端形成球形或略显不规则形的孢囊,其内部有直链状、螺旋状或不规则状排列的、成熟后带有直径为1～1.5Λm鞭毛的孢子。

游动放线菌在全世界都有分布。Parenti等从全世界收集土样,分离到2万多株游动放线菌[11]。这是获得游动放线菌最多的记录。分布与土壤类型无关,是重要的抗生素产生菌。我国报道的第一个新抗生素创新霉素就是由济南游动放线菌产生的。已发现游动放线菌产生的新抗生素至少有150多种,大致可分为放线菌素类、氨基酸类、核苷类、吩嗪类、多烯类、肽类等抗

生素。最近还报道了一些游动放线菌产生的酶和酶抑制剂。

3.1　用天然物质作诱饵捕集-干燥法高度选择性分离游动放线菌

用天然物质作诱饵捕集放线菌是分离游动放线菌(A ctinop lanes)、小瓶菌(A m p u llariella)、嗜毛水生菌(P ili m elia)、螺孢菌(S p irillosp ora)的典型方法。游动放线菌等稀有放线菌的孢囊的生活史是在陆生和水生环境中交替进行,在植物或动物残留物上生长的基内菌丝分化成孢囊,再通过风或其它方式传播。在水里孢囊释放出活跃的游动孢子。可能由于某种化学物质的吸引,游动放线菌会停留在新的底物上,并再进行繁殖[12]。

将土样悬浮于水中,在水面上加放花粉等作为诱饵来捕集游动放线菌,最初是Couch[13]利用自水中分离真菌方法加以改良的一种方法。取大约1g土壤放在一个小培养皿里,用无菌蒸馏水加满。然后用事先灭过菌的作诱饵的物质(常常是头发或花粉)放在水的表面。再将它们置于20℃条件下进行富集培养,可添加无菌水来调节其水平面。大约2～3周后可以进行镜检,最好使用立式高倍显微镜,通光设备要好。上面所提到的各属细菌的孢子可通过暴露在空气的诱饵边缘的闪耀的水珠来辨认。游动双孢菌和游动单孢菌形成稀少的气生菌丝,并伴有成束的小孢子囊。用接种针把带有微生物菌落的诱饵转移到一个表面明净的培养基上。在进行分离之前可使用光学显微镜直接观察富集培养物,弄清所要的孢子囊的位置。用一个细的弯曲的针尖挑出单个的孢囊,并把它滚到一边使其与附近的细菌分开,接着可以把它们直接转移到或连同切下的一块琼脂放在含有合适培养基的培养皿中。从花粉上分离的孢囊可转移到察氏琼脂培养基、蛋白胨察氏琼脂培养基或燕麦片琼脂培养基培养。

但这种方法也有其缺点,因为土壤悬浮液的花粉除游动放线菌外,对多种细菌都有捕集作用,而且需要在显微镜下操作才能除去这些细菌,技术上比较复杂。后来许多研究者加以改良,逐步发展到现在的在灭菌土壤中快速干燥处理带菌花粉以除去大部分细菌的花粉捕集-干燥法[6](图1)。

从土壤中分离游动放线菌的具体操作步骤:取风干细土5g,装入灭菌小型培养皿中,缓缓加入15m l无菌水,用滤纸片除去水面上悬浮的有机物,然后覆盖圆环状封口膜,在中心部位铺上花粉粒,30℃培养3d或更长时间,显微镜观察确认形成成熟的孢囊后,用接种饵采取花粉粒,置干热灭菌的滤纸上吸去水分,混入1.5g干热灭菌的细土或二氧化硅粉中,30℃维持1h,注入10m l无菌水,同上操作至游动孢子游离后,取上清液0.1～0.2m l接种在HV琼脂培养基或上述几种培养基上,30℃培养1～2周。

3.2　脱水-再水化法

主要利用放线菌的孢囊能经受一定的干燥,随后将其与水接触时又释放游动孢子的特性。这种方法适用于对土样、腐乱的树叶及其它固体天然物质的分离。应用于淡水环境碎叶片的脱水-再水化技术已获得许多游动放线菌和新的“Cup olo m y ces”属。后者首先被W ill oughby(1969)[14]分离到,并以Cup olo m y ces来命名这类“圆顶孢子”的放线菌。

刚采集的样品必须在30℃下脱水烘干1～2周,随后再用水处理。取0.5g土或相应的样品混于50m l 无菌水装在150m l的锥形瓶中,在20～30℃下培养约1h,前30m in悬浮液应有一定的摇动,

然后用吸管从

图1　　花粉诱饵-干燥法自土壤中选择性分离游动放线菌

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上清液中取0.5～1.0m l涂布平板,如有必要接种液可再稀释。建议使用土壤浸汁琼脂培养基、含放线酮和制霉菌素的几丁质胶琼脂培养基、燕麦片琼脂培养基、淀粉酪素琼脂培养基,28℃培养2～4周。

3.3　趋化法

趋化法最初由Palleroni为选择分离游动放线菌而设计[11],因为游动孢子囊特别是游动放线菌的孢子囊能被C l-和B r-吸引。分离装置很简单,只需一个具有2个圆孔的无菌塑料物体,圆孔通过1个中间渠道连结。取1g土样放在2个孔的同等部位,从边缘加无菌水,然后在30℃下培养约1h,孢子即可在水中自由移动。用毛细吸管将1m l0.01mol L的KC l缓冲液加入中间渠道中,再培养1h,游动放线菌的孢子就会积聚在毛细管的腔里,再用1m l无菌水或缓冲液稀释涂布平板。建议最好用淀粉酪素琼脂培养基,28℃培养1～3周。

4　高选择分离马杜拉放线菌

马杜拉放线菌最早由英国学者L echevalier夫妇(1970)提出。基内菌丝发达,不断裂;气生菌丝发育中等或稀少。成熟时,气生菌丝形成短,有时较长的分生孢子链形态呈直、钩或不规则螺旋。产生马杜拉霉素、洋红霉素等,对细菌、肿瘤等有较强的作用。原苏联学者用选择培养基的方法分离出许多马杜拉放线菌新种,即在分离培养基中加入链霉素、柔红霉素、新生霉素等。由于这类微生物产生的抗生素越来越多,经济价值颇大,很受各国学者重视。现在各国学者发展了许多新的且具有高选择性的分离方法。

4.1　干热-放线酮-利福平法[2]

基于大多数马杜拉放线菌能够耐受一定浓度的利福平,在葡萄糖—酵母浸膏琼脂(GYEA)培养基中添加适量的利福平可以有效地抑制细菌和非目的放线菌的生长,而对马杜拉放线菌及其它少量的放线菌如链霉菌或高温单孢菌却几乎没有影响。利福平也可用新生霉素(25m g L)代替,效果基本相同。

分离程序为:土样风干→100℃干热处理15m in→制备土壤悬浮液(10-1)→(10-3,0.1m l)涂布平板(GYEA琼脂+放线酮100m g L+利福平5m g L)。

4.2　干热-HM G-萘啶酮酸法[15]

干热处理土样可以有效抑制细菌的生长早已被许多学者证明,用此处理法和HM G选择性培养基,同样也能有效地选择分离土壤里的马杜拉放线菌。

分离程序为:土样风干→120℃干热处理60m in→制备土壤悬浮液(10-1)→(10-3,0.1m l)涂布平板(HM G琼脂+萘啶酸10m g L+甲氧苄啶50m g L)。

HM G培养基(1L)组成:腐殖酸0.5g,32(N2吗啉代)丙烷磺酸1g,CaC l20.33g,FeSO4?7H2O1m g, M nC l2?4H2O1m g,N iSO4?6H2O1m g,ZnSO4?7H2O1m g,胞外多糖胶7g,pH7.2。添加的抑制剂有:硫酸庆大霉素100m g L,氨苄西林钠20m g L,萘啶酸10m g L,甲氧苄啶50m g L。

5　高选择分离双孢放线菌

双孢放线菌属是我国学者姜成林和徐丽华等于1991年建立的[16],建属主要是根据其形态学特征,即气生菌丝和基内菌丝分枝不断裂;在基内菌丝和气生菌丝上生长着成纵对的双孢子。最初是在云南的一些地方分离到,后来胡润茂等(1994)又从广东和海南等地采集的土样中也分离到该属的菌株[17]。但双孢放线菌的选择性分离培养以及如何促进其气生菌丝生长等很多问题都没有得到解决。日本的Suzuk i[18,19]等以双孢放线菌作为他们筛选新的生理活性物质的主要目标菌,先后从亚非欧等世界各地采集土样对其进行了广泛而深入的大规模研究,并建立了一种有效的高选择分离双孢放线菌的方法。其步骤如下:土样自然风干→制备土壤悬浮液(10-1)→(10-3,0.1m l)涂布平板(HV G+制霉菌素50m g L+放线酮50m g L)[18]。

HV G培养基(1L)组成:腐殖酸1.0g,M gSO4?7H2O0.5g,KC l1.7g,CaC l20.02g,FeSO4?7H2O0.01 g,核黄素0.5m g,硫胺素0.5m g,维生素B60.5m g,烟酸0.5m g,肌醇0.5m g,泛酸0.5m g,生物素0.25m g,对2氨基苯甲酸0.5m g,N a2H PO40.5g,胞外多糖胶18g, pH7.2。

HV G培养基是在HVA培养基基础上改进的,与后者不同的是它含有CaC l2,并以胞外多糖胶代替了普通的琼脂。CaC l2和CaCO3一样,能有效促进孢子的萌发和气生菌丝的生长;而胞外多糖胶是一种多糖,它作为一种凝固剂过去常用于植物组织的培养,以促进其生长。实验证明往HV培养基添加适量的CaC l2并以胞外多糖胶代替普通的琼脂,能更有效地促进双孢放线菌孢子的萌发和气生菌丝的生长。

Suzuk i用此法对从世界各地采集土样进行分离,大部分土样均能分离到双孢放线菌,这表明双孢放线菌在世界范围内广泛分布。

6　结束语

一些学者用荧光显微镜、电子显微镜直接观察活体,或使用DNA探针等方法来检测自然界的活菌体,认为到目前为止,一百多年来人们只分离到自然界实有放线菌的10%～20%(有人甚至估计为0.1%～1%到10%)[20]!换言之,还有至少80%的放线菌人们还

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国外医药抗生素分册2002年1月第23卷第1期

没有分离到纯培养。之所以绝大多数的放线菌未被发现,主要原因是受分离条件和技术的限制。因此放线菌尤其是稀有放线菌的选择分离技术仍然是放线菌生物学研究和资源开发中的重大课题,同时这也是药用微生物筛选工作者在大规模的菌种筛选过程中,为扩大菌种来源所必须解决的现实问题。

随着科学技术的不断进步,开发资源的能力也在增加。另一方面,开发的难度也大大增加。世界各地的新药开发公司或集团寻找新抗生素的研究热潮激发人们去开发研究多种不同的分离方法,以找出特殊的菌种来提高发现新的生理活性物质的机率。为了满足其自动化或半自动化的大量菌种筛选系统,他们必须从世界各地尽可能广泛地采集新的以及不同生态的样品,同时必须尽可能地根据自己的筛选目的来设计新的分离方案。所有这些方法要求尽可能简单,并具有高选择性,以便于能够分离到数量、种类更多而且尽可能不重复的放线菌菌株。

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