高效液相色谱法测定西替利嗪二盐酸口服液和片剂中的西替利嗪、有

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高效液相色谱法测定西替利嗪二盐酸口服液和片剂中的西替利嗪、有关物质

和防腐剂

摘要

建立了一种有效的高效液相色谱法检测市售西替利嗪(CZ)口服液和片剂中西替利嗪和有关物质。此外，该方法也适用于药物制剂中两种防腐剂，即对羟基苯甲酸丙酯(PP)，对羟基苯甲酸丁酯(BP)的测定。色谱分析系统由Hypersil BDS C-18（4.6×250mm，5μm）色谱柱，检测波长230nm，流动相为0.05M的二氢磷酸盐(pH5.5)：乙腈：甲醇：四氢呋喃（12:5:2:1，v/v/v/v）,流速1mL/min。线性曲线范围，西替利嗪200-800μg/mL到1-4μg/mL之间，防腐剂20-100μg/mL，与西替利嗪有关物质1-4μg/mL。CZ的检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.1和0.3μg/mL，CZ有关物质的LOD和LOQ范围分别是0.08-0.26μg/mL和0.28-0.86μg/mL.该方法对CZ和其有关物质的分析经验证专属性强稳定，可供欧洲药典方法系统选择。

关键词：西替利嗪，HPLC，防腐剂，稳定性，杂质

简介

盐酸西替利嗪（CZ）化学名是：（±）-2-[2-[4-[（4-氯苯基）苯甲基]-1-哌嗪基]乙氧基]乙酸二盐酸盐，化学结构如下图所示。CZ是一种长效的、具有稳定肥大细胞活性且无镇定副作用的抗组胺剂。用于缓解包括过敏性鼻炎慢性荨麻疹在内的过敏反应。

原料药CZ用酸碱滴定和HPLC检测。有不同品牌C18柱用于各种制剂处方的CZ的HPLC分析，流动相主要由乙腈和不同pH值的磷酸盐缓冲

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剂组成，检测波长230nm或者254nm。不同剂型中的CZ也可以用其它方法，比如，紫外分光光度法，荧光分光光度法，量热法，离子选择电极法检测。据报道TLC和HPTLC法也分别用于CZ原料药和制剂的检测。

迄今，很少有关CZ有关物质的检测方法的报道。欧洲药典中检测的CZ有关杂质有6个：A、B、C、D、E 、F，见表1。

CZ有关物质的初步测定：采用250×4.6mm色谱柱，填充物为5 μm 硅胶，流动相是稀硫酸：水：乙腈（0.4:6.6:93，v/v/v)混合液，流速1mL/min,检测波长230nm。该方法在应用中由于流动相pH值（<0.5)低，可能导致色谱柱损坏，柱效降低，一般重复使用2-3次就需更换新柱，以保证试验参数的准确性。同时，杂质A和F以及非药典规定的杂质H和I之间有相互干扰。

目前，还有另一种方法可以检测欧洲药典中提到的8种杂质中除杂质C 其它所有杂质的方法。这种方法基于LC/MS技术，由含氰基的色谱柱和电喷雾电离质谱组成，50毫摩尔的醋酸铵溶液（pH7)和乙腈组成的二元梯度洗脱体系。这种使用昂贵的MS检测技术和梯度洗脱体系的方法仅应用于片剂的分析。

因此，本研究旨在建立一个简单的应用等度洗脱系统和常用的紫外检测器的高效液相色谱法，同时测定无论是固体还是液体制剂中CZ及其有关物质的含量。另外，该方法同样适用于检测液体制剂中与其它药物成分在

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一起的两种防腐剂- PP和BP。

试验

2.1.材料和仪器

CZ与CZ有关物质（A-I），PP，BP标准品，Cetolerg片（5，10mg），Cetolerg溶液剂（1和10mg/mL)和赋形剂由Jordanian pHarmaceutical Manu-facturing Company (JPM)提供。Zyretic 片和Zyretic 液从约旦市场购得，其它与HPLC分析相关的化学物质从威百灵公司获得。色谱系统由装有Hypersil BDS C18柱（5μm，4.6×250mm）的HPLC（高效液相色谱仪P1000，紫外检测器1000）构成。

2.2.分析方法

2.2.1.流动相

流动相经脱气过滤，pH值约为5.5。流动相组成为磷酸二氢钾（0.05M）：乙腈：甲醇：四氢呋喃（60：25:10:5,v/v/v/v)。

2.2.2.标准溶液

精密称取50mgCZ，溶入100mL的的流动相中，然后稀释得到CZ的标准储备液。防腐剂的标准储备液用溶解法配制：精密称取40mg的PP和BP放入200mL的流动相中，用流动相稀释5倍。CZ有关物质：准确称取每种杂质对照品各5mg，溶解在200mL的流动相中，稀释10倍。

2.2.

3.药物基质制备

药物基质使用的材料有：PP、BP、丙二醇、丙三醇、冰醋酸、醋酸钠、糖精钠、羟甲基纤维素钠、青梅香精、净化水。当分析防腐剂时，将PP和PB替换成CZ。CZ片的药物基质由混合微晶纤维素、乳糖、硬脂酸镁、欧巴代包衣材料制成。

2.2.4.溶液稳定性和专一性的测定

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用0.1M的HCl、0.1M的NaOH和1％H2O2溶液诱导CZ和防腐剂降解。取250mgCZ，80mgPP，80mgBP分别溶于100mL的3种降解溶液中，在80°C环境下放置10小时。然后每种溶液各取10mL分别用流动相稀释至50mL。

光照对CZ固体和溶液稳定性影响的研究：把CZ的粉末（在培养皿中薄铺一层）和溶液（200μg/mL）分别暴露在低强度紫外光和日光下各65天和2天。

2.2.5.溶液线性范围的测定

精密称取的CZ（20-80mg）用于测定标准溶液的线性，分别溶于100mL 的流动相中，制得标准溶液。然后，稀释，配制1-4μg/mL的系列溶液。CZ有关物质制备：每个组分精密称取5mg，溶解在200mL的流动相中，稀释得到浓度范围1-4μg/mL的溶液。防腐剂溶液的制备：精密称取40mgPP、BP溶解在100mL的流动相中，用流动相稀释为浓度范围是20-100μg/mL 的溶液。

2.2.6.准确度测定

CZ及其有关物质样品制备：将三份25-75mg的CZ和三份浓度为分别0.1-0.4mg的杂质移至三个100mL的容量瓶中，加入50mL的液体药物基质或者1400mg片剂基质，加流动相至刻度线。将含有片剂药物基质的样品超声提取15min，再离心（4000r/min)15min，取上清液用于HPLC进样。

防腐剂样品的制备：分别用200mL流动相溶解3份20-60mg的PP和BP。分别取5mL最终溶液加至25mL的容量瓶中，向每个容量瓶中加入5mL 的液体药物基质，加流动相至量瓶刻度。

2.2.7.精确度，准确性和方法参量的影响

CZ与其有关物质溶液的制备：将精密称取的CZ（50mg/份）及其有关物质（0.25mg/份），移至100mL的量瓶中，加入50mL的药物基质溶液或者1400mg片剂药物基质。加流动相至容量瓶刻度线。

防腐剂溶液的制备：将上面提到的PP和BP标准储备液，取5mL移至25mL的容量瓶中，加入5mL的药物基质溶液，加流动相至刻度线。

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上述溶液也用于研究各种方法的参量的影响以及在周围环境放置24h 的稳定性。

2.2.8.色谱程序和计算

在色谱仪中注射20μL样品溶液，流速1mL/min,检测波长230nm，记录HPLC色谱图。CZ峰的拖尾因子未超过1.5，重复注射，相对标准偏差不超过2.0％。

3.结果与讨论

3.1高效液相色谱法的研究

方法研究期间，通过控制不同的参量，解决了有效分析组分回收率与满意的高效液相系统适用性间关系，使方法在应用中稳定、可靠。这些参量包括：流速（0.5－1.5mL／min），柱温（25－45度），不同类型的C18柱，不同浓度的庚烷磺酸钠离子对（0.5－1.5％），0.05M的磷酸盐缓冲液（pH3－8），各种有机改进剂—不同比例的甲醇－乙腈－四氢呋喃混合液。

试验最初采用反相C18柱和由磷酸缓冲液与乙腈组成的二元流动相。后来发现，UV检测波长为230nm时灵敏度更高，CZ与其有关物质吸收最佳。二元流动相系统对某些CZ有关物质分离度差和回收率低，即使改变流速、柱温或色谱柱也均未见显著改善。由于待测物质极性范围广，建立一个普遍适用的检测所有与CZ有关物质的方法很困难。例如，杂质H和I 洗脱很慢，然而杂质C，F，E洗脱很快。加入离子对以及改变流动相pH 值对分离度也无显著提高。当使用多组分的流动相时，获得了明显改善。试验了不同比例的磷酸盐缓冲液、乙腈和甲醇混合物（60:30:10,60:20:20,40:40:20,45:35:20,50:30:20，ｖ／ｖ／ｖ），除了从CZ 中分离杂质G外，其他组分分离度得到了明显的改善。最后在流动相中加入四氢呋喃，改变磷酸盐缓冲液、乙腈、甲醇和四氢呋喃的比例，当各自的比例为60:25:10:5，v/v/v/v时，达到最佳，杂质G分离度良好，且不影响其他组分的分离度。因此采用该组成流动相，1mL／min流速，230nm检测波长的组合，实现了对CZ，杂质A、C、E、F、G、H、I，以及两种防腐剂PP，BP的分离。尽管在这些最佳的条件下，几种组分得到了良好的分离，

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但是杂质B影响CZ峰，杂质D仍未检测到。测定这两种杂质，须参照欧洲药典的方法进行。

3.2.专一性

将CZ、防腐剂及其有关物质溶于流动相中，以该混合液的高效液相色谱图验证专一性。CZ、PP、BP，杂质A、C、E、F、G、H、I均得到分辨率良好的色谱峰，相对保留时间分别是1.0、1.4、2.7、1.3、0.7、0.8、0.5、1.2、3.9、6.7。只有杂质B和D不能用该方法检测，杂质B峰与CZ峰重叠，杂质D不能被洗脱出来。将药物基质在40°C，相对湿度为75％的条件下储存6个月，与所有的分析组分均没有发生反应，表明了基质的稳定性和无基质干扰的影响。

用0.1M的HCl、0.1M的NaOH或1％H2O2溶液诱导CZ和防腐剂，在80°C环境降解10小时，最终溶液的高效液相色谱图表明：CZ和防腐剂PP，BP均是稳定的（表1）。降解后的高效液相色谱图记录表明：除上文提到的CZ杂质外，CZ和其它降解产物(DP1–DP3)的色谱峰分辨率均良好。这些降解产物也与CZ有关物质、PP、BP显著分离。此外，在色谱图上没有出现任何PP和BP水解降解产物的色谱峰，表明对被分析组分没有影响。此外，该方法也用于检测CZ对光照的稳定性，检测出两个光解物质，其保留时间分别是0.76和0.90。将CZ溶液暴露在阳光下2天，仍有99.5%的CZ检测出来。然而将固体CZ置于紫外光下65天，CZ的效价显著降低，最后只有81.6%的CZ检测出来。

3.3.线性系数和准确度

为了检测CZ、CZ有关物质、防腐剂，在线性浓度范围内测试各自5个浓度溶液，分别为200–800μg/mL,、1–4μg/mL、20–100 μg/mL。表2 中记录了线性回归参数（回归系数、斜率、截距、斜率和截距的95%的置信区间）。曲线的的线性系数大于0.998。

由ACZ及其相关化合物的标准曲线评估LOD和LOQ，它们各自为噪声的3倍和10倍。CZ的LOD和LOQ值分别为0.10 和0.34 μg／mL。然而，CZ相关化合物的LOD和LOQ值范围分别为0.08–0.26μg／mL和0.28－0.86μg／mL（表2）．

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方法准确度的评估采用检测每种分析物线性浓度范围内检测三个浓度水平的溶液，每个浓度水平由三个分析员进行分析。平均回收率、相对标准偏差、偏差范围CZ分别为98.0–99.9、0.9–1.8和?4.0 －0.6；PP和BP 为98.4–98.9、0.9、?2.4 - ?0.2 ；CZ有关物质为92.1–108.3、1.2–7.2和?10.3 －15.5（表3和4）。

3.4.重复性和中间精密度

对于溶液和片剂基质中的CZ、防腐剂、CZ有关物质，短期精度由一个分析员分析6次所得标准偏差表示，CZ、防腐剂、CZ有关物质的相对标准偏差范围分别为0.7-1.2、1.2–2.4和0.7–4.5。中间精密度由两个独立的分析员所做的12次标准偏差分析所决定，CZ、防腐剂、CZ有关物质的总体相对标准偏差范围分别为1.0、1.7–1.8 和1.7–4.4。

3.5.溶液的稳定性

将CZ、防腐剂、CZ有关物质溶解在含有或者不含（标准试剂）药物基质（溶液或片剂基质）的流动相中，在24小时内测定溶液的稳定性。分析新准备的和储存的样品，分析结果见表6上。测得CZ、防腐剂、CZ有关物质浓度的百分偏差分别为-0.8‐0.7，-0.9‐-0.7，0.4‐9.4。表明使用的所有分析溶液，无论是标准品还是药物基质在24小时内均未降解。配制药物基质存在的溶液剂时，CZ（500μg/mL)、防腐剂(每种40μg/mL)、CZ 有关物质(每种2.5μg/mL)的最佳高效液相参量略微改变。参量包括：流动速率、流动相比例、pH、柱寿命(旧或新)、检测波长、过滤系统、超声时间。CZ、防腐剂、CZ有关物质在各种条件下得到的回收率分别在95–101%、93–100% 和88–112%之内（表7）。结果表明，方法参量的微小改变不影响这种方法的分析能力，这种方法是稳定、可行的。

3.6.应用

用该方法检测JPM市售药品和原料药。表8表明片剂中赋形剂的影响不明显。对于JPM液剂产品，这种方法能区分CZ，CZ有关物质和防腐剂（BP和PP）。此外这种方法成功分析了用于Zyertic的两种以上的防腐剂—对羟基苯甲酸甲酯（MP）和苯甲酸钠（NP）。如果标明它们的含量，这两

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种防腐剂也能被定量。由于这两种防腐剂可能影响Zyertic中杂质E和F，采用这种方法检测Zyertic需进行方法优化。

结论

本实验设计了一种新的同时测定液体制剂和片剂中的CZ、防腐剂(PP 和BP)和七个合成杂质的反相高效液相色谱法。欧洲药典中的流动相pH<0.5，导致色谱柱损坏，使用几次后重现性变差，相比之下，本方法是一个很好的选择。同时，由于使用欧洲药典方法时，杂质A、F、H和I分离度低且杂质B和D被其它峰覆盖。而本方法显示出良好的耐用性和选择性，因此，它可以作为分析CZ的稳定方法。所有的统计值（回收率、相对标准偏差、百分百比差异、斜率和截距的置信区间、检测限和定量限）都在允许范围内。由于溶液配方中含有不同比例的干扰物质，比如，着色剂、香味剂、甜味剂和除了BP及PP外的防腐剂，对于含有非本研究辅料的商用液体制剂的检测，应重新进行方法适用性评估。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/g6wq.html