一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件-信息化建设中心-广东轻工 - 图文

一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*

林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静

广东轻工职业技术学院，广州，510300

摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)。通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。 关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件

Study on screening and enzyme-producing conditions of a high

protease producing strain

LING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE

Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing

(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)

Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of protein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 U/mL.

Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition *

基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2012B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201307），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201203）。 第一作者简介：林玩庄（1994.11-），女，研究方向为生物技术。

引言

近年来，我国的水产养殖量和加工量一直居世界首位

[1-2]

。但是，在捕捞和

加工过程中，低值水产品往往占总产量的30%~50%[3-4]。如果这些低值水产品得不到高值化利用，将造成大量蛋白质资源的浪费。随着人们对低值水产品综合利用的重视，蛋白酶及其高产菌种的应用日益增加。为了直接利用高产蛋白酶菌种对低值水产品进行开发高值化产品，本实验主要筛选蛋白酶高产菌种，以及初步研究所得菌种的产酶条件。

1 材料与方法

1.1 筛选材料与试剂

筛选材料：南海海域大型鱼类的肠道组织；酪氨酸：分析纯，市售；Folin试剂及其它试剂：分析纯，市售。 1.2 培养基

富集培养基：葡萄糖 40 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，Na2HPO4 2 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH7.0。分离平板培养基：葡萄糖 10 g/L，酵母膏 5 g/L，脱脂奶粉 10 g/L，NaCl 1 g/L，琼脂 10 g/L，pH7.0。斜面培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，琼脂 10 g/L，pH7.0。种子培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH7.0。基础发酵培养基：葡萄糖 40 g/L，蛋白胨 5 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH7.0。 1.3 富集培养与平板初筛

用组织捣碎器将鱼类肠道组织捣碎，取10 g接入200 mL的富集培养基中，于28 °C、200 rpm的条件下培养16 h。然后，将培养液进行梯度稀释，涂布于分离平板培养基上，于28 °C培养48 h，挑取具有透明圈的菌落，接入斜面培养基，培养24 h，置于4 °C冰箱内保藏，备用。 1.4 摇瓶发酵筛选

将平板初筛所得各菌株的斜面菌种接入种子培养基，于26 °C、150 rpm的条件下培养12 h。然后，按10%的接种量将种子液接入发酵培养基，于28 °C、200 rpm的条件下培养36 h。测定发酵液中的蛋白酶活力，筛选出高产菌株。

1.5 高产菌株的鉴定

采用普通光学显微镜和扫描电镜对菌体形态进行观察，按《Bergy’s Manual of Determinative for Bacteriology》的方法对高产菌株的生理生化特征进行分析[5]，参考文献介绍的16S rDNA鉴定方法对高产菌株进行分子生物学鉴定[6-7]。 1.6 碳源和氮源对产酶的影响

改变基础发酵培养基的碳源和氮源，分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉为唯一碳源，分别以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸铵、尿素为唯一氮源，经36 h摇瓶发酵，测定发酵液中的蛋白酶活力，根据结果选择最佳的碳源和氮源。 1.7 环境条件对产酶的影响

采用最佳的碳源和氮源配置发酵培养基，分别在不同的温度、初始pH和摇瓶转速下进行产酶发酵，测定各种环境条件下的蛋白酶活力，确定最佳的摇瓶发酵条件。

1.8 产酶曲线的分析

在最佳的摇瓶发酵条件下进行产酶发酵，每隔6 h测定发酵液中蛋白酶活性，根据蛋白酶活力变化情况，确定最佳的产酶时间。 1.9 蛋白酶活力的测定

采用GB/T 23527-2009中的Folin法测定发酵液中的蛋白酶活力[8]。样品测定时，调节发酵液pH至7.5，于4°C、10000 rpm下离心去除菌体，以pH7.5的磷酸盐缓冲液对上清液进行适当稀释，取 1 mL稀释液，加入1 mL酪蛋白溶液(10.0 g/L)，于40 °C水浴中反应10 min，再加入1 mL三氯乙酸溶液(65.4 g/L)终止反应，经过滤，取1 mL滤液，加入5 mL碳酸钠溶液(42.4 g/L)和1 mL Folin试剂，混匀，置于40 °C水浴中显色反应20 min，于680 nm波长下测定吸光值。在样品测定前，先配制一系列标准浓度的酪氨酸溶液，取1 mL标准溶液，按上述方法进行显色反应，于680 nm波长下测定吸光值，以酪氨酸浓度为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线的回归方程，计算样品反应液中的酪氨酸生成量，从而确定样品的蛋白酶活力。蛋白酶活力的定义为：在pH7.5和40 °C的条件下，1 min水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸为1个活力单位(U)。

2 结果与讨论

2.1 酪氨酸的标准曲线

酪氨酸的标准曲线如图1所示。其线性回归方程为：y=0.0109 x + 0.0048，相关系数R2为0.9997。

0.7000.600y=0.0109 x + 0.0048R2=0.9997680 nm下的吸光值 0.5000.4000.3000.2000.1000.0000102030405060酪氨酸浓度 (?g/mL)图1 酪氨酸标准曲线 Fig.1 Standard cure of tyrosine

2.2 蛋白酶高产菌株的筛选

通过对富集培养液进行平板分离，共挑取32株在菌落周围具有透明圈的菌株。采用摇瓶发酵方法对各菌株进行复筛，其中蛋白酶活力较高的8株菌株的发酵结果如图2所示。从图2可看出，菌株PE11发酵液中的蛋白酶活力最高，故被选为进一步研究的菌株。

280240200蛋白酶活力 (U/mL)16012080400PE03PE06PE11PE14PE17PE23PE25PE32菌株图2 8株菌的摇瓶发酵筛选结果

Fig.2 Screen result of 8 strains with shake flask fermentation test

2.3 菌种PE11的鉴定

在普通显微镜下，菌种PE11的革兰氏染色阳性。其扫描电镜(×10,000)的摄像如图3所示，菌体呈杆状，大小约为(2.6~4.7) μm × (0.5 ~0.6) μm。通过生理生化试验，结果如表1所示。通过形态特征和生理生化特征的分析，可初步判断菌种PE11为芽孢杆菌属。对菌种PE11的16S rDNA进行PCR扩增，PCR产物经纯化、测序，获得1512 bp的序列，经过在NCBI中对其同源性进行检索，发现菌种PE11与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的许多菌种的同源性达99%。其中，菌种PE11与Bacillus amyloliquefaciens V3 (登录号:KJ123715.1)的亲缘关系最近。采用Neighbor-joining法构建系统发育树，菌种PE11的系统发育树如图4所示。经过16S rDNA分子生物学的分析，菌种PE11被进一步鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

图3 菌种PE11的扫描电镜照片(×10,000)

Fig. 3 SEM photographs of cell morphology of strain PE11 (×10,000)

表1 生理生化试验结果

Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain PE11

试验项目 芽孢染色 氧化酶 接触酶 淀粉水解 明胶液化 酪素水解 甲基红试验 V-P试验 形成吲哚 葡萄糖发酵 柠檬酸利用 硝酸盐还原

反应结果

+ + + + + + + + - + + +

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

68Bacillus amyloliquefaciensBIHB 350 (FJ859694.1)6546Bacillus amyloliquefaciensAb-525 (KJ879953.1)Bacillus amyloliquefaciensZDS-1 (HM372880.1)58Bacillus amyloliquefaciensWY13 (JQ936683.1)95Strain PE1191Bacillus amyloliquefaciensV3 (KJ123715.1)Bacillus amyloliquefaciensD6 (KJ123707.1)90Bacillus amyloliquefaciensSB 3200 (GU191911.1)88Bacillus subtilisMO2 (AY553095.1)Bacillus subtilisJAM A-3-6 (AB542911.1)Bacillus subtilisPR1 (JQ435661.1)69Bacillus subtilisIAM 12118 (NR 112116.1)0.0005

图4 菌种PE11的系统发育树

Fig.4 The sequence phylogenetic analysis of strain PE11

2.4 碳源和氮源对产蛋白酶的影响

分别以不同碳源和氮源配制培养基，发酵结果如图5所示。对于不同碳源，有利于产蛋白酶的顺序为：可溶性淀粉＞乳糖＞蔗糖＞葡萄糖 (见图5A)。张竹慧等研究角蛋白酶产生菌的产酶特性时，同样发现淀粉优于葡萄糖[9]。对于能够利用淀粉等慢速碳源的菌种，慢速碳源的代谢可能更加有利于酶的合成。从图5B可以看出，有机氮源对蛋白酶产生的促进作用强于无机氮源，这可能与有机氮源含有诱导作用的肽链有关。在所用的氮源中，牛肉膏和蛋白胨的促进作用较为明显，其中牛肉膏的促进效果最佳。实验结果与文献中一株枯草芽孢杆菌产蛋白酶的氮源筛选结果相似[10]。

300A250蛋白酶活力 (U/mL)200150100500 葡萄糖蔗糖碳源乳糖可溶性淀粉

300B250蛋白酶活力 (U/mL)200150100500蛋白胨酵母膏牛肉膏氮源硫酸铵尿素图5 碳源和氮源对产蛋白酶的影响 （A：碳源；B：氮源）

Fig.5 Effect of different carbon resource and nitrogen resource on yield of protease

(A: carbon resource; B: nitrogen resource)

2.5 环境条件对产蛋白酶的影响

以可溶性淀粉和牛肉膏配制培养基，分别在不同的温度、初始pH和摇瓶转速下进行发酵，产蛋白酶结果如图6所示。温度对菌种PE11的产蛋白酶有明显的影响(见图6A)，在30 °C下发酵的蛋白酶活力最高。从图6B中可看出，初始pH过高或过低均不利于产酶，在pH为7.0~7.5范围内的产酶效果较好，其中在初始pH为7.0下发酵的蛋白酶活力最高。从文献报道来看，合成蛋白酶的发酵是好氧发酵[11-12]，因而摇瓶转速可间接影响蛋白酶的合成。从图6C中可看出，在摇瓶转速50~200 rpm的范围内，过低的摇瓶转速不能满足菌种对溶氧的需求，产酶效果随转速增加而呈上升的趋势，200 rpm时的蛋白酶活力达到最高。当摇瓶转速增加至一定程度后，继续增加转速并不一定能够增大溶氧，菌体反而因激烈振荡受到一定伤害，这可能是250 rpm时的蛋白酶活力略有下降的原因。因此，摇瓶发酵的最佳环境条件可确定为：温度30 °C、初始pH7.0和转速200 rpm。

400350300A蛋白酶活力 (U/mL)250200150100500242628温度 (?C)3032 400350300B蛋白酶活力 (U/mL)2502001501005006.06.57.0pH 4003503007.58.0C蛋白酶活力 (U/mL)25020015010050050100150转速 (rpm)200250图6 环境条件对产蛋白酶的影响 A：温度；B：初始pH；C：转速

Fig. 6 Effect of fermentation conditions on yield of protease

A: temperature; B: initial pH; C: rotation speed

2.6 最佳条件下的产酶曲线

在最佳发酵条件下，菌种PE11的产蛋白酶时间曲线如图7所示。从图7可

看出，当发酵时间为36 h，发酵液中蛋白酶活力达到最高，此时的蛋白酶活力为376 U/mL。此后，蛋白酶活力随发酵时间延长而呈下降趋势。因此，在本实验条件下，最佳的产蛋白酶时间为36 h。经查阅我国相关文献，在蛋白酶活力的测定方法和酶的活性单位定义的相同情况下，细菌发酵液中的最高蛋白酶活力大多居于100~200 U/mL之间[13-14]，少数居于300~400 U/mL之间[15]。现对于上述文献的报道，菌种PE11具有较强的蛋白酶产生能力。

400350300蛋白酶活力 (U/mL)25020015010050006121824时间 (h)30364248图7 菌株PE11的产酶时间曲线

Fig. 7 Time course of protease-producing of strain PE11

3 结论

以南海海域大型鱼类的肠道组织为筛选材料，本实验筛选获得一株蛋白酶高

产菌种PE11。通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。通过筛选菌株PE11产蛋白酶的碳源和氮源，优选可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源。通过考察环境条件对菌株PE11产蛋白酶的影响，以及分析产酶时间曲线，确定了菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。菌种PE1具有较强的生产应用的潜力，但仍需进一步提高其产酶量，以及研究所产蛋白酶的酶学性质。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/g502.html