生物制品工艺学复习大纲（生技班）

生物制品工艺学2011~2012年度期末复习大纲（生科生技092班）

第二章：菌种选育

1、发酵工业对菌种的要求？

答：1、能在易得、价廉的原料制成的培养基上迅速生长，且代谢产物产量高（目标产物的产量尽可能接近理论转化率）。目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离。

2、可以在要求不高、易于控制的培养条件下迅速生长和发酵；

3、生长速度快，发酵周期较短。发酵周期短的优点在于感染杂菌的机会减少；提高设备的利用率。

4、根据代谢控制要求，选择单产高的营养缺陷型或调节突变株或野生突变株； 5、抗噬菌体能力强，不易被感染；

6、菌种纯粹，遗传性状稳定（不易变异退化），以保证发酵生产和产品质量的稳定性。 7、菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。 2、菌株分离（separation）和筛选（screening）？

答：分离和筛选就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。

3、菌种筛选的方法？

答：利用特殊的分离培养基对大量混杂微生物进行初步分离； 采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。

1、透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。

2、变色圈法：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。

3、生长圈法：生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。

4、抑菌圈法：常用于抗生素产生菌的分离筛选。抑菌圈法是常用的初筛方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。

4、筛选菌种的性能鉴定包括？

答：一般采用两步法，即初筛和复筛，经过多次重复筛选，直到获得1～3株较好的菌株，供发酵条件的摸索和生产试验，进而作为育种的出发菌株。 5、工业菌种的育种：

答:工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。 6、工业菌种育种的方法

答：1诱变，2基因转移，3基因重组。 7、诱变育种步骤 答：（1）出发菌株的选择 （2）处理菌悬液的制备 （3）诱变处理 （4）中间培养 （5）分离和筛选

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8、菌种保藏的方法有那些？

答：冷冻保藏（液氮-196或低温冰箱-70） 干燥保藏（沙土管保藏，冷冻真空保藏） 低温保藏（4℃短时间） 传代保藏 悬液保藏发

对于重要的菌种，应该选用不同的保藏方法保藏，以避免菌种丢失，其主要保藏原理降低微生物的代谢水平或使其处于休克状态，所以低温，少水环境均可或者两者兼用. 9、菌种的复壮？

答：狭义的复壮:是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和 测定生产性能等方法，

从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，以达到恢复该菌原有性状的一种措施；

广义的复壮:指在菌种的生产性能尚未衰退前，有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。 10、种子扩大培养？ 答：种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。

种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。

11、发酵过程的主要控制参数有哪些?

答：发酵控制参数

因不同的发酵过程、发酵工艺、技术指标和发酵产物等要求不同而不同，主要有以下几点： 一般的耗氧型发酵罐系统，要测量的参数可以分为物理参数、化学参数以及生物参数 发酵过程物理参数:通常有发酵罐温度（T）、发酵罐压力（P）、发酵液体积（V）、空气流量（FA）、冷却水进出口温度（T1?和T?2）、搅拌马达转速（RMP）、搅拌马达电流（I）、泡沫高度（H）等，这些物理参数根据不同种类的发酵要求，都可以选择性的选取有关测量仪表来实现自动测量。

发酵过程化学参数:发酵过程典型的化学参数有PH值（PH）和溶解氧浓度（DO），这两个参数对于微生物的生长，代谢产物的形成极为重要。过于由于缺乏耐消毒的能进行无菌操作的PH电极和溶解氧电极，使得无法做到实时的在线测量。而现在已有成熟的PH和溶解氧测量电极，典型的产品如瑞士的Ingold电极等。

发酵过程生物参数:生物参数通常包括生物质呼吸代谢参数、生物质浓度、代谢产物浓度、底物浓度以及生物比生长速率、底物消耗速率和产物形成速率等。

关于生物参数，无论在国内还是国外，在工业生产中实时在线的测量仪表都还很少。正是由于这些原因，使得微生物发酵过程的控制比一般的工业生产过程难度更大。 12、调节溶氧速率的方法？

答：影响体积溶氧速率（kLa）的因素有：

①设备参数如设备结构尺寸、搅拌器直径； ②操作参数如搅拌转速、通风量； ③发酵液性质，如流变学性质。 提高kLa或Nv的措施有：

① 提高转速N，以提高Pg，从而提高kLa。

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② 增大通风量Q。当Q不大时，增大Q可明显提高kLa；但当Q已较大时，继续提高Q，将降低Pg，其综合效果不会明显提高kLa，甚至可能降低，因此有些调节措施是将提高转速N和增大通风量Q二者结合。

③ 为了提高Nv，除了提高kLa之外，提高C*也是可行的方法之一。通入纯氧或在可行的条件下提高罐内操作压力，均可提高C*。

④ 丝状菌的生长导致发酵液粘度的急剧上升和kLa的急剧下降。过分提高转速和通气量可能导致菌丝体的机械破坏和液泛。在此情况下可重复地放出一部分发酵液，补充新鲜灭菌的等体积培养基，这样可使kLa大幅度回升。 ⑤ 向发酵液中添加少量氧载体，可提高kLa。

第三章：发酵工艺条件的确定

1、培养基： 答：培养基：人工配制的供微生物生长、繁殖、代谢和合成人们所需产物的营养物质和原料，同时，培养基也为微生物提供除营养外的其它生长所必须的环境条件。 2、培养基是如何分类的？ 答：（1）按培养基组成物质的化学成分分为：合成培养基、天然培养基。 （2）按物理性质分为：固体，液体

（3）按用途分为：选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基等 3、发酵生产中的培养基类型 ？

答：工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用分为： （1）斜面培养基（2）种子培养基（3）发酵培养基 4、简述种子培养基的目的及其特点？

答：培养种子的目的：1、扩大培养，增加细胞数量；2、同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。 种子培养基特点：

（1） 必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。

（2）种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。

（3）种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。 5、前体物质 答：前体物质：是指当添加到发酵培养基中的某些化学物质基本上不改变其分子结构而直接进入产物中的小分子物质，从而在一定条件下控制产物的合成方向和提高产量。 6、培养基的组成物质有那些？ 答：（1）碳素化合物 （2）氮素化合物 （3）水

（4）微量元素(无机盐类) （5）生长因子

7、有机氮源和无机氮源有哪些？

答：有机氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。 无机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水等。 8、培养基中微量元素的主要作用是什么？

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答：微量元素(无机盐类)是微生物生命活动所不可缺少的物质。主要作用是： ①构成菌体成分；

②作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性； ③调节渗透压、pH值、氧化还原电位等； ④作为自养菌的能源。 9、生长因子：

答：广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子(又称生长素)，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；狭义说，生长素仅指维生素。其作用是构成细胞的组分，促进生命活动的正常进行。

第四章：发酵工厂灭菌与空气净化

1、发酵工业中灭菌和消毒常用范围 答：（1）为保证纯种培养，在生产菌种接种培养之前，要对培养基、空气系统、消泡剂、流加物料、设备、管道进行灭菌；

（2）还在对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。 2、除菌的方法 答：（1）培养基的加热灭菌（包括常压或蒸汽高压加热法） （2）空气的过滤除菌 （3）紫外线或电离辐射 （4）化学药物灭菌

3、介质过滤除菌及常用的过滤介质？ 答：（1）介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达到除菌的目的。

（2）过滤介质一般是棉花、活性炭，也有采用玻璃纤维、焦炭等。 4、用工艺流程图表述发酵生产中制备无菌空气的过程？ 答：发酵生产中制备无菌空气的大致过程：

5、简述纤维介质阻留微粒的机制？

答：1．阻拦截留：微粒随空气气流向前运动，当气流为层流时，随气流运动的粒子在接近纤维表面的部分由于与过滤介质接触而被纤维吸附捕集，这种作用称之为阻拦截留。

空气流速愈小，纤维直径愈细，阻拦截留作用愈大。但是在介质过滤的除尘除菌中，阻拦截留并不起主要作用。 2．惯性碰撞截留：

空气气流流速大时，气流中的微粒具有较大的惯性力。

当微粒随气流以一定速度向纤维垂直运动因受纤维阻挡而急剧改变运动方向时，由于微

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粒具有的惯性作用使它们仍然沿原来方向前进碰撞到纤维表面，产生摩擦粘附而使微粒被截留在纤维表面，这种作用称惯性碰撞截留。

截留区域的大小决定于微粒运动的惯性力，所以，气流速度愈大，惯性力大，截留效果也愈好。此外，惯性碰撞截面作用也与纤维直径有关，纤维愈细，捕集效果愈好。惯性碰撞截面在介质除尘中起主要作用。

3．布朗扩散运动：直径小于1μ的微粒在运动中往往产生一种不规则的布朗运动，使微粒间相互凝集成较大的粒子，从而发生重力沉降或被介质截留。但是这种作用只有在气流速度较低时才较显著。

第五章：发酵过程的工艺控制

1、发酵工业中微生物的培养方式有哪几种？

答：一般来说，微生物学的生长和培养方式可以分为： 1、分批培养 2、连续培养 3、补料分批培养 2、分批培养？

答：又称分批发酵，是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。 3、补料分批培养

答：所谓分批补料培养技术，就是指在分批培养伊始，投入较低浓度的底物，然后在发酵过程中，当微生物开始消耗底物后，再以某种方式向培养系统中补加一定的物料，使培养基中的底物浓度在较长时间内保持在一定范围内，以维持微生物的生长和产物的形成，并避免不利因素的产生，从而达到提高容积产量、产物浓度和产物得率的目的。 4、连续培养

答：连续培养又称连续发酵，指在分批式液体深层培养至微生物对数后期时，以一定的流速向发酵罐中连续添加灭菌的新鲜液体培养基，同时以相同的流速自发酵罐中排出发酵液的发酵方法。

5、发酵热概念？ 答：所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。什么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。发酵热包括了生物热、搅拌热、蒸发热以及辐射热

6、引起发酵液pH上升或者下降的因素有那些？ 答：（1）引起pH下降的因素：

1培养基中碳氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加 ○

之溶解氧不足，致使有机酸大量积累。

2消泡油加的过多。 ○

3生理酸性物质的存在，氨被利用，pH下降。 ○

（2）引起pH上升的因素：

1培养基中碳氮比例不当，氮源过多，氨基氮释放，使pH上升。 ○

2生理碱性物质的存在。 ○

3中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过多使pH上升。 ○

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7、pH值调节和控制的方法有哪些？ 答：（1）调节培养基的原始pH值，或加缓冲溶液（如磷酸盐）制成缓冲能力强、pH值变化不大的培养基，或使盐类和碳源的配比平衡。

（2）可在发酵过程中加入弱酸或弱碱进行pH值的调节，进而合理地控制发酵条件；也可通过调整通风量控pH值。

（3）采用生理酸性铵盐作为氮源时，由于NH+4被微生物细胞利用后，剩下的酸根会引起发酵液pH值的下降，在培养液中可加入碳酸钙来调节pH值。但是需要注意的是，碳酸钙的加入量一般都很大，在操作上很容易引起染菌。因此，此方法在发酵过程中应用不是太广 。 （4）在发酵过程中根据pH值的变化可用流加氨水的方法来调节，同时又可把氨水作为氮源供给。由于氨水作用快，对发酵液的pH值波动影响大，应采用少量多次的流加方法进行流加，以免造成pH值过高，从而抑制微生物细胞的生长，或pH值过低，NH+4不足等现象。具体的流加方法应根据微生物的特性、发酵过程的菌体生长情况、耗糖情况等来决定，一般控制在pH值7.0-8.0，最好是采用自动控制连续流加方法 。

（5）如果仅用酸或碱调节pH值不能改善发酵情况时，进行补料是一个较好的办法，它既调节了培养液的pH值，又可补充营养，增加培养液的浓度和减少阻遏作用，进一步提高发酵产物的产率。

（6）以尿素作为氮源进行流加调节pH值，是目前国内味精厂普遍采用的方法。尿素流加引起的pH值变化有一定的规律性，易于控制操作。由于通风、搅拌和微生物细胞内脲、酶的作用使尿素分解放出氨，使pH值上升；氨被微生物利用和形成代谢产物，使pH值降低，再次反复进行流加就可维持一定的pH值。流加时除主要根据pH值的变化外，还应考虑到微生物细胞的生长、发酵过程耗糖、代谢等不同的阶段采取少量多次流加，以控制合适的发酵pH值 。

8、说说过多的持久性泡沫会给发酵带来哪些不利影响？ 答：1、使发酵罐的装填系数减少； 2、造成逃液，导致产物的损失；

3、泡沫“顶罐”有可能使培养基从搅拌的轴封渗出，增加了染菌的机会； 4、由于泡沫的液位变动，以及不同生长周期微生物随泡沫漂浮或粘附在罐盖或罐壁上，命使微生物生长的环境发生了改变，影响了微生物群体的效果，增加微生物群体的非均一性； 5、影响通气搅拌的正常进行（影响氧的传递），妨碍了微生物的呼吸，造成发酵异常，导致最终产物产量下降；

6、使微生物菌体提早自溶，这一过程的发展又会促使更多的泡沫生成；

7、为了将泡沫控制在一定范围内，就需加入消泡剂，将会对发酵工艺和产物的提取带来困难。

9、化学消泡的原理？

答：1、化学消泡剂是表面活性剂，消泡剂本身的表面张力相对于发酵液来说是比较低的，一旦接触到气泡的表面，将会使气泡膜局部的表面张力降低，力的平衡受到破坏，因而使气泡破裂或合并，最后导致泡沫破裂。

2、当泡沫表面层存在着极性的表面活性物质而形成双电层时，加入带相反电荷的表面活性剂，可以降低膜的弹性（机械强度），或加入某些具有强极性的物质与起泡剂争夺液膜上的空间，并使液膜的机械强度降低，进而促使泡沫破裂。

3、当泡沫的液膜具有较大的表面黏度时，加入某些分子内聚力较弱的物质，可降低膜的表面黏度，从而促使液膜的液体流失而使泡沫破裂。 10、发酵过程中常用的化学消泡剂主要有哪些？ 答：天然油脂：玉米油、豆油、棉籽油等。

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聚醚类：聚氧丙烯甘油（GP）、聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE）。它们以一定的比例配制的消泡剂称泡敌。

高级醇和酯类：十八醇、聚二醇等。 硅酮类：最常用的是聚二甲基硅氧烷，也称二甲基硅油。它表面能低，表面张力也较低，在水及一般油中的溶解度低且活性高

第六章：微生物的代谢调节

1、微生物代谢产物类型及其定义？ 答：（1）根据菌体生长、繁殖的关系将合成代谢产物分为初级代谢产物和次级代谢产物。 （2）初级代谢产物：微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动必需的物质和能量。如蛋白质、核酸等。 次级代谢产物是指由微生物产生的，与微生物生长、繁殖无关的一类物质。抗生素、激素、生物碱、色素、毒素等是与初级代谢产物(如氨基酸、核酸)相对产生的次级代谢产物。

第七章：有机酸发酵

1、柠檬酸、乳酸、核酸、氨基酸、抗生素的主要生产菌种 答：柠檬酸的生产菌种： 黑曲霉（ Aspergillus niger ）。 乳酸的生产菌种：德氏乳杆菌是乳酸生产常用乳酸菌。

核酸的生产菌种：发酵法生产核酸的产生菌主要有：枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、产氨短杆菌及其变异株。 氨基酸的生产菌种：

谷氨酸生产菌主要是：棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。 赖氨酸生产菌主要是：黄色短杆菌，乳糖发酵短杆菌，谷氨酸棒杆菌。

抗生素的生产菌种：

国内的青霉素的生成菌种分为：丝状菌（黄孢子丝状菌、绿孢子丝状菌）;球状菌（白孢子球状菌、绿孢子球状菌）。我国生产上采用的是绿色丝状菌。 链霉素的产生菌是灰色链霉菌、比基尼链霉菌、灰肉链霉菌。 四环素的产生菌是金色链霉菌、龟裂链霉菌。 2、柠檬酸的生物合成途径？

答：葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。 3、简述黑曲霉中柠檬酸的积累机制主要概括为哪些方面？

答：(1) 由于严格限制供给锰离子等金属离子,或筛选耐高浓度锰离子、锌离子、铁离于等金属离子的菌株,降低菌体中糖代谢转向合成蛋白质、脂肪酸、核酸的能力,使细胞中形成高 水平的铵离子,从而解除柠檬酸和ATP 对PFK酶的反馈抑制,使EMP 的代谢流增大。

(2) 黑曲霉中存在一条呼吸活动性强的侧系呼吸链,对氧敏感,但不产生ATP ,这样使细胞内的ATP 浓度下降。因而减轻了ATP 对PFK、CS 的反馈抑制,促进了EMP 的畅通,增加柠檬酸的生物合成。

(3) 丙酮酸羧化酶是组成性酶,不受代谢调节控制,可源源不断地提供草酰乙酸,丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA 和CO2固定反应取得平衡,保证前体物乙酰CoA 和草酰乙酸的提供, 柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱,增强了柠檬酸的合成能力。

(4)α- 酮戊二酸脱氢酶是受葡萄糖和铵离子的阻遏,使黑曲霉中的TCA 变成“马蹄形”

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的代谢方式,减弱TCA ,降低细胞内ATP 浓度,另外使α- 酮戊二酸浓度升高。反过来,又反 馈抑制异柠檬酸脱氢酶,降低柠檬酸的自身分解。

(5) 顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸∶顺乌头酸∶异柠檬酸= 90∶3∶7 的平衡,顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸,即柠檬酸分解活力低。一旦柠檬酸浓度升高到某 一水平,就抑制异柠檬酸脱氢酶活力,从而进一步促进柠檬酸自身积累,使pH 降至2. 0 以下。此时,顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活,更有利于柠檬酸积累并排出体外。 4、简述柠檬酸发酵的主要控制点？ 答：柠檬酸发酵三个主要控制点：

（1）EMP畅通无阻 ：控制Mn2+ ，提高NH4+ ，解除柠檬酸对PFK的抑制。控制溶氧，防止侧系呼吸链失活。

（2）通过CO2固定反应生成C4二羧酸，强化这一反应。 （3）：柠檬酸后序的酶的酶活性丧失或很低，控制培养基中的Fe2+ 的浓度 5、简述糖蜜的预处理方法？

答：糖蜜预处理：生产上主要采用黄血盐法和石灰硫酸法， 目的是去除金属离子和部分蛋白质。

处理方法如下：

黄血盐处理法：糖蜜稀释至400Bx，加入糖蜜质量0.1-0.45%的黄血盐，升温至95℃，维持30min，打入澄清罐，4h后吸取上清液，配制发酵液。

石灰硫酸法：糖蜜稀释至400Bx，加入生石灰，糖蜜质量的1％，调pH至9－10，在70－80℃通风搅拌15min，然后用硫酸调pH至3－4.5，静止4h吸取上清液，配制发酵液。 6、简述柠檬酸发酵的糖质原料有哪些？ 答：糖质原料包括：

薯类：甘薯、薯干、木薯、木薯干、马铃薯、薯渣。 谷类：玉米、小麦、面粉、大米。 淀粉：谷类与薯类加工的淀粉。 砂糖：白砂糖、赤砂糖、糖蜜。

淀粉糖：淀粉水解糖(单糖、双糖、糊精、葡萄糖母液)

果实、粮食加工下脚料：各种含糖果实、糖食加工的下脚料等。 7、淀粉的液化及方法？

答：液化：利用化学或生物催化剂，在具有一定量的水和一定的温度条件下，使淀粉分子断裂而变成较小分子，使淀粉糊的粘度显著下降而成为流动性较好的流体的过程。 主要有酸法和酶法。

8、试述淀粉两次加酶喷射液化工艺过程（包括工艺流程及操作说明）？ 答：工艺流程：

调浆------配料-----一次喷射液化-----液化保温------二次喷射------高温维持------二次 液化------冷却------（糖化） 操作说明：在配料罐内，将淀粉加水调浆成淀粉乳，用Na2CO3调pH，使pH值处在5.0-7.0之间，加入0.15%的氯化钙作为淀粉酶的保护剂和激活剂，最后加入耐高温α-淀粉酶，料液经搅拌均匀后用泵打入喷射液化器，在喷射器中出来的料液和高温蒸汽直接接触，料液在很短时间内升温至95-97℃，此后料液进入保温罐保温60min，温度维持在95-97℃，然后进行二次喷射，在第二只喷射器内料液和蒸汽直接接触，使温度迅速升至145℃以上，并在维持罐内维持该温度3-5min左右，彻底杀死耐高温α-淀粉酶，然后料液经真空闪急冷却系统进入二次液化罐，将温度降低到95-97℃，在二次液化罐内加入耐高温α-淀粉酶，液化约30min，用碘呈色试验合格后，结束液化。

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9、同型乳酸发酵和异型乳酸发酵的概念？

答：同型发酵是葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的催化下还原为乳酸的过程。理论转化率为100%，实际转化率80%以上。

异型发酵是某些乳酸细菌利用HMP途径，分解葡萄糖为5-磷酸核酮糖，再经差向异构酶作用变成5-磷酸木酮糖，然后经磷酸酮解酶催化裂解，生成3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸。 3-磷酸甘油醛经EMP途径后半部分转化为乳酸。理论转化率为50%。 8、代谢控制发酵？

答：用人工诱变的方法有目的地改变微生物固有的调节机制，使合成产物的途径畅通无阻，最大限度地积累特定产物，这种发酵称为代谢控制发酵。 9、简述谷氨酸发酵中控制细胞渗透性采用的方法和机理？ 答：（1）化学控制法

①控制磷脂的合成，导致形成磷脂合成不足的不完整的细胞膜。

a、生物素缺陷型：使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，控制生物素亚适量。 b、油酸缺陷型：使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，控制油酸亚适量； c、甘油缺陷型：使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，控制甘油亚适量； d、添加表面活性剂（如吐温60）或饱和脂肪酸（C16~C18）：使用生物素过量的糖蜜原料发酵生产谷氨酸时，通过添加表面活性剂或饱和脂肪酸及其亲水聚合脂类，也能清除渗透，积

累谷氨酸。

②阻碍谷氨酸菌细胞壁的合成，形成不完全的细胞壁，进而导致形成不完全的细胞膜。 如在发酵对数生长期的早期，添加青霉素或头孢霉素C 等抗生素。 （2）物理控制方法

利用温度敏感型突变株进行谷氨酸发酵时，由于仅控制温度就能实现谷氨酸生产，故称物理控制方法。该法必须要控制好温度转换的时间（由30℃提高到37℃或40℃的时间）；并且要在温度转换之后，再进行适度的剩余生长。 10、谷氨酸高产菌模型特征

答：1、丧失或有微弱的?-酮戊二酸脱氢酶活力，使?-酮戊二酸不能继续氧化；

2、CO2固定能力强，使四碳二羧酸全部由CO2固定反应提供，而不走乙醛酸循环； 3、谷氨酸脱氢酶的活力很强，并丧失谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制和反馈阻遏，同时，NADPH2再氧化能力弱，这会使?-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻；

4、有过量的NH4+ 存在，?-酮戊二酸经氧化还原共轭氨基化反应而生成谷氨酸却不形成蛋白质，从而分泌泄漏于菌体外；

5、同时，谷氨酸生产菌应不利用体外的谷氨酸，使谷氨酸成为最终产物。

6、生产菌株还应该具有生物素合成缺陷、油酸合成缺陷和甘油合成缺陷等特点。 11、简述谷氨酸发酵过程中泡沫的形成及消除泡沫的方法？ 答：（1）泡沫的形成和性质： 搅拌与通风

发酵液中含有蛋白胨、玉米浆、黄豆粉是主要的发泡剂。 发酵液感染杂菌和噬菌体 （2）泡沫的消除（控制）：

调整培养基的成分（少加或缓加宜起泡的原材料）；改变某些物理化学参数（pH、温度、通气和搅拌；改变发酵工艺 采用机械消泡或消泡剂消泡

机械消泡：利用机械振动或压力变化使泡沫破裂

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消泡剂：属表面活性剂，天然油脂（豆油、玉米油）；脂肪酸和酯类；聚醚类（氧化丙烯和氧化乙烯与甘油的聚合物）；硅酮类

12、论述谷氨酸发酵中杂菌污染的主要原因有哪些？如何防治？ 答：杂菌污染的主要原因分析：

①种子带菌。若发酵前期染菌，可能是种子带菌所致或发酵罐本身染菌所致。为了避免种子染菌，在斜面种子、摇瓶种子制备过程中都必须严格操作，确保无杂菌污染。

②罐体与管件渗漏所引起的染菌。若罐体或管件有极其微小的漏孔时，易引起染菌。有时漏孔用肉眼直接察觉不到，需要通过一定的试漏方法才能发现。

③死角。罐或管路连接处的死角，在灭菌时其中的杂菌不易被杀死，易造成连续染菌，影响生产。

④空气系统染菌。好气性发酵需连续不断地通人大量无菌空气。空气系统所有的设备要定时打开排液阀排液，避免设备内积液太多，带入空气中去，造成染菌。

⑤环境污秽造成染菌。车间、环境卫生差，易引起染菌。为堵绝杂菌的来源和繁殖机会，必须加强车间和环境的清洁卫生工作。 杂菌污染的防治与挽救：

污染了杂菌后，要根据具体情况，及时采取措施加以挽救。具体措施为： (1)一级种子经平板检查确认无菌后，方可接入二级种子中。

(2)二级种子冷却，小于10℃保压12～16h，平板检验确认无杂菌后，再接入发酵罐。 (3)发酵0~6h后，大幅度染菌，镜检发现球菌，应放罐重消毒，消毒温度适当降低。 (4)发酵12h后，发现污染有少量芽孢或杆菌，但光密度尚正常，pH仍有升降，耗糖一般，谷氨酸产量在0.2％以上，则可加大通风量，按常规发酵到底。 (5)发酵后期确认染球菌，则可加热至70—80℃放罐。

(6)发现染菌的罐，下次空罐消毒加入甲醛后，再用蒸汽熏蒸0.12~0.17L／m3。 (7)加强车间卫生管理，防止活菌体飞扬。 (8)选用抗药性菌种。

13、简述赖氨酸的代谢控制发酵的方法？（p70）

答：1）切断或减弱支路代谢，选育高丝氨酸缺陷型（Hom－）突变株，切断通向苏氨酸和甲硫氨酸的代谢流，限量供给高丝氨酸（或苏氨酸+甲硫氨酸)，解除赖氨酸和苏氨酸的协调反馈抑制作用，因而能够过量积累赖氨酸。或选育蛋氨酸和苏氨酸或异亮氨酸缺陷型（Met－ + Thr－、Ile－）突变株；

2）选育结构类似物抗性突变株：解除Thr和Lys的协同反馈抑制作用，使赖氨酸大量积累，如：

①S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸抗性株（AECr） ②L-赖氨酸氧肟酸盐抗性株（LysHxr）

③苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株（ThrHxr）等； 3）解除代谢互锁

在乳糖发酵短杆菌中，Lys的生物合成与亮氨酸（Leu）之 间存在着“代谢互锁”，即赖氨酸分支途径的初始酶二氢吡 啶-2,6-二羧酸（DDP）合成酶受Leu的反馈阻遏。

4） 增加前体物的合成和阻塞副产物生成：为了提高赖氨酸的产量，应设法增加前体物质天门冬氨酸（Lys前体物）的浓度，切断生成丙酮酸的支路，同时解除Asp对PEP羧化酶（即PC）的反馈抑制.。

方法：⑴选择丙氨酸缺陷型菌株（Ala－）；或温度敏感突变株（tmps），中断丙酮酸到Ala的反应；选育AspHxr、磺胺类药物抗性突变株；

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⑵选育抗天冬氨酸结构类似物突变株；

⑶选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比的菌株。

5） 其它措施：选育温度敏感突变株：如，乳糖发酵短杆菌 AJ11093 、AJ1099。

在发酵前期于29～33℃生长良好，而到34 ℃以上时则不能生长，发酵积累赖氨酸盐酸盐。 添加丰富的生物素，既可以使Glu不排出体外，并使代谢流转向Lys的合成，又能提高PEP羧化酶（ PC ）的活性，促使PEP生成草酰乙酸，再生成Asp。 15、离子交换法提取赖氨酸的工艺流程及要点说明？ 答：（1）工艺流程：

（2）要点说明：

1）发酵液的处理：菌体分离，两种方法

离心分离法：高速离心机分离除去菌体（国外方法），用碟片式自动卸渣高速离心机，分离菌体和草酸钙等

添加絮凝剂沉淀法：用草酸除去发酵液中的Ca2+ ，调节pH至2～3，加入絮凝剂（如聚丙烯酰胺），使菌体聚集而沉淀。然后加助滤剂过滤即可除去菌体。

2）离子交换吸附及洗脱：铵型阳离子交换树脂，洗脱剂为氨水加氯 化铵；用茚三酮检查流出液，pH9.5～12，得率可达90%～95%

3）真空浓缩：去除氨，并提高Lys含量，真空时温度65℃，浓度22～ 23°Bé 4）中和结晶：加入工业盐酸，搅拌，pH5.2，自然冷却结晶，至5℃结晶完全（粗结晶，含一分子结晶水的粗L-Lys盐酸盐）

5）重结晶：用蒸馏水溶解，11-12°Bé，加入活性炭脱色，压滤，再真空浓缩至22°Bé，再结晶、冷却、离心分离并水洗

6）干燥：60℃热风干燥，去结晶水，得到L-Lys盐酸盐，含水0.1%以下

第九章：核酸的发酵生产

1、IMP发酵生产菌种应具备的条件： 答：IMP发酵应具备的条件：

选择肌苷酸酶弱或丧失的出发菌株（不分解肌苷酸）; 切断IMP向下的两条支路，使IMP大量生成和积累；

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选育结构类似物双重抗性突变株；

限量添加Mn2+，解除细胞膜渗透型障碍。

2、从鸟甘酸的生物合成途径及其调节机制分析，要积累鸟苷，应使鸟苷生产菌（枯草芽孢 杆菌）具备哪些条件？（p107）

答：(1)枯草芽孢杆菌具有GMP的环形支路：

菌株因丧失SAMP合成酶（Ade－）活性，切断从IMP到AMP的通路，使生成的IMP全部转向合成GMP，同时丧失GMP还原酶活性，使生成的GMP不致还原为IMP。 (2)为了积累鸟苷，核苷酶或核苷磷酸化酶等鸟苷分解酶的活性必须微弱； (3)鸟苷酸（GMP）是嘌呤核苷酸全合成的终产物，为了积累鸟苷，必须解除GMP对PRPP转胺酰酶，IMP脱氢酶及GMP合成酶等的反馈抑制与阻遏。（封闭基因或选择渗漏）

(4)为了抑制肌苷产生，高效率积累鸟苷，由IMP脱氢酶及GMP合成酶所催化的反应应该比核苷酸酶（IMP---IR)所催化的反应优先进行。 3、离子交换树脂法提取肌苷酸的工艺流程及说明？ 答：（1）工艺流程：

（2）提取工艺说明： 1过滤、○酸化：发酵液加活性白土（15g/L)，压滤除菌体，清液加1.5倍体积的0.1mol/LHCl。 2阳离子交换： 732#（H＋）型树脂，上柱液体积为湿树脂体积的6倍。流出液用NaOH○

溶液调pH8.5-9.5。

3阴离子交换：上柱液体积为湿树脂体积的6倍，90％肌苷酸被吸附。 ○

4洗脱：○先用水冲洗柱子，再用0.05mol/LHCl洗涤至流出液pH为3.5；然后用含0.05mol/LHCl和0.05mol/LNaCl混合液进行洗脱。收集肌苷酸流出液。

5减压浓缩：将洗脱液用40％NaOH调pH至7.5，减压浓缩15－20倍体积。 ○

6结晶：浓缩液加入2倍体积的95％乙醇，低温育晶，析出肌苷酸粗品。 ○

7重结晶：肌苷酸粗品加水溶解，加乙醇低温结晶，过滤，晶体用30％乙醇洗涤2－3次 ○

肌苷酸精品：湿肌苷酸晶体烘干，制得肌苷酸精品。

第十章：抗生素

1、抗生素？

答：抗生素是生物在其生命活动过程中所产生的，或经其他方法（生物化学或半合成）衍生获得的，在低浓度下，具有选择性地抑制或杀灭它种生物生命活动的的一类化学物质。

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2、简述抗生素的作用机制有哪几类？ 答：1．抑制细胞壁合成的抗生素； 2．影响细胞膜功能的抗生素； 3．抑制核酸合成的抗生素； 4．抑制蛋白质合成的抗生素； 5．抑制生物能作用的抗生素。

3、抗生素的发酵培养基主要有哪些物质构成？

答：在抗生素发酵生产中，由于各菌种的生理生化特征不一样，采用的工艺不同，所需的培养基组成亦各异。即使是同一菌种在种子培养阶段和不同发酵时期，其营养要求也不完全一样。因此，需根据其不同要求选用培养基的成分与配比。其主要成分也包括碳源、氮源、无机盐类、微量元素、生长因子和前体。 4、热原？

答：热原：是在生产过程中由于被污染后由杂菌所产生的一种内毒素。热原注入体内引起恶寒高热，严重的引起休克。 5、前体？ 答：能被微生物直接利用，以构成次级代谢产物结构的一部分，而其本身结构没有大的变化，这种物质称为前体。

6、青霉素和头孢菌素合成的代谢调控？ 答：青霉素和头孢菌素合成的代谢调控： （1）碳源分解代谢物阻遏 ：快速利用的碳源利于菌体生长，阻遏次级代谢产物酶系的合成。慢速利用的碳源则有利于青霉素的合成。

（2）赖氨酸的反馈调节 ：赖氨酸是α-氨基己二酸的初级代谢终产物，分支的次级代谢产物是青霉素G或头孢菌素C。所以它是合成青霉素和赖氨酸的共同前体。赖氨酸过量反馈抑制高柠檬酸合成酶，使α-氨基己二酸合成减少，青霉素的合成受到影响。 （3）L－甲硫氨酸（调节物）对头孢菌素C形成的促进作用

（4）在头孢菌素C的合成过程中，扩环和羟化是其中的关键反应和限速阶段

（5）缬氨酸是青霉素生物合成的前体物 ：过量的缬氨酸会反馈抑制乙酰乳酸合成酶活性。通过诱变选育获得产黄青霉突变株，其L－缬氨酸对乙酰乳酸合成酶的反馈抑制比亲株小得多，从而使细胞内积累较多的缬氨酸，青霉素产量大幅度提高。 7、青霉素发酵中造成异常溶氧可能原因？ 答：异常溶氧可能原因：

（1）染菌：溶氧迅速下降，镜检。

（2）染噬菌体：溶氧上升，C下降，发酵液迅速转稀，应及早处理，严防扩大； （3）代谢异常：可能是有机酸大量积累，溶氧不足引起泡沫： 8、青霉素提炼工艺中采用了哪些单元操作，为什么？ 答：（1）、青霉素提炼工艺流程图：

（2）、青霉素提炼工艺流说明：

A、预处理 ：目的在于浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。

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措施：加少量絮凝剂沉淀蛋白。 B、过滤:去除蛋白、菌体及其它杂质 C、萃取 D、脱色

萃取液中添加活性炭，除去色素、热源，过滤，除去活性炭。在提取液中加活性炭150-300g/10亿单位 E、结晶

直接结晶：在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸钠－乙醇溶液反应，得到结晶钠盐。加醋酸钾－乙醇溶液，得到青霉素钾盐。

共沸蒸馏结晶：萃取液，用0.5 M NaOH萃取得pH6.4-6.8钠盐水浓缩液。加2.5倍体积丁醇，16－26℃，0.67-1.3KPa下真空蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。蒸出馏分中含水达2-4%时，停止蒸馏。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤（丁醇4-6L/10亿）、干燥后，得到青霉素产品。

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