年产3吨中性淀粉酶发酵工艺设计

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中性淀粉酶的作用推荐度：
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年产3吨中性淀粉酶发酵工艺设计

前言

淀粉酶属于水解酶类，是水解淀粉和糖原的酶类总称。通常通过淀粉酶

催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退

浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。此类

酶广泛存在于动、植物和微生物中，几乎所有动物、植物和微生物都含有淀粉酶。

淀粉酶是研究较多、生产最早、产量最大和应用最广泛的—类酶。特别是

20世纪60年代以来由于淀粉酶在淀粉糖工业生产和食品工业中的大规模应用，

它的需要量与日俱增，到目前为止，其产量几乎占到整个酶制剂的50％以上，

销售金额占到55％～60％。按照水解淀粉的方式不向，主要的淀粉酶有α—淀粉

酶、β—淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶、环糊精葡萄糖基转移酶等。

淀粉酶已经成为工业应用中最为重要的酶之一，并且大量的微生物可以用以

高效生产淀粉酶，但是酶的大规模商业化生产仍然局限于几种特定的真菌和细菌

中。对于高效的淀粉酶的需求越来越多，这可以通过对现有酶的化学改良或者通

白质工艺改良得到。得益于现代生物技术的发展，淀粉酶在制药方面的重要性日

益凸显。当然，食品和淀粉工业仍然是主要市场，淀粉酶在这些领域的需求仍然

是最大的。

中性淀粉酶是目前使用最广泛的一种酶，主要运用于发酵、食品、医药、纺

织及造纸工业。就我国而言一般采用液态深层发酵法生产，但发酵水平低，过滤

困难，使其发展受到了较大的限制。

本课题中以枯草杆菌为实验菌株，采用液体摇瓶发酵，并在培养基中添加发

酵助剂如 Na＋和Tween—80等来提高酶活。

枯草芽孢杆菌可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌。枯草芽孢杆菌菌体自身

合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，可在消化道中与动物

体内的消化酶类一同发挥作用。枯草芽孢杆菌广泛分布在土壤及腐败的有

机物中，易在枯草浸汁中繁殖。

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1. 菌种的选育

1.1 菌种的选育及制备

不管是在过去、现在和将来，微生物是各种生物活性产物的丰富资源。在发酵前期，微生物的选择至关重要，此课题设计的是利用枯草芽孢杆菌发酵生产中性淀粉酶的整体过程。

选择性分离的步骤一般是：

含微生物材料采集——标本材料的预处理——菌种的分离——富集培养——菌种初选——菌种复选——性能鉴定——菌种保藏。

1.1.1 含微生物材料的选择

土壤是微生物聚集最丰富的场所，菜园和农田耕作层土壤含有丰富的有机物常以细菌和放线菌居多，由于枯草芽孢杆菌生活在中性的环境中，可以采集中性的土壤。采土时先用小铲除去表土，取5～15㎝深处的土样，选好3～5点，每点取土10g混在一起装入灭过菌的牛皮纸袋，并记录时间、地点、植被等情况。

1.1.2 预处理

在培养过程中以淀粉作为唯一或主要碳源，控制pH在 6.7～7.2。那些在所采用的条件下最适用于淀粉代谢的微生物最终将占优势，并可在淀粉琼脂糖平板上分离到产生中性淀粉酶的菌株。

1.1.3 所需菌种的纯化和分离

可用平板划线法进行菌种分离。方法如下：用接种管蘸取少量经增殖培养后的菌液，在含无菌固体培养基的平板表面上进行规则划线，操作时由右向左轻轻划线，划线时平板面与接种环成30°～40°，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，线条要平行密集，使两线不能重叠，充分利用表面积，划线时接种环不要嵌入板内划破培养基，密集的含菌样品，经过多划线稀释，使菌体在平板培养基上逐渐分离成单个菌株，经培养繁殖成单个菌落，反复进行几次平板划线分离，可得枯草芽孢杆菌野生菌株。

1.1.4 菌株的培养

常用培养基配方：1L蒸馏水+10g蛋白胨+3g牛肉膏+15～20g琼脂+5gNaCl。本课题以麸皮、豆饼粉作为天然培养基，在37℃保温箱中培养，至培养基中部

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分出现成熟颜色即可进行保藏。

1.1.5 菌落的选择

初筛采用透明圈法，方法为在培养基里接入淀粉天青，接入含菌样品后，可在菌落周围清晰地观察到淡蓝色晕环，初筛选出的微生物经过菌株性状试验后已确定具有一定生产能力的菌株还要进行复筛。

方法：将初筛后的少数菌株接种于40 ml 锥形瓶内的液体培养基中，110次/min 往复式摇床式震荡培养，得到摇瓶种子。

1.2 诱变育种

诱变育种可以利用物理、化学因素诱导遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求如高产的个体，进而培育成新的品种或种质。

诱变育种操作程序如下：

出发菌株→纯化→培养液→细胞或孢子悬液→诱变剂处理→中间培养→平板分离→初筛→复筛→生产性能实验→菌种保藏。

1.2.1 出发菌株的选择

由于野生型菌株生产性能较差，通常采用经历过生产条件考验的菌株，即经过液体培养的摇瓶种子，这类菌株一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变的可能性也很大。

1.2.2 菌悬液的制备

细菌一般要求处于对数生长中期的菌，用玻璃珠振荡5 min，使细胞均一分散，然后用灭菌脱脂棉过滤，得到分散菌株。菌悬液的细胞浓度不宜过高，本课题中的枯草芽胞杆菌，宜将其浓度控制在108个/ml。菌悬液介质一般用生理盐水。

1.2.3 诱变剂的处理

诱变剂包括物理、化学、生物诱变，在微生物诱变育种中，可用物理化学复合诱变因素处理菌种，这样可以扩大培养幅度，提高诱变效果获得中性淀粉酶高产突变株。方法及步骤如下：

吸取制备好的枯草芽孢杆菌悬液5 ml于直径为6㎝的无菌培养皿中，然后用0.5%～1%的二乙酯处理30 min，处理时采用pH 7.0的磷酸缓冲液，再将磁力搅拌器于紫外灯下（距离30 cm）1 min，接着在红灯下吸取经处理的菌液0.5 ml，

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稀释至10-6，取10-6～10-1稀释液滴一滴于6个平板中，10-6～10-1 依次涂布均匀，再置暗箱内与37℃培养48 h。

注意：一般化学诱变剂均有毒性，多数还具有致癌作用，故操作时切忌用口吸取并勿与皮肤直接接触，做好安全工作。

1.2.4 突变菌株的筛选

包括：琼脂块透明圈法初筛。

方法：倒入选择培养基6皿，取其中较厚的2皿，用打孔器或玻璃打制圆形培养基→平移琼脂块至一个选择平板上，再用接种针挑取单菌落的少量菌体分别接种于琼脂块中心并与一琼脂块接入出发菌株作为对照→正置于37℃培养45小时→于培养好的选择平板中滴加几滴淀粉天青，观察到透明圈的直径→选择透明圈大的菌落接入斜面备复筛用。

摇瓶发酵复筛：将经初筛处的菌株分别接入增殖培养基中，培养13小时→分别接种于锥形瓶发酵培养基中→置37℃摇床上发酵40小时→选出酶活力较高者进一步复筛直至选出中性淀粉酶高产突变株。

1.3 菌种的保藏

菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产，如氨基酸、抗生素、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。

菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。常用的菌种宝藏方法有：斜面冰箱宝藏法、沙土管宝藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法。

在这里我们采用沙土保藏法。方法：将需保藏的菌种经斜面培养后用无菌水制成孢子悬液，加入经灭菌处理的沙和土的混合物（或纯沙亦可）作为载体，减压抽去水分，这些吸附有孢子的干燥沙土载体，在低温下保存。

操作步骤：斜面孢子先加灭菌蒸馏水2～2.5ml，沿斜面轻刮孢子后，再吸0.2～0.3 ml到灭菌备用的沙土管中，在真空度100 Pa以下进行干燥，直至沙土

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管外貌呈松散状态，然后低温（4℃）保存。经真空干燥后的沙土管，最好放在密闭容器内，容器内可放入吸潮剂CaCl2 或硅胶等，保藏期间整个容器置于冰箱内。一般保存期为一年左右。

2. 培养基的配制

2.1 培养基的类型

培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用到孢子,种子和发酵培养基这三种类型。

2.1.1 孢子培养基

孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的，常采用的是固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的孢子，并且不会引起菌体变异。对孢子培养基的要求：①营养不要太丰富；②所用无机盐的浓度要适量；③注意培养基的pH和湿度。

中性淀粉酶的孢子培养基配置如下：将麸皮5％、豆饼粉3％、蛋白胨0.25%、琼脂2%（pH 7.1）制成斜面培养基，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min 。

2.1.2 种子培养基

种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种子。对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。

中性淀粉酶的种子培养基的配置：将豆饼1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化钠0.05%配置成种子培养基(pH 7.1～7.2)，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min。

2.1.3 发酵培养基

发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和能耗。

中性淀粉酶的发酵培养基配方是：麸皮70％、小米糠20％、木薯粉10%、烧碱0.5%，加水使水量达60％，常压蒸汽灭菌1h。

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2.2 培养基的营养要求

培养基的成分大致分为碳源、氮源、无机盐、微量元素、特殊生长因子、促进剂、前体和水等几大类。对不同的微生物，微生物不同的生长阶段，不同的发酵产物以及不同发酵工艺条件等，所使用的培养基都是不同的，这些也都是培养基配制需要考虑的因素。

2.2.1 水

水是所有培养基的主要成分，也是微生物机体的重要组成成分。水是良好的溶剂，又是活细胞中一切代谢反应的媒介物，还可以维持细胞中的渗透压，同时水又是热的良好导体，有利于散热，可调节细胞温度。在中性淀粉酶的发酵生产中，为了避免水质变化给生产带来不良影响，发酵用水采用深井水，并定期检查水质，要求：pH 6.8～7.2，电导率500～1500μΩ/cm，总硬度 100～230 mmol/L。

2.2.2 碳源

碳源的主要为微生物细胞的生长繁殖提供能源。目前生产中性淀粉酶的菌种为异养型微生物，所以只能利用有机碳；大量的农副产品是主要的有机碳源，如山芋、麸皮、玉米、米糠、马铃薯、木薯、土茯苓等淀粉质原料，这里用到的碳源是麸皮、马铃薯、木薯。

2.2.3 氮源

氮源是组成蛋白质和核酸的主要元素，酶自身即为蛋白质。因此，氮源是必不可少的重要原料。常用的有机氮源油花生饼粉、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉等。我们用到的氮源是豆饼粉剂和蛋白胨。

常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。

2.2.4 无机盐类及微量元素

酶在生长和繁殖生长过程中，需要某些无机盐及微量元素如磷、镁、硫、钾、钠、钙、铁、锰、锌等。钠离子具有控制细胞和培养基之间的渗透压的作用，从而促进产酶，添加适量亚硝酸钠可提高酶活力；钙对淀粉酶有稳定和活化作用。中性淀粉酶生产中通常以氯化钙提供钙离子。

2.2.5 生长因子和产酶促进剂

酶的生产中所需的生长因子大多由天然原料提供。玉米浆、麦芽汁、豆芽汁等，都含有丰富的生长因子。产酶促进剂一般是该酶的底物和底物类似物，对于

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中性淀粉酶，可添加适量浓度的淀粉琼脂糖作为诱导剂。

2.3 培养基的灭菌

生物化学反应过程中，特别是细胞培养过程，往往要求在没有杂菌污染的情况下进行，这是由于生物反应系统中通常含有比较丰富的营养物质，因而很容易受到杂菌污染，进而产生各种不良后果：（1）由于杂菌的污染，使生物化学反应的基质或产物消耗，造成产率下降；（2）由于杂菌所产生的某些代谢产物，或染菌后发酵液的某些理化性质的改变，使产物的提取变得困难，造成收得率降低或使产品质量下降；（3）污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；（4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH，从而使生物化学反应发生异常变化；（5）发生噬菌体污染，微生物细胞被破裂而使生产失败等。

2.3.1 灭菌方法

所谓灭菌，就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法有：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤灭菌等。本实验采用湿热灭菌。

2.3.2 培养基的湿热灭菌

条件为在121℃（表压约0.1MPa）维持30分钟。

湿热灭菌即利用饱和水蒸气进行灭菌，是工业中最重要的灭菌方法。在同样的温度下，温热的杀菌效果比干热好，其原因有：①蛋白质凝固所需的温度与其含水量有关，含水量愈大，发生凝固所需的温度愈低。湿热灭菌中菌体蛋白质吸收水分，较同一温度的干热空气中易于凝固而杀灭各种微生物。②温热灭菌过程中蒸气放出大量潜热，加速提高温度。因而湿热灭菌比干热所要温度低。如在同一温度下，则湿热灭菌所需时间比干热短。③湿热的穿透力比干热大，使深部也能达到灭菌温度，故湿热比干热收效好。

一．影响灭菌效果的因素

⑴微生物的种类和数量；

⑵培养基性质、浓度、成分；

⑶灭菌的温度、时间。

二．热阻：微生物对热的阻抗能力。

三．灭菌原理

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对数残留定律：经加工灭菌，死亡微生物速度和存在的微生物数量成正比。

2.4 空气灭菌

此课题为好氧发酵，以空气作为氧源。根据国家药品质量管理规范的要求，生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求。获得无菌空气的方法有：辐射灭菌、化学灭菌、加热灭菌、静电除菌、过滤介质除菌等。

过滤介质除菌是目前发酵工业中空气除菌的主要手段，其介质有棉花过滤器、超细玻璃纤维纸、石棉滤板、金属烧结管等。

2.4.1 过滤除菌流程及设备

流程如下：采风塔→空气粗过滤器→空气压缩机→储气罐→冷却器→旋风分离器→冷却器→丝网除沫器→空气加热器→总空气过滤器。

设备如下：

1.采风塔：采风塔建在工厂的上风头，高至少10 m,气流速度8 m/s。

2.粗过滤器：主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时起一定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。

3.空气压缩机：作用是提供动力，以克服随后各设备的阻力。

4.空气储罐：作用是消除压缩空气的脉动。

要求：H/B=2～2.5 V=（0.1～0.2）V1

其中，H为罐高；

B为罐直径；

V1为空压机每分钟排气量（20℃，1×10Pa状况下）。

5.旋风分离器：是利用离心力进行气-固或气-液沉降分离的设备。作用是分离空气中被冷却成雾状的较大的水雾和油雾粒子。

6.冷却器：空压机出口温度气温在120℃左右，必须冷却。另外在潮湿的地域和季节还可以达到降湿的目的。

7.丝网除沫器：可以除去空气中绝大多数的20µm 以上的液滴和1µm以上的雾滴，一般采用规格为直径0.25㎜×40孔且高度为150㎜的不锈钢丝网。

8.空气加热器：列管内走空气，管外走蒸汽。可将空气湿度由100%降低到70%以下。 5

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9.总过滤器：填充物按下面顺序安装：孔板→铁丝网→麻布→活性炭→麻布→棉花→麻布→铁丝网→孔板。介质要紧密均匀，压紧一致，上下棉花层厚度为总过滤层厚度的1/4，中间活性炭层为1/3。

2.4.2 无菌空气的检查

现在采用的无菌检查实验方法有肉汤培养法、斜面培养法和双碟培养法。这里采用斜面培养法来检查。具体方法如下：

500ml三角瓶内装斜面培养基50m1，其组成为麦芽糖6％、豆粕水解液6％、Na2HPO4·12H2O 0.8％、(NH4)2SO40. 4％、CaCl2 0.2％、NH4C1 0.15％，

pH 6.5～7.0，接种后置旋转式摇床亡，(37±1)℃下培养28h左右备用。

2.5 发酵罐的灭菌

发酵罐的灭菌可采用空罐灭菌和实罐灭菌，此处采用空罐灭菌。空罐灭菌是将所有的通气口都稍微打开，然后通入热水蒸汽，让水蒸汽尽量通过每一个菌落达到灭菌效果。具体方法是：在121℃灭菌30分钟。

3. 种子扩大培养

本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。设计流程如下：

孢子→锥形瓶→种子罐→种子罐→发酵罐

3.1 孢子制备

将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽孢杆菌孢子用无菌水洗下，接种到锥形瓶中，在35℃静置培养2～4天，待长出大量孢子后作为接种用的种子。

3.2 种子制备

将保藏的菌种接种到马铃薯茄子瓶斜面（20%马铃薯煎出汁加MgSO4·7H2O 5 mg/L，琼脂2%，pH 6.7～7.0），37℃培养3天。然后接入到20L种子罐，37℃搅拌，通风培养12～14小时。此时菌种进入对数生长期（镜检细胞密集，粗壮整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液pH 6.3～6.8,酶活5～10U/mL），再接种到发酵罐。

3.3 发酵罐培养

培养基的配制：用麦芽糖液配置成含麦芽糖6％、豆粕水解液6％～7％、

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Na2HPO4·12H2O 0.8％、(NH4)2SO4 0.4％、CaCl2 0.2％、NH4Cl0.15％、豆油1kg、深井水20L，调pH至 6.5～7.0。

发酵罐培养基经消毒灭菌冷却后接入3%～5%种子培养成熟液。培养条件为：温度37±1℃，罐压0.5kg／cm2，风量1～20h 为1：0.48vvm，20 h后1：0.67vvm，培养时间为28～36 h。

4. 发酵罐的设计

4.1发酵罐的结构

通用发酵罐的主要组成部件有：

1.罐体：是发酵罐的主要结构，其内壁有挡板，作用是防止液内中心产生漩涡，一般用3～5块挡板。

2.搅拌装置：主要功能是使罐内物料混合均匀，搅拌器叶轮多采用搅拌涡轮式，搅拌轴要与罐体密封严实，防止漏液和染菌。搅拌转速为200r/min.

3.传热装置：有夹套，列管等，这里采用外夹套。

4.通气部分：通过空气分布器将通入的无菌空气均匀分布到发酵液中，发酵罐通风量0～12 h为1：0.67vvm ,12 h至发酵结束通风量为1：（1.0～1.33）vvm 。分布器有单管式和环形管式。

5.消泡装置：用于消除产生的泡沫，最简单实用的消泡装置是耙式消泡器，直接装在搅拌轴上。

6.进出料口：罐顶设有进料口，罐底有出料口。其他附属设备还包括试镜、人孔（手孔）、取样管等，用以观测和检修。

4.2发酵罐的工艺尺寸

常用的机械通风发酵罐的结构和主要几何尺寸标准化设计（见附图）

其几何尺寸比例如下：

H0/D=1.7～3.5 H/D=2～5 d/D=1/3～1/2 W/D=1/12～1/8 B/D=0.8～1.0 (S/d)2=1～2 (2表示搅拌器挡数) h/D=1/4 单位全部为m

发酵罐大小用公称体积表示，V0=∏D2×H/4+0.15D3

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其中：H0-发酵罐圆柱形筒身高度 D-发酵罐内径 H-罐顶到罐底的高度 d-搅拌器直径 W-挡板宽度 B-下搅拌器距罐底的距离 S-搅拌器间距 h-底封头或顶封头高度

计算：

已知年产量为3吨，中性淀粉酶产量为292g/L,一年有300个工作日，发酵周期为48小时，即2天，清理发酵罐1天，对淀粉的转化率为42%，预处理收率85%，提取率为70%，发酵罐个数为3个，装料系数为0.75，V0是公称容积，指筒身容积与底封头容积之和，则：

发酵罐体积为：

V0=3×1000/292/（300/3）/42%×85%×70%/3/0.75=0.18 m3 ≈0.200 m3

由: V0=∏D2×H/4+0.15D3=∏D3/2+0.15 D3=0.200m3

得：D=0.43 m

那么：H0=2.5D=2×0.93=1.075 m H=3D=3×0.93=1.29 m

d=D/2=0.5×0.93=0.215 m W=D/12=0.93/12=0.036 m

B=0.9D=0.9×0.93=0.387 m S=2D=2×4.88=0.43 m

h=D/4=0.93/4=0.108 m

液面高度HL=0.75(H+h)=0.75×(2.79+0.233)=1.049 m

4.3 物料衡算

本系统采用3个发酵罐，每个为200 L=0.2 m，中性淀粉酶产量为292g/L, 对糖的转化率为42%，提取率为70%，装料系数为0.75，则：

每个发酵罐在一个发酵周期中性淀粉酶产量为：

0.2×292×42%×70%×0.75 = 12.877（kg）

那么3个发酵罐1年的总产量为：

（12.877×300/3）×3 = 3863.16（kg）= 3.86吨

故符合年产量为3吨的生产要求。 3

5. 发酵过程的工艺控制

5.1 发酵过程的补料策略

中间补料是在发酵过程中补充某些营养物料、水或产酶促进剂，以满足微生

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物的代谢活动和产酶的需要。中性淀粉酶生产中要经常补料，用3倍年度浓度碳源的培养基补料，体积相当基础料的1/2，从培养12h开始，每小时1次，分30余次补加完毕。延长了发酵时间，提高了酶活力和单罐产量。

5.2 发酵过程pH值的控制

各种微生物需要在一定的pH环境中方能正常生长繁殖。

培养基中C/N比值高，发酵液倾向于酸性，pH偏低；C/N比值低，发酵液倾向于中性或碱性，pH偏高。中性淀粉酶最适 pH为6.8～7.2。因此，在发酵过程中，可通过添加适量的尿素或碳酸钙等来调节pH上升或下降。

5.3 发酵过程温度的控制

温度对微生物的生长、产物的合成和代谢调节有重要作用。温度变化一方面影响各种酶反应的速率和蛋白的性质，另一方面影响发酵液的物理性质。不同的菌种有着不同的最适温度。枯草杆菌发酵温度控制在35℃～37℃最适宜。

5.4溶氧的控制

中性淀粉酶发酵是需氧发酵，无论是基质的氧化，菌体的生长还是产物的合成均需大量的氧气。若发酵液中氧气不足，可通过加大通气量，适当降低温度，提高罐压，补水，提高搅拌速度来控制。中性淀粉酶发酵过程中，0～12 h通气量为1：0.67 vvm，12 h至发酵结束通气量为1：（1.0～1.33） vvm 搅拌转速200r/min。罐压0.5kg/cm2。

5.5 染菌的控制

在工业发酵中，染菌轻则影响产品的质和量、重则倒罐或停产、影响工厂效益。因此要严格无菌操作，种子灭菌要彻底，净化空气设备，操作要慎重，设备灭菌要彻底。若在前期染菌，应重新灭菌；中期染菌，应偏离杂菌生长条件；后期染菌，可提前或及时放罐。

可能出现的异常发酵现象：

1.培养基变稀：可能是噬菌体污染或营养成分缺乏；

2.培养基过浓：会抑制微生物的生长，考虑可能是污水污染；

3.耗糖较慢：可能原因是种子生长能力降低，检测种子是否衰退，发酵条件是否合适，以及营养成分是否全面，尤其注意缺磷；

年产3吨中性淀粉酶发酵工艺设计

4.pH值不正常：用缓冲对来调节，检查是否染杂菌，碳氮比是否合适；

5.生长缓慢：最可能的原因就是营养成分不足。

6. 下游加工

下游加工过程是生物工程的一个组成部分，是生物化工产品通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，以上述发酵、反应液或培养液分离、精制有关产品的过程。

下游加工过程的一般工艺流程为：

发酵液→预处理→→高度纯化→成品加工 →初步纯化

6.1 发酵液的过滤和预处理

预处理就是除去高价离子和蛋白质，对高价离子的去除可以采用草酸或磷酸，草酸它与钙离子生成的草酸钙，还能促使蛋白质沉淀，加磷酸既能降低钙离子也能降低镁离子。对于蛋白质的沉淀可以加入絮凝剂，调节pH值或加热。过滤：采用鼓式真空过滤器，过滤前加去乳化剂并降温。

6.2 提取

中性淀粉酶常用的提取方法有：盐析法、乙醇淀粉吸附法和喷雾干燥法，这里用盐析法。具体方法：发酵液经热处理，冷却到40℃，加入硅藻土为助滤剂过滤。滤饼加2.5倍水洗涤，洗液同发酵液合并后，在45℃真空浓缩数倍后，加(NH4)2SO4 至40%饱和度。盐析沉淀物加硅藻土后过滤，滤饼于40℃烘干磨粉即成粗酶制品。由酶液到粉状制酶剂的收率为70%。

成品固体酶制剂的干燥方法有烘房、气流干燥、喷雾干燥、沸腾干燥、振动干燥和真空冷冻干燥。由于喷雾干燥生产能力大，维修保养简单，因此生产中常采用这种方法。

6.3 纯化

中性淀粉酶的纯化方法可采用凝胶过滤法，就是以特定的凝胶物质为分子筛装入层析柱，再通过分离溶液时大于凝胶孔径的分子会被排阻在胶粒外，因此它们将“绕道通过”；小于该孔径的分子，由于可以自由出入胶粒内外，因此将沿着

年产3吨中性淀粉酶发酵工艺设计

胶粒缝隙而直接流出。通过一段程度的凝胶层析柱后，大小分子将依次先后流出。

7. 枯草芽孢杆菌生产发酵中性淀粉酶工艺总流程图

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