水稻胚芽鞘的衰老_百替生物

水稻胚芽鞘的衰老

水稻胚芽鞘的衰老

专业：植物学学号：D06058学生：孔妤导师：王忠教授

摘要：我们对水稻胚芽鞘细胞的死亡做了研究。在淹水条件下种子萌发产生的胚芽鞘比氧充足条件伸长。位于一侧的特定细胞发生死亡诱导胚芽鞘缺口打开，芽鞘快速伸长尽快到达通气区域，从而降低第一叶厌氧毒害的积累。另外一种细胞死亡以溶生性通气组织的形式出现。伴随着胚芽鞘的衰老，叶绿素开始降解，组织明显变棕色。TUNEL法检测到的DNA片段以及DNA梯状条带进一步验证了胚芽鞘细胞的衰老死亡。胚芽鞘的分离蛋白质经检测发现有两

2+2+种核酸酶(Nuc-a和Nuc-b)，Nuc-a一般在细胞死亡的三个阶段都可观察到，需要结合Ca或Mg中的任意一种，然而

2+2+2+Nuc-b出现在衰亡阶段，需要Ca和Mg共同激活。Zn能有效抑制这两类核酸酶。

:胚芽鞘，细胞死亡，TUNEL，DNA断裂，核酸酶关键词关键词:

洪涝引起的土壤淹水，是导致维管植物氧缺乏最常见的环境因素。水稻是长期适应淹水环境的一种典型植物(Avadhanietal.,1978)，并且它的胚芽鞘在完全缺氧环境中可伸长。胚芽鞘保护真叶免遭土壤压力及其它机械作用，同时还可为发育分化的组织提供营养。(FroÈhlichandKutschera,1995)。依照Esau(1965)的叶理论解释胚芽鞘不具有普遍性。有人认为它是盾片、盾片鞘的产物，而不是由顶端分生组织分化形成。另一种观点认为胚芽鞘和中胚轴是两类完全不同的器官，它们的发生过程不存在相似性。

通气组织贯穿于水稻植株的胚芽鞘、根、叶中脉以及叶鞘内(Hoshikawa,1989；Matsukuraetal.,2000)。近年我们已报道了水稻根内通气组织的形成过程是特定位置上的细胞死亡(Kawaietal.,1998;Samarajeewaetal.,1999)。大量的证据表明，通气组织提供了一种扩散途径，使氧从植物的气生地上部向渍水或缺氧的根系运输仅要很小的阻力(Armstrong,1971;KawaseandWhitmoyer,1980)。稻种萌发后胚芽鞘快速伸长，像一个伸向大气中的“通气管”。

Inada(1998a，b)等人报道，成熟种子中胚芽鞘已分化完全,种子经吸胀作用后开始出现，白色带黄的胚芽鞘，快速伸长至实际大小，并在3天内颜色转为灰绿色。当第一叶发育成形胚芽鞘停止生长，圆柱状胚芽鞘具有纵向快速分裂特性。幼苗长至三叶期，胚芽鞘变为褐色，完全衰老死亡。因而胚芽鞘是水稻萌发以后最先发生衰老死亡的组织。

叶片长至一定的叶龄，或者植株进入一定的生殖生长阶段，即使生长在最适环境中，某些器官或组织也会发生衰老死亡(Buchanan-Wollaston,1997；Orzaez和Granell,1997)。McManus等(1998)对老叶进行了研究，发现细胞核大小及核内染色质均发生显著变化。此外,Yen和Yang(1998)同样证实叶片衰老过程中存在大量的DNA片段。

我们对水稻幼苗设置淹水处理后转移至氧充足环境，研究目标在于阐明水稻幼苗胚芽鞘伸长过程中发生细胞死亡。本研究发现胚芽鞘发育存在空间上的规律性，另外我们对衰老过程中核酸酶的活性加以检测。

1.材料与方法

1.1材料

以水稻（OryzasativaL.)品种为材料，种子放在一定湿度的纱布上，置于玻璃试管内培养，于23C连续光照4d。设置淹水处理，将萌发的稻种完全浸没在水中（水面以下8cm），玻璃瓶和水都经过高温灭菌，抽真空30分钟，抽空瓶中气体及溶解氧后立即密封。为促进细胞死亡，幼苗经淹水处理7d后转置空气中，室温230C培养。我们用溶解氧测定仪(OM-14,HORIBA,Tokyo,Japan)测定水中氧浓度。选择生长14天的水稻幼苗作为观察衰老胚芽鞘的材料。0

1.2方法

1.2.1胚芽鞘的观察

切取5mm长的胚芽鞘固定于4%的多聚甲醛（20mM二甲基砷酸钠缓冲液配制，pH7.0），40C过夜。经酒精梯度脱水至纯酒精，树脂(Technovit8100)包埋。切片观察，厚度10um，0.1%甲苯胺蓝染色，显微照相，利用图像放大系统测定细胞长度。

1.2.2伊文思蓝染色

用2.5%伊文思蓝染色胚芽鞘的徒手切片。1分钟后用蒸馏水冲洗，光学显微镜下观察照相。在观察之前，可以对整株幼苗进行2.5%伊文思蓝染色，再用水冲洗，以确定取样位置。

1.2.3TUNEL法检测

水稻胚芽鞘的衰老

TUNEL法,即脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端原位标记法（terminal

-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling）可原位反应细胞核DNA断裂情况。利用TUNEL法原位标记凋亡检测试剂盒,染色体DNA双链断裂或单链断裂产生大量的3’-OH末端，将脱氧核糖核标记到DNA的3'-末端，从而可检测到凋亡细胞。方法参照说明，具体步骤如下：组织切片用冷风吹干后，放在通透液（0.1%Triton-100溶于0.1%柠檬酸钠溶液）孵育15分钟，经PBS漂洗，滴加TUNEL反应混合溶液，DAPI显色，封片后显微镜观察并照相。

1.2.4DNA的提取和片段化检测

胚芽鞘在液氮中研磨成粉末，加入提取缓冲液(5mMTris-HCl,pH8.0,20mMEDTA和0.5%TritonX-100)，用等体积的苯酚/氯仿(1：1)混合物抽提一次，8000×g离心15分钟。加入等体积异丙醇使核酸全部沉淀出来。1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙啶染色后将凝胶置UV透射仪上观察。

1.2.5核酸蛋白凝胶系统分析（nucleasein-gel-assay）

粗酶液提纯（50mMHEPES缓冲液，pH8.0，330mM山梨醇，20mMEDTA和1mMPMSF)。匀浆后超声

00波降解,4C，5000×g离心15分钟。取上清液用作SDS-PAGE。电泳之后,凝胶在50C反应混合液（20mM

00Tris-HCl缓冲液，pH7.5，5mM2-巯基乙醇）中孵育1h，4CTris-HCl缓冲液中过夜。37C凝胶置于

混合液（50mMTris-HCl缓冲液，pH7.5，3mMCaCl2,3mMMgCl2和1mM2-巯基乙醇）中孵育10-24h。

为检测核酸酶的活性，凝胶经溴化乙啶染色后置UV透射仪上观察。滴加10mMEDTA(pH8.0)或3mMZnSO4于反应混合液，分析核酸酶结合离子情况。用考马斯亮蓝G-250法测定酶液中的总蛋白质含量。

2.结果

2.1淹水缺氧和氧充足条件下胚芽鞘细胞的比较

对水稻幼苗胚芽鞘生长情况进行研究，设置两种处理：完

全淹水缺氧和氧气供应充足。培养4天后，完全淹水的水稻胚

芽鞘比氧供应充足条件伸长的快(Fig.1A)，但是其颜色不为绿

色，并且根的生长受到抑制。缺氧和氧充足条件下胚芽鞘伸长

情况存在显著差异，我们取胚芽鞘纵切面的中间剖面，对芽鞘

细胞的长度加以比较(Fig.1B，C)。完全淹水的胚芽鞘细胞长

度是氧充足情况下的几倍(Fig.1D)。厌氧条件下胚芽鞘伸长的

实质是芽鞘细胞的延伸生长。水稻幼苗胚芽鞘的纵切面观察发

现，在氧充足环境中生长的芽鞘出现通气空腔(Fig.1B),而淹

水厌氧条件没有发生此类空腔(Fig.1C)。淹水第一天水中溶解

-1-1氧浓度为3.00mg·l,种子萌发后48h减至0.38mgl，因而

0可将淹水情况确定为低氧或者氧不足条件。23C时水中溶解氧

-1浓度为8.39mg·l以达到与大气平衡。

为了检测细胞死亡现象,胚芽鞘中央部位的徒手切片染

上伊文思蓝(Fig.2)。伊文思蓝是一种与活细胞质膜相斥的染

料,死细胞膜破损可渗入该染料。不管是淹水缺氧(Fig.2A,B,

D)还是通气(Fig.2C)环境下生长的胚芽鞘内都可见到两个大

的维管束。在氧充足条件下，芽鞘的维管束两侧或邻近部位有

通气组织形成(Fig.2A,B,D)。我们可观察到空腔或崩溃区域

的细胞被染上伊文思蓝,这些细胞即将形成通气组织(Fig.2B,

D)。此外，同样发现胚芽鞘缺口周围那层细胞染上较深的伊

文思蓝(Fig.2E)。淹水条件生长的胚芽鞘既无空腔也未染上伊

文思蓝的细胞(Fig.2C)。

FIG1.A淹水缺氧和氧充足条件下生长4天的水稻胚芽鞘，箭头所指为胚

芽鞘；B、C胚芽鞘的纵切面，氧充足(B)和淹水缺氧(C)，ae,通气组织，

bar.100mm；D

胚芽鞘薄壁组织细胞的平均长度(n＝60)

水稻胚芽鞘的衰老

FIG2.氧充足条件下生长4天的胚芽鞘，可观察

到发生细胞死亡的区域(A,B,D和E)及淹水7天

的胚芽鞘(C)。取胚芽鞘中间部位的横切面(A)，

伊文思蓝处理后发生死亡的细胞染上蓝色

(B-E)；D为B的放大图。E断开的缺口区域染上

伊文思蓝，图中箭头所指为维管束，Bar.100mm.

2.2氧充足促进胚芽鞘成熟和细胞死亡

如图1所示,浸没在水中的胚芽鞘伸长情况。通过这样的胚芽鞘我们可以区分成熟或衰老时发生的细胞死亡，如图3A。淹水条件下生长7天的胚芽鞘伸长至通气区域,72h后胚芽鞘开始变绿，96h后第

一叶从胚芽鞘开口处完全抽出。伴随着叶绿素的分

解退化，96h后表现出典型的衰老症状。为进一步

检测胚芽鞘的缺口区域，对不同天数的幼芽用伊文

思蓝染色(Fig3B-E).暴露于氧充足条件下6h后，

在近轴区域纵向少数部位标记上蓝色(Fig3C和E),

24h后这些部位由于胚芽鞘开裂引起细胞死亡

(Fig.3D,F)。在6h后,胚芽鞘以内的第一叶不再伸

长。

FIG3.A，取淹水处理7天的水稻幼苗（0h）移

至空气中，分别观察24,48,72,96和144h幼

苗的生长变化情况。箭头所指为衰老的胚芽鞘。

Bar.1cm。胚芽鞘转至通气环境0h(B)，6h(C和

E)、24h(D)，用伊文思蓝染色观察细胞死亡情

况。E是C的放大图，C、E图中箭头所指为染上

伊文思蓝的部位。Bars.0.2cm(B-E)。F，胚芽

鞘由淹水转至通气环境，不同时间缺口区域（蓝

色）形态变化示意图。

为了确定细胞死亡发生的初始位置，进一步对

胚芽鞘的缺口区域进行研究。淹水7天的水稻幼苗

(Fig.4A,C)转至通气环境中。可以发现在胚芽鞘出

现缺口之前有一层排列紧密的细胞，它们即将发生

细胞死亡(Fig.4C)。6h后缺口由近轴表层向外开始延伸(Fig.4D)。缺口处一般位于整个胚芽鞘长轴的中心区(Fig.4E)。因而缺口位置是可预测的，且位于两个维管束的正中间。我们还发现胚芽鞘的缺口表现于某些特定的细胞。24h后胚芽鞘完全断开(Fig.3D)。此外48h后细胞开始发生崩溃形成通气空腔，为伊文思蓝染色。通气空腔于96h分化形成(Fig.4B)。在空隙或气腔的扩大贯穿于胚芽鞘发育成熟和衰老整个过程。

FIG4.由淹水移至空气中生长的胚芽鞘横切面示意图。A、B分别为0h和96h。B中箭头所示为通气组织。C和D分别为移至大气中0h和6h后缺口部位的放大图。胚芽鞘部分区域被染上伊文思蓝。C、D中箭头所指为缺口发生部位。Bar.50mm.E当胚芽鞘移至大气6h后出现缺口，位置一般是固定的，伊文思蓝标记该位点，结果以所占百分比表示。胚芽鞘内第一叶出现的位置如E图所示。n＝60.（如下图）

水稻胚芽鞘的衰老

2.3胚芽鞘衰老过程中DNA片段化

动物细胞的凋亡是细胞程序性死亡(PCD)的一种类型,包括染色质浓缩，细胞变形收缩,细胞膜液泡化,凋亡小体形成以及巨噬细胞消化等。细胞核DNA断裂被认为是最主要的衰亡特征。我们利用TUNEL法检测水稻幼苗胚芽鞘内是否发生DNA断裂(Fig.5B)。与胚芽鞘缺口和通气空腔形成相关的死亡细胞并未标记上TUNEL阳性(Fig.5A)。淹水移至通气环境中120h的胚芽鞘显现TUNEL阳性。此时出现的DNA断裂很可能与胚芽鞘的逐步衰老相关联。缺口和通气空腔区域一直都未显示TUNEL标记信号。

对移至通气环境中0、48、96、120h的胚芽鞘分别提取总DNA，上样量10mg，经1.5%琼脂糖凝胶电泳呈现特异的梯状条带图谱。琼脂糖凝胶电泳时会形成一种阶梯状的条带（Fig.5）。DNA条带在96h时不清晰，但在120h时出现，在144h时转变为较小的条带。在0或48h，甚至在DNA完全或过量提取时，高分子量DNA的条带也较弱，因为溴化乙锭（EB）与完整DNA结合的能力较弱，这些条带的分子量分别为200和400bp左右（箭头所示）。分子量最低的条带(空箭头所示)颜色较深，在胚芽鞘衰老过程中并无RNA降解,这种分子量的核酸在0和48h都没有出现。另外，即使胚芽鞘浸没在水中3周，DNA仍保持完整性，DNA未发生断裂。

FIG5.TUNEL法对核DNA片段进行检测。在通气环境中分别生

长4天和14天的水稻幼苗，取胚芽鞘横切面(A)、(B)。左为

DAPI（4，6二脒基2-苯吲哚）染色，右为TUNEL法染色。经

末端标记后呈绿色荧光为阳性细胞，说明DNA双链断裂产生

一系列3’-OH末端。A图中箭头所指为缺口区域。

Bar.30mm.ae,通气组织FIG6.胚芽鞘梯状电泳图谱。移至通气环境中0、48、96、120h的胚芽鞘分别提取总DNA，上样量10mg，经1.5%琼脂糖凝胶电泳。10mgDNA与核糖核酸酶混合后点入加样孔。2.4细胞死亡过程中核酸酶的活性

水稻胚芽鞘的衰老

大量的证据表明细胞程序性死亡过程中DNA片段化是由核酸酶引起的。对胚芽鞘发育过程中核酸酶活性加以分析，选取淹水移至通气环境中培养的胚芽鞘为材料，提取蛋白质进行核酸蛋白凝胶系统分析。凝胶经考马斯亮蓝染色后发现在衰老过程中有几种蛋白质降解(Fig.7A)。实验结果证明胚芽鞘的发育过程中至少有两种核酸酶被诱导激活(Fig.7B)。第一类是核酸酶-a(Nuc-a,38kDa)，在胚芽鞘由淹水移至通气条件下24h被激活。第二类为核酸酶-b(Nuc-b,23kDa)，在衰老胚芽鞘的粗提液中发现，处理实施120h被激活。将凝胶放入低pH(5.5)溶液中,我们难以发现核酸酶。将凝胶浸没在反应混合溶液（螯合Mg2+,Ca2+,Zn2+和EDTA）中分析这些核酸酶所依赖的离子成分(Fig.8)。在Ca2+或Mg2+存在时可激

2+2+2+活Nuc-a。换言之，Nuc-b活性需要Ca和Mg共同参与激发。但是，Zn和EDTA可显著抑制这两类酶的

活性。

FIG.7.淹水7d后转至氧充足条件下胚芽鞘内核酸酶被激活。分别提取置气生环境中0、24、48、72、120和168h胚芽鞘蛋白。生长于氧充足通气环境中14d，胚芽鞘成熟衰老(SC)。(A)图凝胶经考马斯亮蓝染色，(B)图为核酸酶活性的分析。分子量测定结果如图。电泳结果表明反应溶液中包含3mMCaCl2和3mMMgCl2凝胶上出现条带。Nuc-a,核酸酶-a；Nuc-b,

核酸酶-b

FIG.8.核酸酶对离子依赖性的比较。分别选取从淹水移至通气环境中培养48h和168h的胚芽鞘为材料，提取蛋白质，48h(点样孔1),168h(点样孔2)，衰老胚芽鞘(SC)作核酸酶活性的分析，如材料与方法中所述；反应液中含多种阳离子。

3.讨论

禾本科单子叶植物胚芽鞘的生长发育具有生长状态快速向衰老死亡状态过渡的特征。我们将在淹水条件下发芽的水稻幼苗转置有氧环境中，其目的在于探明的胚芽鞘伸长过程中的细胞死亡事件。

在淹水条件下并未发现细胞死亡所引起的胚芽鞘断裂开口、通气组织形成及胚芽鞘衰老的任何证据。由此，我们推测缺氧或氧不足条件可能抑制幼苗胚芽鞘的成熟以及随后发生的细胞死亡。然而，一旦淹水的胚芽鞘移置空气中或氧充足条件，将至少有三件死亡事件发生，即：断裂开口、通气组织形成和衰老。

目前的研究结果还不能较清楚地阐明诱导胚芽鞘细胞死亡的特殊机制。我们不妨推测活性氧很可能介导芽鞘细胞的死亡。过氧化氢诱导高等植物细胞的死亡有过报道，由此我们可以进一步探讨这些物质与胚芽鞘的衰老是否存在着关联，这项研究具有较强的价值和意义。

光学显微镜下观察胚芽鞘开口区的横切面，发现这一区域有很多排列紧密的细胞，胚芽鞘的断裂

水稻胚芽鞘的衰老

开口是在这一特定的薄壁组织中自发发生的。

细胞凋亡是发生在动物中的一种特定的细胞程序性死亡（PCD）方式。它涉及核苷酸内切酶的激活以及寡聚核苷酸大小的DNA片段的出现（如琼脂糖凝胶电泳所示）。然而有些动物细胞的PCD过程中DNA并没有裂解成寡聚核苷酸。植物细胞的PCD过程有的会出现寡聚核苷酸大小的DNA片段，有的也无片段出现。因此可以说PCD过程中细胞死亡的机制有好多种，细胞凋亡是其中一种。Orzaez和Granell报道,豌豆衰老的心皮细胞中同时出现DNA阶梯状条带和细胞核浓缩现象。Yen和Yang应用TUNEL检测技术在自然衰老的植物叶片中发现DNA片段。Inada等人通过电镜观察，证明水稻胚芽鞘中叶绿体DNA的降解和细胞核的解体。在本研究中,我们在外围细胞的核中发现TUNEL阳性信号物质，并且在衰老的胚芽鞘中发现寡聚核苷酸大小的DNA梯带。结果显示,条带介于200bp-400bp之间，更小的分子随时间的推移而增多。这些结果进一步证实DNA片段化与衰老之间有一定关联。试验数据表明，作为PCD特征的DNA片段化在通气空腔和断裂开口区域的细胞没有出现，很可能因为这些细胞低于检测水平。另外，通气组织和胚芽鞘断裂周围的一些裂解细胞以及伊文思蓝染色的细胞中并没有发现TUNEL信号物质，我们甚至在一些裂解细胞内发现了细胞核。这类细胞的死亡机理很可能不同于衰老细胞，我们需要进一步研究DNA降解机制。

同时我们采用核酸蛋白凝胶系统分析核酸内切酶活性。研究发现，胚芽鞘发育过程中诱导产生两种内切酶，分别为Nuc-a和Nuc-b。Nuc-a需要Mg2+或Ca2+激活，在淹水的胚芽鞘中被抑制，但暴露于空气中24h后就会被诱导产生。Nuc-b需要Mg2+和Ca2+共同激活，在胚芽鞘衰老过程中被发现。由于Nuc-a是在胚芽鞘发育早期，DNA尚未发生断裂时被诱导的，它有可能参与DNA的循环利用。Nuc-b的活性与衰老过程相对应，这一发现表明Nuc-b可能在DNA片段化（由TUNEL法检测到）过程中发挥一定作用。

Thelen和Northcote发现在百日菊木质部形成过程中，有一种分子量为43kDa的核酸酶与细胞死亡密切相关。Aoyagi等人在百日菊中分离到编码43kDa核酸酶（ZEN）的cDNA。并且从大麦中分离到35kDa的核酸酶(BEN)，该酶在发芽过程中由

糊粉层分泌到胚乳。这两种酶都是S1型

脱氧核糖核酸酶（DNAase），只有Zn2+

存在时具有核酸内切酶活性。BEN和

ZEN对阳离子的需求与Nuc-b的生化特

性有显著区别，Zn2+对Nuc-b有抑制作

用。另外，Mittler和Lam发现伴随着一

种分子量为36kDa的核酸酶活性的提

高，植物对无致病力病原体的过敏性增

强，Ca2+能激活该酶而不是Mg2+,Zn2+起

抑制作用。参与植物细胞DNA片段化的

脱氧核糖核酸酶还未鉴定出来。

图9总结所示，空气中生长的胚芽

鞘经历三方面的细胞死亡：胚芽鞘断裂

开口，通气组织形成和衰老。淹水即缺

氧条件阻止了这些细胞的死亡。当把淹

水中生长的胚芽鞘转至空气中，细胞死

亡开始发生。6h后，一些薄壁组织中的

细胞崩溃死亡导致胚芽鞘断裂开口。48h

后，通气组织形成，可观察到伊文思蓝染色的死细胞。TUNEL法检测结果表明，在芽鞘衰老过程中DNA断裂，但胚芽鞘缺口打开和通气组织形成过程没有检测到。进一步分析表明，Nuc-a于24h后被诱导产生，Nuc-b于120h后被诱导产生，并且检测到DNA片段，这些都与胚芽鞘的衰老进程相吻合。

胚芽鞘对作物的初期生长非常重要，我们已证实胚芽鞘是紧密结合细胞死亡的特殊组织，胚芽鞘发育的细胞学机制还有待于进一步研究和确定。

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