实验讲义-酶制剂生产与应用

尼龙固定化木瓜蛋白酶

一、目的：

了解共价交联法固定酶的原理和步骤

二、原理

尼龙是聚酰胺物质，经HCl水解后暴露出游离NH2，NH2与戊二醛反应，尼龙即成活化载体，可与酶表面NH2反应，把酶连在尼龙上。

三、实验材料、仪器和试剂

1、材料

尼龙布(86或66)，140目，剪成3cm×3cm 2、仪器

(1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱 3、试剂

(1)18.6êCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65mol/LHCl溶液 (4) 0.2mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5)

(5)5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5

(6) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8) (7)1mg/mL木瓜蛋白酶溶液

(8) 0.5mol/L NaCl溶液 (9) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2) (10)激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液。

(11)0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。 (12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。

四、操作步骤

1、固定化酶的制备

(1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6êCl2溶液10s，再浸入18.6%水的甲醇溶液中，轻轻搅拌5min以上至尼龙发粘。取出后用水洗涤，用滤纸吸干。

(2)将尼龙布用3.65mol/L HCI溶液在室温下水解45min，用水洗至pH值中性（pH试纸检测）。

(3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。

(4)取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH值7.8)洗涤3次，洗去多余的戊二醛，吸干之后，加入5ml 1mg/mL的木瓜蛋白酶液，在室温下固定30min。 (5)从酶液中取出尼龙布，用0.5mol/L NaCl溶液(用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制)，洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。

1

2、酶活力测定

A．0.2ml 木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+1ml酪蛋白液

B．0.2ml 木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+2ml 10%三氯乙酸+1ml酪蛋白液 C. 固定化酶一张（剪碎）+2.0ml激活剂+1ml酪蛋白液

取三支试管按上述加入反应液，37℃反应15min，A、C+2ml 10%三氯乙酸。 三支试管过滤上清液到另三支试管中，以B管作空白，测试管A、C吸光值（280nm，紫外）

五、结果计算

1.酶活定义：每15min增加0.001个消光值所需酶量为1个酶活单位。 2.酶活回收=

固定化酶活?5?100%

溶液酶活?5/0.2六、注意事项

(1)尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。 (2)固定化酶溶液浓度最好为0.5～1mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL。

(3)酶活性测定的反应时间一定要准确。

实验二、有机溶济沉淀法制备大豆脲酶及其活力测定（4课时）

实验类型：综合性 实验目的：

掌握酶的提取与性质测定中的实验方法，熟悉有关酶提取与活力测定的基本原理和基本操作。

实验内容：

1．提取：（1）称取约5g人造浮石，置小烧杯中，用2%乙酸浸泡1-2分钟，倾去酸，用蒸馏水洗涤至中性，沥干备用。（2）称取约10g新鲜大豆粉，置于锥形瓶中，加上述人造浮石，加50ml32%丙酮溶液，在冰浴中持续摇动4~5min，4层纱布过滤，收集滤液。（3）将滤渣重新置于锥形瓶中，另加10ml32%丙酮，再提取一次。纱布过滤，滤液在4℃，3500r/min下离心8~10min，倾出上清液，计量体积。取1mL酶液保存，供测酶活力用。

2．沉淀酶：（1）将提取的酶液置冰浴中缓慢搅拌下，用滴管逐滴滴加2%醋酸，并不断用精密pH试纸检测pH变化，观察产生混浊现象，至pH4.9左右。置4℃10分钟。（2）4℃3500r/min离心10min，沉淀用电吹风稍微吹干，所得即为

2

脲酶粗品。称重，计算酶收得率。

3．脲酶的活力测定：脲酶的活力测定利用脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，氨与纳氏试剂反应生成黄色化合物，吸光度与氨年度成正比，可测定脲酶活力大小。

实验要求：

提取大豆脲酶，并进行收得率和脲酶的活力测定，结果计算： 1）提取制备脲酶的收得率：

酶收得率(%)?酶干重?酶干重?测酶活留取液体体积/酶液总体积100%样品重2）脲酶活力测定：式中：n为酶样品的稀释倍数

试管号 步 骤 1 2 3 （1）酶液（mL，原液或适当稀释） 0 0 1.00 （2）标准硫酸铵溶液（mL） 0 0.30 0 （3）蒸馏水（mL） 2.00 1.70 1.00 （4）10%· 三氯乙酸 (mL) 1.00 1.00 0 （5）室温平衡5 min。 （6）3%尿素（mL） 1.00 1.00 1.00 （7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5 min，立即向样品管（3号管）加10%三氯乙酸 1.00 mL，终止反应。各管摇匀后，取1.0 ml溶液置于EP管中，室温、10,000 rpm离心 5 min，吸取0.2 ml上清按步骤（8）进行反应。 （8）另取3支洁净的试管，分别对应于上述各管，进行后续反应。 ① 反应液（mL） 0.20 0.20 0.20 ② 蒸馏水（mL） 4.30 4.30 4.30 ③ 奈氏试剂（mL） 0.50 0.50 0.50 （9）各管混匀后30 min内，用分光光度计F1800测试： 比色记录A480nm A1 A2 A3

脲酶活力（U/ml）= (A3?A1)?标准管中的NH3微摩尔数

(A2?A1)?5min?酶样品毫升数?n

实验三 酸性磷酸酯酶的提取和酶活力测定

一、实验目的

1．掌握胞内酶的分离提取方法；

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2．掌握酸性磷酸酯酶的活力测定方法。 二、实验原理

酸性磷酸酯酶存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一性的水解磷酸单酯键。本实验以绿豆芽为材料，磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经酸性磷酸酯酶作用，可水解生成酚和无机磷。当有足量底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也越多。根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成1μmol产物所需要的酶量为1个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。

三、试剂与器材 1．器材

高速离心机，托盘天平，滴管，漏斗，纱布若干，滤纸若干，研钵一套，培养皿一个，100mL量筒1支，可见分光光度计，恒温水浴锅，5mL、1mL移液管各一支，试管20支，试管架一支。

2．材料

绿豆芽（当日采摘，50g ） 3．试剂

（1）酸性磷酸酯酶液

取原酶液用0.2mol/L的pH5.6乙酸盐缓冲液稀释10-20倍。 （2）5mmol/L磷酸苯二钠溶液（pH5.6）

精确称取磷酸苯二钠2.54g，加蒸馏水溶解后定容不得至100mL，即配成为100mmol/L磷酸二苯钠水溶液，密闭保存备用。用0.2mol/L的pH5.6乙酸盐缓冲液稀释20倍，即得5mmol/L磷酸苯二钠溶液（pH5.6）。

（3）0.2mol/L的pH5.6乙酸盐缓冲液 （4）Folin-酚试剂

于200mL磨口回流装置内加入钨酸钠100g、钼酸钠25g、水700mL、85%磷酸50mL以及浓盐酸100mL。微火回流10h后加入硫酸锂150g、蒸馏水50mL和溴数滴摇匀。煮沸约15min，以驱残溴，溶液呈黄色，轻微带绿色；如仍呈绿色，如重复加液体溴的步骤。冷却定容到1000mL，过滤，置于棕色瓶中可长期保存，

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使用前，用蒸馏水稀释3倍。

（5）1mol/L碳酸钠溶液 （6）0.4mmol/L酚标准溶液

精确称取分析纯的酚结晶0.94g溶于0.1mmol/L盐酸溶液中，定容至1000mL，即为酚标准贮存液，储存于冰箱中可永久保存，此时酚浓度约为0.01mol/L。使用前将上述的酚标准贮存液用蒸馏水稀释25倍，即得到0.4mmol/L酚标准溶液。

四、操作步骤

1．酸性磷酸酯酶的提取 （1）材料处理

将绿豆芽掐去根和叶得绿豆芽茎，称取50g的绿豆芽茎，在研钵中彻底研碎，室温静置30min，在培养皿中用双层纱布挤滤，得到滤液。

（2）离心

将滤液移至2支离心管中，平衡后放入离心机中，以4000r/min的速度离心20min。

（3）酶液回收

将离心管中大部分上清液转移至量筒中，少部分接近沉淀物的上清液经滤纸过滤，一并收入量筒中以测量体积，然后转移至三角瓶中，做好标记，用塑料薄膜密闭，作为“原酶液”在冰箱中保存备用。

2．酸性磷酸酯酶酶活力的测定 （1）标准曲线的制作

取试管6支，编号，空白为0号，按照下表操作。

以0号试管为空白，在可见分光光度计上680nm波长处读取各管的吸光度A680，以A680作为横坐标，酚标准溶液的体积（mL）为纵坐标作一标准曲线，此曲线应是一条直线。

0.4mmol/L酚标准溶液（mL） 0 0 1 0.1 0.2mol/L、pH5.6乙酸盐缓冲液（mL） 1 0.9 1mol/L碳酸钠溶液（mL） 5.0

5.0 5.0 5.0 0.8 0.7 2 0.2 3 0.3 4 0.4 0.6 5.0 5 5.0 0.5 5 0.5 Folin-酚试剂（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 A680值 0 摇匀，35°C保温显色10min以上 （2）酶活力测定

取2支试管，按下表编号和操作。

5mmol/L磷酸苯二钠溶液（mL） 酶液（35°C预热过的，mL）,一加入就计时 Folin-酚稀溶液（mL） A680值 0.5 1‘号试管 0．5 35°C预热2min 0 0‘号试管 0．5 精确反应10min,加入1mol/L碳酸钠溶液5mL 0.5 0.5 0’号试管加入酶液0.5mL 摇匀，35°C保温显色10min以上 0 用可见分光光度计测1‘号试管在680nm处光吸收值A680,注意加样顺序要正确，否则不能显色。

（3）酶活力的计算

用1‘号试管的A680在标准曲线上查出其在对应的酚标准应用液的体积（V，单位mL），根据公式：

酶活力=2×0.4×V×1000/10，可计算出1mL酶液中所含有的酶的活力。 五、实验报告

试管 A680 V（mL） 1mL酶液的活力 0 0 0‘ 0 1 2 3 4 5 1‘ 六、注意事项

1．酶促反应应保持在温和条件下进行，避免反应液剧烈搅拌或振荡。 2．实验前要设计好试管的加样顺序，确保反应时间的准确性。 3．酶促反应的加样顺序要正确，否则无法显色。

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Folin-酚试剂（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 A680值 0 摇匀，35°C保温显色10min以上 （2）酶活力测定

取2支试管，按下表编号和操作。

5mmol/L磷酸苯二钠溶液（mL） 酶液（35°C预热过的，mL）,一加入就计时 Folin-酚稀溶液（mL） A680值 0.5 1‘号试管 0．5 35°C预热2min 0 0‘号试管 0．5 精确反应10min,加入1mol/L碳酸钠溶液5mL 0.5 0.5 0’号试管加入酶液0.5mL 摇匀，35°C保温显色10min以上 0 用可见分光光度计测1‘号试管在680nm处光吸收值A680,注意加样顺序要正确，否则不能显色。

（3）酶活力的计算

用1‘号试管的A680在标准曲线上查出其在对应的酚标准应用液的体积（V，单位mL），根据公式：

酶活力=2×0.4×V×1000/10，可计算出1mL酶液中所含有的酶的活力。 五、实验报告

试管 A680 V（mL） 1mL酶液的活力 0 0 0‘ 0 1 2 3 4 5 1‘ 六、注意事项

1．酶促反应应保持在温和条件下进行，避免反应液剧烈搅拌或振荡。 2．实验前要设计好试管的加样顺序，确保反应时间的准确性。 3．酶促反应的加样顺序要正确，否则无法显色。

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