实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法
更新时间:2023-10-31 16:37:01 阅读量: 综合文库 文档下载
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电转法
设计方案一:
感受态制备:
1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中,30℃、250-300rpm培养过夜; 2. 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中,30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5);
3. 于4℃离心收集菌体,用25mL冰无菌水洗涤一次后,细胞用10ml冰无菌水重悬,可换成较小的离心管; 4. 加入1ml,pH7.5,10×TE缓冲液,摇晃均匀,再加入1ml 10×LiAc,旋转摇匀,于30度轻轻摇动45min;
5. 再加入0.4ml 1 mol/L DTT,并同时旋转摇动,于30度轻轻摇动15min; 6. 于4℃离心,弃上清(用枪吸),再用25mL冰无菌水洗涤;
7. 2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤,离心收集菌体,弃上清(用枪吸); 8. 每管用100ul山梨醇溶解,分装于EP管中(80ul/管),于-70℃冰箱保存。 电转化:
1.向感受态细胞中加入约5~10ug(体积小于10 ul)的DNA,用枪吹吸均匀,转移至预冷的电转杯中,静置5min;
2.擦干电转杯,电击,电击参数:1.5KV,25uF,200欧姆;
3.立即加入1ml 预冷的山梨醇,转移至EP管中,于30℃静置1h; 4.离心,弃上清,加入1mL YEPD后,于30℃、200rpm培养2h; 5.离心得菌体后,吸除550 ul上清液,然后按150 ul/板进行涂板。
说明:该方法可直接采用50或100mL体系的一步法,即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓,也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。
设计方案二:
感受态制备:
1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中,30℃、250-300rpm培养过夜; 2. 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中,30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5);
3. 于4℃,5000rpm,5min离心收集菌体,用25mL冰无菌水洗涤后,细胞重悬于8ml处理液中(处理液配方:100 mM LiAc, 10 mM DTT, 0.6 M山梨醇,10 mM Tris-HCl,pH 7.5),室温静置30min;
4. 4℃,5000rpm,5min离心收集菌体,用1.5mL 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次,离心条件一样;
5. 每管用100ul山梨醇溶解(以黄枪头能吸取为宜,菌浓低时可适量少加入山梨醇),最后以80 ul的终体积转移至EP管中(菌体太多可适当放弃部分),置于-70℃冰箱保存。 电转化:
1. 向感受态细胞中加入约3ug(体积小于10ul)的DNA,用枪吹吸均匀,转移至预冷的电转杯中,静置5min;
2. 擦干电转杯,电击,电击参数:2.0KV,25uF,200欧姆;
3. 立即加入1ml 预冷的山梨醇,转移至EP管中,于30℃静置1h;
4. 离心,弃上清,加入1mL YEPD后,于30℃、200rpm培养2h; 5. 离心得菌体后,吸除550 ul上清液,然后按150 ul/板进行涂板。
说明:处理液中的DTT是在使用前加入,其它配好后于4度保存,DTT单独于-20度保存,可配成100倍的贮备液。制备体系可按比例放大。
设计方案二特别适合于采用一步法制备感受态细胞 具体如下:
1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中或转接于50mL YEPD中,在30℃、250-300rpm 条件下培养至OD=6-10(为防止菌体老化,可将50mL培养体系提早收获细胞,取菌体时,以1mL/次,取菌两次或三次不等,使用菌浓达到预定的OD:6-10);
2. 取1mL菌液分装于EP管中,于4℃,12000rpm离心30s,弃上清; 3. 收集菌体,用预冰的无菌水洗涤两次,离心条件一样;
4. 所得菌体用1mL处理液(配方同上)于室温下处理30min;
5. 离心,弃上清,加入1ml 1M 预冷山梨醇,离心,弃上清,重复两次; 6. 最终用1M 预冷山梨醇溶解菌体至终体积为80 ul,于-70℃冰箱保存; 7. 电转方法同上。
8. 每一步的离心均30s即可,在较短的时间内制备出的感受态转化效率特别高。
备注:OD检测均为600nm,空白参比为:YEPD,高浓测定时应稀释测定。所有无菌水与山梨醇均在冰上预冷处理;在制备感受态阶段,所有离心均在4℃条件下。
醋酸锂转化法
方案一:
1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中,30℃、200rpm培养过夜;
2. 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中,30℃、250-300rpm培养约5h(OD:0.5-0.8);
3. 于4℃,5000rpm,5min离心收集菌体; 4. 25mL冰无菌水洗涤两次,离心条件一样; 5. 用1mL 0.1M LiAc悬浮,离心收集菌体;
6. 再用0.5mL 0.1M LiAc悬浮,以50 ul/管分装于EP管中,置于冰上备用; 7. 依次向上述50 ul感受态细胞中加入50% PEG3350 :240ul、1M LiCl:36ul、2mg/ml 单链DNA:50ul、转化DNA(5-10ug):50ul; 8. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约1min); 9. 30℃水浴孵育30min;
10.42℃水浴热休克20~25min;
11.13000rpm离心30s收集酵母菌体,重悬酵母于1ml YEPD培养基,30℃摇床
孵育4h;
12.离心收集沉淀菌体,取除约800 ul上清液,然后按每100 ul/板进行涨涂板。
方案二:
1、接种液体YEPD培养基,过夜培养至1-2×107cells/ml;
2、取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中,30℃、250-300rpm培养约5h(OD:0.5-0.8);
3、收集细胞,并用无菌水清洗,之后用1ml无菌水重悬,并转移到1.5ml离心管;
4、1ml TE/LiAC(10×TE[0.1 M Tris-HCI,0.01 M EDTA,pH 7.5];lO×LiAc[1 M LiAc pH 7.5)清洗细胞,然后用1×TE/LiAC重悬至2×109 cells/ml;
5、1.5ml离心管中取50u悬浮液,用1ug转化片段和50ug单链鲑鱼精DNA混合;
6、加入300ul灭菌的40%PEG溶液,剧烈混匀; 7、30度振荡培养30min; 8、42度水浴热击15min;
9、离心5s,用1ml 1×TE重悬,适当稀释后涂布于选择培养基。
附:
电转法方案二中的处量液配制方法:
1. A液成份:100 mM LiAc,0.6 M山梨醇,10 mM Tris-HCl,pH 7.5;配制量:500mL。
1.1 称取54.654g山梨醇,用适量dd无菌水溶解于500 mL容量瓶中; 1.2 事先配制1 M LiAc母液,再从LiAc母液中取50mL至1.1所述容量瓶中; 1.3 事先配好1M Tris-HCl(pH 7.5),再取5mL至1.1所述容量瓶中; 1.4 用dd无菌水定量至500mL,转移至试剂瓶中,于4℃保存。 2. B液成份(母液):1 M DTT 配制量:20mL。 2.1 称取3.09g DTT,加入到50mL小烧杯内; 2.2 加入20 mL的0.01M NaOAc(pH5.2),溶解后使用0.22um滤器过滤除菌; 2.3 适量分成小份后,-20℃保存。
3. 在使用时按每50mL菌体量用8mL处理液(A+B)。以50mL菌体为例:取A 液8mL ,再取80ul 1 M DTT 于小三角瓶中混匀,备用。
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