拉伸应变作用下成骨细胞对破骨细胞分化与凋亡的影响及其机制研究

分类号密级公开UDC 保密期限

博士学位论文

题目拉伸应变作用下成骨细胞对破骨细胞分化与凋亡

的影响及其机制研究

作者姓名李建宇

指导教师张西正研究员

培养单位军事医学科学院卫生装备研究所

专业名称军事预防医学

论文提交日期2013年5月20日

学位授予单位中国人民解放军军事医学科学院

答辩委员会主席张永亮

中国人民解放军军事医学科学院制

军事医学科学院研究生学位论文独创性声明

秉承军事医学科学院严谨的学风和科研作风，本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得军事医学科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

论文作者签字：签字日期：年月日

军事医学科学院保护知识产权声明

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（保密学位论文在解密后适用本声明）

论文作者签字：签字日期：年月日

指导教师签字：签字日期：年月日

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目录

缩略词表 (1)

中文摘要 (3)

英文摘要 (7)

第1章绪论 (13)

1.1研究背景 (13)

1.2研究目的和意义 (17)

1.3研究内容与方法 (17)

1.4课题实施方案 (20)

1.5参考文献 (22)

第2章成骨细胞与破骨细胞体外共培养体系的建立 (25)

2.1材料和方法 (25)

2.2实验结果 (28)

2.3讨论 (30)

2.4本章小结 (31)

2.5参考文献 (31)

第3章基底拉伸应变对成骨细胞增殖与分化的影响 (33)

3.1材料和方法 (33)

3.2实验结果 (36)

3.3讨论 (38)

3.4本章小结 (39)

3.5参考文献 (39)

第4章拉伸应变作用下成骨细胞对破骨细胞分化的影响 (41)

4.1材料和方法 (42)

4.2实验结果 (47)

4.3讨论 (62)

4.4本章小结 (63)

4.5参考文献 (63)

第5章拉伸应变作用下成骨细胞对破骨细胞凋亡的影响 (66)

I

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5.1材料和方法 (66)

5.2实验结果 (69)

5.3讨论 (75)

5.4本章小结 (76)

5.5参考文献 (76)

全文总结 (78)

文献综述 (79)

博士期间发表的文章 (87)

在学期间取得的成果及发表的代表性论著 (89)

作者简历 (108)

致谢 (109)

II

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1

缩略词表

英文缩写 英文全名

中文译名 ALP Alkaline phosphatase 碱性磷酸酶 BMPs Bone morphogenetic protein 骨形态发生蛋白

Caspase Cysteine-requiring aspartate protease 半胱氨酸依赖的天冬氨酸蛋白酶 Cath-K Cathepsin K 组织蛋白酶K COLI Collagen type I I 型胶原 Cyt c Cytochrome C

细胞色素C

DMEM Dulbecco minimum essential medium Dulbecco 改进的培养基 DMSO Dimethyl Sulfoxide

二甲基亚砜 ELISA Enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验 ERK Extracellular signal Regulated Kinase 细胞外信号调节激酶 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 FCM Flow cytometry

流式细胞术 HE staining Hematoxylin-eosin staining HE 染色 HRP Horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 IC Immunochemistry staining 免疫化学染色 MAPK Mitogen activated protein kinase 丝裂原活化的蛋白激酶 M-CSF Macrophage-colony stimulating factor 巨噬细胞集落刺激因子 MMP-9 Matrix metalloproteinase-9 基质金属蛋白酶9 MTT Methyl thiazolyl tetrazolium 四氮唑盐 NF-κB Nuclear factor kappa B 核因子κ B OB

Osteoblast

成骨细胞

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OC Osteoclast 破骨细胞

OCN Osteocalcin 骨钙素

OD Optical density 光密度

OP Osteoporosis 骨质疏松症

OPG Osteoprotegrin 骨保护素

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳

PBS Phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液

PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应

PI Propidium iodide 碘化丙啶

PVDF Polyvinylidene difluoride 聚偏二氟乙烯

RANK Receptor activator of NF-κB核因子κB受体活化因子RANKL Receptor activator of NF-κB Ligand 核因子κB受体活化因子配基SDS Sodium dodecyl sulphate 十二烷基硫酸钠

SEM Scanning electron microscope 扫描电子显微镜

TB Toluidine blue 甲苯胺蓝

TEMED Tetramethylethylenediamine 四甲基乙二胺

TNF Tumor necrosis factor 肿瘤坏死因子

TRAP Tartrate-resistant acid phosphatase 抗酒石酸酸性磷酸酶

Tris Trishydroxymethylaminomethane 三羟甲基氨基甲烷

μεMicrostrain 微应变

1α,25(OH)2 D31α,25-dihydroxyvitamin D31α,25-二羟维生素D3

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拉伸应变作用下成骨细胞对破骨细胞分化与凋亡的影响

及其机制研究

中文摘要

研究背景和目的

骨骼是机体中重要的承重组织，力学刺激下的骨组织主要通过动态的骨重建过程来调节其新陈代谢，从而适应新的力学环境。骨重建过程是人类进化的一种重要的生理反应，可以减少骨组织中骨量的流失，并保证骨组织结构的完整性。骨重建过程受到机体中多种因素的调控，如遗传因素、激素水平、代谢环境及力学刺激等。大量的研究表明，力学载荷在骨重建过程中发挥了重要作用：生理性动态载荷可以促进骨组织形成，而缺乏这种力学刺激会导致骨量的大量流失，如废用性骨质疏松等。成骨细胞和破骨细胞是力学环境下骨重建过程中的关键效应细胞，其中成骨细胞主要活性为促进骨形成，而破骨细胞主要活性为促进骨吸收。在不同的力学加载条件下，成骨细胞和破骨细胞均可直接感受力学信号，并转化为不同的生物学信号，导致骨重建过程向骨形成或骨吸收方向发展，从而引起骨量的重新分配和骨结构的重新排布。

目前认为，骨组织的力学生物学效应主要通过骨重建过程中成骨细胞与破骨细胞间的功能转化来进行调节，但关于力学载荷下成骨细胞与破骨细胞间的相互作用及其调控机制尚不清楚。因此，本研究通过建立成骨细胞与破骨细胞的体外共培养体系，观察不同加载强度的拉伸应变作用下，成骨细胞对破骨细胞分化与凋亡的影响，并探讨力学载荷下成骨细胞调控破骨细胞分化、凋亡的作用机制。研究内容与方法

(1) 建立成骨细胞与破骨细胞的体外共培养体系。

采用MC3T3-E1成骨样细胞株与RAW264.7破骨前体细胞株，经10-8 mol/L的1α,25(OH)2维生素D3(1α,25(OH)2D3)及50 ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)作用，进行体外成骨细胞与破骨细胞的诱导分化，并利用Transwell小室(口部直径2.4cm、底部面积4.67cm2、底膜为0.4μm孔径的聚酯半透膜)建立成骨细胞与破骨细胞的共培养体系。共培养6 d后，通过细胞活性(MTT)实验、碱性磷酸酶(ALP)活力测定及苏木素-伊红(HE)染色鉴定共育体系中成骨细胞的增殖和分化活性；通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、甲苯胺蓝(TB)染色、TRAP活性测定及扫描电镜技术(SEM)鉴定共育体系中破骨细胞的分化活性及骨吸收功能。

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(2) 基底拉伸应变对成骨细胞增殖与分化的影响。

采用四点弯曲力学加载装置，对共育体系中成骨细胞施加拉伸刺激，加载条件为0.5 HZ、1 h/天、连续3 d，根据不同的加载强度将培养细胞分为0 με、2500 με、5000 με三组，通过成骨细胞的MTT细胞活性实验、ALP活性测定及ALP染色观察不同加载强度的拉伸应变对成骨细胞的增殖与分化活性的影响。

(3) 拉伸应变作用下成骨细胞对破骨细胞分化的影响及其调控机制。

采用四点弯曲力学加载装置，对共育体系中成骨细胞施加拉伸刺激，加载条件为0.5 HZ、1 h/天、连续3 d，根据不同的加载强度将培养细胞分为0 με、2500 με、5000 με三组，通过破骨细胞的HE染色、TRAP染色、TB染色及TRAP活性测定，观察不同加载强度的拉伸应变作用下成骨细胞对破骨细胞分化活性的调控作用；通过骨板中骨吸收陷窝的检测(TB染色)及破骨细胞中组织蛋白酶-K(Cath-k)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的活性测定(免疫化学染色、ELISA法)，观察不同加载强度的拉伸应变作用下成骨细胞对破骨细胞骨吸收功能的影响。

采用四点弯曲力学加载装置，对共育体系中成骨细胞施加拉伸刺激，加载条件为0.5 HZ、1 h/天、连续3 d，根据不同的加载强度将培养细胞分为0 με、2500 με、5000 με三组，通过RT-PCR、Western blot及免疫化学染色方法，检测不同加载强度的拉伸应变作用下成骨细胞RANKL、OPG及EphA2 的表达情况，同时观察破骨细胞中EphA2 的表达及NF-κB通路中信号分子p65的磷酸化水平，探讨不同加载强度的拉伸应变作用下成骨细胞调控破骨细胞分化及骨吸收功能的分子机制。

(4) 拉伸应变作用下成骨细胞对破骨细胞凋亡的影响及其调控机制。

采用四点弯曲力学加载装置，对共育体系中成骨细胞施加拉伸刺激，加载条件为0.5 HZ、1 h/天、连续3 d，根据不同的加载强度及RANKL干预因子将培养细胞分为0 με、2500 με、2500 με+RANKL、5000 με、5000 με+RANKL五组。通过流式细胞术，检测各实验组中破骨细胞的细胞凋亡率；通过Hoechst染色，观察各实验组中破骨细胞的凋亡形态学变化；通过Western blot技术，检测各实验组中破骨细胞Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表达情况，观察不同加载强度的拉伸应变作用下成骨细胞调控破骨细胞凋亡的分子机制。

研究结果

(1) 成骨细胞与破骨细胞体外共育体系的建立

与单培养组比较，共培养组成骨细胞在MTT实验中的吸光度显著下降(P<0.01)；共培养组成骨细胞ALP活性显著升高(P<0.01)；HE染色后，发现共培

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养组成骨细胞无限增殖速度减慢，细胞数量减少。与单培养组比较，共培养组破骨细胞TRAP活性显著升高(P<0.01)，TRAP染色明显增强；共培养组可见多个成熟的破骨细胞，细胞体积增大，胞浆伸展、空泡化，并有多个细胞核；共培养组骨片上可见多个圆形的骨吸收陷窝，凹陷明显，与周边骨组织界限清楚。此结果显示，共育体系中成骨细胞与破骨细胞的分化活性均明显增强。

(2) 基底拉伸应变对成骨细胞增殖与分化的影响。

对成骨细胞施加基底拉伸应变3 d后，与0 με组比较，2500 με组可显著提高成骨细胞的增殖活性，表现为MTT实验中OD值显著升高(P<0.05)，2500 με组可促进成骨细胞ALP活性的升高(P<0.05)；而5000 με组则降低成骨细胞的增殖活性(P<0.05)与ALP活性(P<0.05)；各实验组中成骨细胞ALP染色结果与ALP定量分析结果一致。此结果显示，生理性拉伸应变可促进成骨细胞的增殖与分化，而超生理性拉伸应变则抑制成骨细胞的增殖与分化。

(3) 拉伸应变作用下成骨细胞对破骨细胞分化的影响及其调控机制。

对成骨细胞施加拉伸应变3 d后，与0 με组比较，2500 με组可显著抑制破骨细胞的分化和骨吸收功能，表现为多核破骨细胞的数量减少，TRAP活性降低(P<0.05)，TRAP染色强度下降(P<0.01)，骨片中骨吸收陷窝的面积减小(P<0.01)，破骨细胞中Cath-k及MMP-9的表达降低(P<0.05或P<0.01)；5000 με组中破骨细胞的TRAP活性、骨吸收陷窝面积及Cath-k、MMP-9的表达也显著下降(P<0.01)。此结果显示，拉伸应变作用成骨细胞后，抑制了破骨细胞的分化与骨吸收功能。

对成骨细胞施加拉伸应变3 d后，与0 με组比较，2500 με组可显著升高成骨细胞中OPG mRNA及蛋白表达水平(P<0.01)，而对RANKL mRNA及蛋白表达无显著影响，由于OPG的高表达，2500 με组可显著上调成骨细胞中OPG/RANKL 表达的比值(P<0.01)；与0 με组比较，5000 με组可显著升高成骨细胞中OPG mRNA 及蛋白表达水平(P<0.05)，同时升高RANKL mRNA及蛋白表达水平(P<0.05)，且上调成骨细胞中OPG/RANKL表达的比值(P<0.05)；与0 με组比较，2500 με及5000 με组对成骨细胞中EphA2的表达均无显著影响。此结果显示，拉伸应变作用成骨细胞后，对破骨细胞的抑制作用与上调成骨细胞OPG/RANKL表达的比值有关。

对成骨细胞施加拉伸应变3 d后，与0 με组比较，2500 με组可降低破骨细胞中p65磷酸化蛋白(p-p65)的表达(P<0.05)，且OPG重组因子干预后可进一步抑制p-p65的表达(P<0.01)，并降低TRAP活性(P<0.01)；与0 με组比较，2500 με及5000 με组对破骨细胞中EphA2的表达均无显著影响。此结果显示，拉伸应变作用成骨细胞后，对破骨细胞的抑制作用与下调破骨细胞中p65的磷酸化水平有关。

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(4) 拉伸应变作用下成骨细胞对破骨细胞凋亡的影响及其调控机制。

对成骨细胞施加拉伸应变3 d后，与0 με组比较，2500 με组可升高破骨细胞的凋亡率(P<0.01)；与2500 με组比较，2500 με+RANKL组则降低破骨细胞的凋亡率(P<0.05)；与0 με组比较，5000 με组可升高破骨细胞的凋亡率(P<0.01)；与5000 με组比较，5000 με+RANKL组则降低破骨细胞的凋亡率(P<0.01)；各组破骨细胞的凋亡形态学变化与凋亡率的检测结果一致。此结果显示，拉伸应变作用成骨细胞后，促进了破骨细胞的凋亡发生，RANKL因子干预后可抑制破骨细胞的凋亡。

对成骨细胞施加拉伸应变3 d后，与0 με组比较，2500 με组可显著促进破骨细胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表达(P<0.01)；与2500 με组比较，2500 με+RANKL组则显著抑制破骨细胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)；与0 με组比较，5000 με组可显著促进破骨细胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表达(P<0.01)；与5000 με组比较，5000 με+RANKL组则显著抑制破骨细胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。此结果显示，拉伸应变作用成骨细胞后，对破骨细胞的促凋亡机制与激活破骨细胞中Fas/FasL介导的细胞凋亡通路有关。

研究结论

(1) Transwell共育体系中成骨样细胞的无限增殖能力减弱，而分化活性增强，同时破骨前体细胞被诱导分化为成熟的破骨细胞，并具有骨吸收功能。该共育体系可用于探讨力学环境下骨重建中成骨细胞与破骨细胞间信号调控机制的实验研究。

(2) 生理性拉伸应变(2500 με)可促进成骨细胞的增殖和分化，继而抑制共育体系中破骨细胞的分化及骨吸收功能，而超生理性拉伸应变(5000 με)则抑制成骨细胞的增殖和分化，同时抑制共育体系中破骨细胞的分化及骨吸收功能。不同加载强度的拉伸应变作用下，成骨细胞抑制共育体系中破骨细胞分化及骨吸收功能的作用机制，可能与上调成骨细胞中OPG/RANKL表达的比值，继而抑制破骨细胞中NF-κB 信号通路的激活有关。

(3) 生理性拉伸应变(2500 με)作用成骨细胞后，可促进共育体系中破骨细胞的凋亡发生，超生理性拉伸应变(5000 με)作用成骨细胞后，亦可促进共育体系中破骨细胞的凋亡发生。不同加载强度的拉伸应变作用成骨细胞后，对共育体系中破骨细胞的促凋亡机制，可能与上调成骨细胞中OPG/RANKL表达的比值，继而激活破骨细胞中Fas/FasL介导的细胞凋亡通路有关。

关键词：拉伸应变；骨重建；共培养；成骨细胞；破骨细胞；分化；凋亡

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The Regulatory Effect and Mechanism of Strain-loaded Osteoblasts on Osteoclasts Differentiation and Apoptosis

Abstract

Background and objective

The skeleton forms the essential load-bearing tissue that is dynamically remodeled throughout one’s lifetime. Bone remodeling, a critical biological process for maintaining bone density and osseous integrity, is dependent on genetic, hormonal, metabolic, and age-related factors as well as mechanical forces. Growing evidence suggests that mechanical stimuli play a pivotal role in bone remodeling because physiological dynamic loading can promote bone formation, whereas the absence of mechanical forces can lead to the loss of bone mass. The mechanical response of bone is mainly affected by the coupled activities of osteoblasts and osteoclasts, two specialized cells responsible for bone formation and resorption, respectively. Additionally, an imbalance between the functions of these cells can interrupt their physiological effects on bone tissue, thereby causing many bone diseases, such as osteoporosis, osteopetrosis, and arthritis.

In previous studies, research has focused of the mechanical responses of osteoblasts and osteoclasts, but the intercellular communication between these cells during mechanical loading has not been fully elucidated. Therefore, the purpose of this study was to examine the hypothesis that osteoblast-osteoclast communication is involved in mechanical responses, and we therefore investigated the effect of strain-loaded osteoblasts on osteoclastic differentiation and bone resorption in a co-culture system.

Methods

(1) Establishment of a co-culture system between osteoblast and osteoclast

Mouse osteoblastic cells MC3T3-E1 and mouse monocyte/macrophage cells RAW264.7, treated with 1α,25(OH)2 D3 (10-8mol/L) and M-CSF (50ng/ml), were used to induce the differentiation of osteoblasts and osteoclasts in a co-culture system with transwell culture plates (6 well size inserts with 0.4 m pores only for passage of small soluble factors). After co-culture for 6 days, cell viability, activities of alkaline

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phosphatase (ALP) and HE staining of osteoblasts were determined, and for osteoclasts, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining, toluidine blue (TB) staining, TRAP activities assay and technique of scanning electron microscope (SEM) were preformed.

(2) Effect of mechanical strain on osteoblast proliferation and differentiation

Uniaxial and homogeneous mechanical tension was generated using a specially designed four-point bending device. In the present study,the MC3T3-E1 cells in the co-culture system were subjected to a mechanical strain of 2500 με or 5000 με at 0.5 Hz once per day with a periodicity of 1 h/day for 3 days. Simultaneously, the control cells were incubated under the same conditions but without mechanical stimuli. To investigate the effect of mechanical strain on osteoblast proliferation and differentiation, cell viability, activities of ALP and ALP staining were determined.

(3) Effect of strain-loaded osteoblast on osteoclast differentiation and its mechanism

Uniaxial and homogeneous mechanical tension was generated using a specially designed four-point bending device. In the present study,the MC3T3-E1 cells in the co-culture system were subjected to a mechanical strain of 2500 με or 5000 με at 0.5 Hz once per day with a periodicity of 1 h/day for 3 days. Simultaneously, the control cells were incubated under the same conditions but without mechanical stimuli. To investigate the effect of strain-loaded osteoblast on osteoclast differentiation, HE saining, TRAP staining and TRAP activities assay of osteoclasts were performed. To investigate the effect of strain-loaded osteoblast on osteoclast bone resorption, TB staining for resorption lacunae and the expressions of Cath-k and MMP-9 in osteoclasts were evaluated.

Uniaxial and homogeneous mechanical tension was generated using a specially designed four-point bending device. In the present study,the MC3T3-E1 cells in the co-culture system were subjected to a mechanical strain of 2500 με or 5000 με at 0.5 Hz once per day with a periodicity of 1 h/day for 3 days. Simultaneously, the control cells were incubated under the same conditions but without mechanical stimuli. To investigate the detailed mechanism involved in the regulatory role of strain-loaded osteoblast on osteoclast differentiation, the expressions of OPG, RANKL, and EphA2 in osteoblasts and the expressions of p-p65 and EphA2 in osteoclasts were detected by RT-PCR, Western blot and immunochemistry staining.

(4) Effect of strain-loaded osteoblast on osteoclast apoptosis and its mechanism

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Uniaxial and homogeneous mechanical tension was generated using a specially designed four-point bending device. In the present study,the MC3T3-E1 cells in the co-culture system were subjected to a mechanical strain of 0 με, 2500 με and 5000 μεrespectively, at 0.5 Hz once per day with a periodicity of 1 h/day for 3 days. In addtion, the recombinant RANKL was added to the culture media of 2500 μεand 5000 μεgroups before application of mechanical stretch. To investigate the effect of strain-loaded osteoblast on osteoclast apoptosis and its mechanism, flow cytometry, Hoechst staing and the expressions of Fas, FasL, Casepase-8 and Caspase-3 in osteoclasts were determined.

Results

(1) Establishment of a co-culture system between osteoblast and osteoclast

As for osteoblast proliferation, the results of cell viability showed that the OD values of pre-osteoblasts in the co-culture system were attenuated (P<0.01), compared with that of the pre-osteoblasts cultured alone. With regard to osteoblast differentiation, the ALP activities of pre-osteoblasts in the co-culture system were enhanced significantly (P<0.01), compared with that of the pre-osteoblasts cultured alone.

As for osteoclast differentiation and bone resorption function, more multinuclear cells with the characteristics of abundant cytoplasm and vacuolation, were observed in the co-culture system compared with pre-osteoclasts cultured alone. Moreover, TRAP activities in the culture media of co-culture system were increased remarkably (P<0.01), compared with that in the media with only pre-osteoclasts culture. In addition, more resorption pits on bone slices with the characteristics of sealing zone and actin rings, were found in the co-culture system compared with pre-osteoclasts cultured alone.

(2) Effect of mechanical strain on osteoblast proliferation and differentiation

After application of mechanical strain on osteoblasts for three days, the OD values and ALP activities of osteoblasts in 2500 μεgroup were increased (P<0.05), whereas the OD values and ALP activities of osteoblasts in 5000 μεgroup were decreased (P<0.05) compared with that in 0 με group.

(3) Effect of strain-loaded osteoblast on osteoclast differentiation and its mechanism

To explore the influence of strain-loaded osteoblasts on osteoclast differentiation and bone resorption, we first quantified TRAP activities in osteoclasts and evaluated the

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number of mature osteoclasts by counting TRAP-positive multinucleated cells. The results showed that the strain-conditioned medium in 2500 μεgroup remarkably inhibited the differentiation of pre-osteoclastic cells into mature osteoclasts and decreased the TRAP activities (P<0.05). Second, we determined the resorptive activity of osteoclasts by counting the area of resorption lacunae in the bone slices and found that the strain-conditioned medium in 2500 μεgroup significantly inhibited the formation of resorption pits (P<0.01). Third, we examined the expressions of Cath-K and MMP-9 and found that the levels of Cath-K and MMP-9 in osteoclasts were both depressed by the strain-conditioned medium in 2500 μεgroup (P<0.05 or P<0.01). Moreover, the strain-conditioned medium in 5000 με group inhibited the differentiation and bone resorption function of osteoclasts compared with that in 0 με group.

To investigate the mechanism involved in the regulation of osteoclast differentiation and bone resorption by strain-stimulated osteoblasts, we focused on the expression changes of OPG and RANKL in osteoblasts. The results showed that the expression levels of OPG mRNA and protein were both significantly increased in 2500 μεgroup (P<0.01). However, the expression levels of RANKL were not changed in 2500 με group. Although the expression levels of RANKL were not remarkably affected by the mechanical strain, the ratio of OPG to RANKL expressions was significantly up-regulated due to the enhanced OPG levels in 2500 με group (P<0.01). In addition, the expressions of OPG and RANKL were both significantly increased (P<0.05) and the ratio of OPG to RANKL expressions was up-regulated in 5000 μεgroup (P<0.05), compared with that in 0 με group.

To explore the potential role of OPG in the anti-osteoclastogenesis effect of loaded osteoblasts, the cells were pretreated with recombinant OPG (50ng/ml) before the application of mechanical stretch (2500 με). The results showed that the expression of p-p65 (phosphorylation of p-p65) in osteoclasts, an activation signal for NF-κB pathway, was significantly down-regulated by the application of mechanical stretch or recombinant OPG (P<0.05), resulting in the decreased TRAP activities (P<0.01). The combined application of mechanical loading and recombinant OPG can strengthen the inhibitory effect (P<0.01). Moreover, the expressions of EphA2 in osteoblasts and osteoclasts were not changed in 2500 με and 5000 με groups, compared with that in 0 με group.

(4) Effect of strain-loaded osteoblast on osteoclast apoptosis and its mechanism

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After application of mechanical strain on osteoblasts for three days, the apoptosis ratio of osteoclasts in 2500 μεand 5000 μεgroups were both increased (P<0.01), compared with that in 0 με group. Moreover, the apoptosis ratio of osteoclasts in 2500 με and 5000 με groups were both decreased (P<0.05 or P<0.01) after the treatment of recombinant RANKL factor. The results of apoptotic morpholgical observation in osteoclasts were coincident with osteoclastic apoptosis ratio.

After application of mechanical strain on osteoblasts for three days, the expressions of Fas, FasL, Casepase-8 and Caspase-3 in osteoclasts in 2500 με and 5000 με groups were both increased (P<0.01), compared with that in 0 μεgroup. Furthermore, the expressions of Fas, FasL, casepase-8 and caspase-3 in osteoclasts in 2500 με and 5000 με groups were both decreased (P<0.05 or P<0.01) after the treatment of recombinant RANKL factor.

Conclusions

(1) In the Transwell co-culture system, the proliferation activities of osteoblast-like cells are attenuated, whereas the differentiation activities of osteoblast-like cells are promoted, and simultaneously the pre-osteoclastic cells are induced to differentiate into the mature osteoclasts with bone resorbing function. Thus, this co-culture system can be applied in the study of osteoblast-osteoclast communication in bone remodeling during mechanical loading.

(2) Physiological mechanical strain (2500 με) directly activates osteoblasts and the strain-conditioned medium inhibits the differentiation and bone resorption function of co-cultured osteoclasts. Pathological mechanical strain (5000 με) directly inhibits osteoblast activation and the strain-conditioned medium also inhibits the differentiation and bone resorption function of co-cultured osteoclasts. The mechanism involved in the anti-osteoclastogenesis effect of strain-loaded osteoblasts is mainly dependent on the up-regulation of the OPG/RANKL expressions ratio in osteoblasts, leading to the inactivation of NF-κB signaling pathway in osteoclasts.

(3) Physiological mechanical strain (2500 με) directly activates osteoblasts and the strain-conditioned medium promotes the apoptosis of co-cultured osteoclasts. Pathological mechanical strain (5000 με) directly inhibits osteoblast activation and the strain-conditioned medium promotes the apoptosis of co-cultured osteoclasts. The detailed mechanism involved in the promotive effect of strain-loaded osteoblasts on

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osteoclast apoptosis is greatly associated with the up-regulation of the OPG/RANKL expressions ratio in osteoblasts, resulting in the activation of Fas/FasL signaling pathway in osteoclasts.

Key words：mechanical strain; bone remodeling; co-culture; osteoblast; osteoclast; differetiation; apoptosis;

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军事医学科学院博士学位论文 13 第1章 绪论

1.1研究背景

骨骼系统的主要作用是担负机体的承重和运动功能，为机体提供力学稳定性，在承重和运动中骨组织的结构决定了骨所能承受的应力，同时骨的形态和结构也会随着应力的变化而改变，从而使机体适应不同的力学环境[1]。近年来，许多科研工作者进行了骨组织力学生物学方面的研究，并尝试通过各种科学假设揭示骨组织的力学响应机制，这些研究理论包括“骨重建理论”、“骨显微裂纹理论”、“应变能-骨密度理论”以及“力学稳态理论”等，其中“力学稳态理论”是由科学家Frost 在1987年提出的(图1)，此理论认为骨组织在生长、发育的不同阶段会受到不同方式、不同类型的力学刺激，在不同的力学刺激作用下骨组织的自身形状及内部微结构会发生相应的改变，骨组织的质量、骨细胞的数量及分布也会随着外界力学环境的变化而改变，目前此理论已得到了学术界的广泛认同[2]。但这一理论还仅是针对人类骨骼在各种生理或超生理条件下的生长、发育、损伤、修复及重建的一种科学假设，关于各种力学环境下骨组织的力学生物学效应及其具体的分子调控机制尚未完全阐明。关于骨组织细胞如何感受外界的力学刺激，如何将力学信号转化为生物学信号，又如何通过各种分子信号通路调控骨组织细胞的生物学功能及力学特性等众多方面的问题，还需要大量的研究探索。因此，我们课题组试图通过动物、组织、细胞及分子等多个层面，观察骨组织细胞的在不同力学环境下的生物学反应现象，并进一步探索力学环境下骨重建的生物学反应机理，从而为提高和完善临床上各种骨组织相关疾病的预防策略和诊治手段提供坚实的理论基础和实验依据。

图1 力学稳态理论示意图

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骨质疏松症(Osteoprosis, OP)是目前公认的一类严重损害人体健康，影响人们生活质量的骨组织代谢性疾病，其发病特点是机体的骨量减少，骨脆性增加，骨折风险性增大[3]。OP可以发生在不同年龄阶段的人群中，其病因与许多生物学及非生物学因素有关，包括内分泌、代谢及力学因素等[4]。目前认为，在OP的发病中骨重建过程的调节失衡可能发挥了关键作用。骨重建的失衡是由于骨代谢过程中骨吸收环节与骨形成环节之间的平衡被破坏，其中骨吸收过程占据了主导优势，从而导致骨量的不断流失、骨组织结构的疏松分布[5]。

骨重建过程是机体中一种重要的生物学反应，在这一过程中骨骼局部的旧骨被不断的去除，取代它的是不断形成的新骨。骨重建是骨组织中一种成熟的代谢替换机制，能够改善骨组织在各种生理、病理条件下形成的微损伤，保持骨组织在各种力学环境下生物力学特性的稳定，从而保证骨骼正常的承重和运载功能[6]。研究发现，在骨重建过程中骨组织细胞的形状、大小、数量及其结构均会发生明显改变，这些变化主要取决于两方面因素：非生物力学因素(遗传、代谢及激素因素)和生物力学因素(包括流体剪切力、拉伸应力、压缩应力)。研究表明[7]，机体中力学环境的严重缺失会导致骨量的大量流失、骨结构的疏松分布，而适度的动态力学载荷则能够促进骨组织的形成，促进骨细胞的增多及骨基质的矿化。通常在生理状态下，骨组织会处于最优的力学环境，骨重建中骨吸收和骨形成过程在力学载荷调节下会达到一种动态平衡，从而保持骨组织力学性能的稳定。而当骨骼的力学环境发生变化时，尤其是超生理性或病理性力学环境下，这种骨重建的动态平衡将被打破，骨组织细胞的增殖和分化活性将受到影响，导致一系列骨组织病理性症状的出现。如长期卧床的病人由于失去日常的肢体活动，会导致机体骨骼受到的力学刺激大幅度减少，从而骨吸收过程占据骨重建中的主导地位，造成骨量的大量丢失，导致废用性骨质疏松症的发生[8]。另外，失重性骨质疏松症也是一类由于缺少必要的重力环境导致的骨质疏松性疾病，如宇航员在太空中长期生活和工作会导致骨量的迅速流失，从而增加了骨折发生的风险性，防治宇航员的失重性骨质疏松症一直是世界范围内研究的重要课题[9]。

目前，关于骨组织细胞的力学生物学响应的具体机制还不清楚。成骨细胞和破骨细胞是骨组织中特有的两种细胞，在各种力学刺激和细胞因子的影响下作用于骨组织，导致骨重建过程向骨形成或骨吸收方向发展，是骨重建过程中的重要核心细胞。在不同的力学加载条件下，成骨细胞和破骨细胞均可直接感受力学信号，并转化为不同的生物学信号，导致骨量的重新分配和骨结构的重新排布。骨重建过程中破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成之间，可通过多种细胞因子相互调控，主要包括RANKL-RANK、EphB4-EphrinB2等信号通路[10,11]。因此，针

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对骨重建过程中成骨细胞、破骨细胞的力学生物学响应机制的研究，对于探讨骨重建在力学环境下的调控机制及揭示骨质疏松症的发病机制都具有重要意义。

成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞，是骨重建过程中的关键效应细胞，其增殖活性和分化功能直接反映了骨组织生长、发育的状态。成骨细胞和它的前体细胞对力学刺激均十分敏感，可以将力学信号转化为生物学信号，继而影响骨形成过程，在骨组织损伤的修复及重塑中发挥重要作用[12]。成骨细胞的力学生物学效应受到多种生物活性因子的调控，如前列腺素2(PGE2)、骨保护素(OPG)、核因子κB受体活化因子配基(RANKL)及骨形态发生蛋白(BMPs)等[13]。其中BMPs是骨基质分泌的一种糖蛋白，属于转化生长因子-β超家族成员，是促进成骨细胞分化的重要活性因子，在骨重建的骨形成过程中发挥重要的调控作用。研究显示，BMPs 可以在体内诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞和软骨细胞，促进新骨的形成[14]。另外，力学环境下成骨细胞中BMPs的表达明显增加，提示BMPs及其调控的信号通路参与了成骨细胞的力学生物学响应过程[15]。

目前认为，BMPs的细胞内信号通路主要包括Smad通路和非Smad通路两类。其中，BMPs-Smad通路中Smad蛋白被BMPs激活后，进入细胞核内调控骨形成相关基因的表达活化。本课题组前期实验发现，基底拉伸应变可以上调BMP-2和BMP-4的表达，从而激活Smad1和Smad5信号通路[16]。在非Smad信号通路中，p38MAPK通路和NF-κB通路被认为是成骨细胞力学响应过程中重要的调控因素，可以影响成骨细胞中BMPs的表达[17]。本课题组前期工作发现，基底拉伸应变可以激活成骨细胞中p38MAPK和NF-κB通路，从而上调BMP-2和BMP-4的表达，促进骨生成相关基因的表达[18]。RANKL是成骨细胞分泌的一种重要调控因子，它可以与破骨前体细胞中相应的受体RANK结合，调控破骨细胞的分化成熟[19]。而OPG作为RANKL的拮抗受体，可以阻断RANKL下游通路的活化，抑制破骨细胞的分化与骨吸收功能[20]。研究发现[21]，力学加载条件下，成骨细胞的OPG/RANKL表达比值会发生明显改变，从而调控力学环境下的骨重建平衡。另外，力学刺激还可以通过激活ERK1/2途径，促进成骨细胞的增殖和分化[22]。

破骨细胞来源于骨髓造血干细胞，属于单核巨噬细胞系的骨组织细胞，其前体细胞可诱导分化为多核的成熟破骨细胞，具有降解骨基质，促进骨吸收的功能[23]。当破骨细胞的骨吸收功能亢进时，会造成骨质疏松症的发生，而当破骨细胞的骨吸收功能严重缺失时，则会造成骨硬化症的发生[24]。虽然破骨细胞的体外分离与培养具有一定的难度，但是近些年在破骨细胞的培养及分化机制研究方面已取得了突破性进展。目前人们尝试了破骨细胞的多种体外培养方法，包括动物长骨机械分离法及骨髓基质干细胞诱导法等，这些方法的缺点是需要从动物体内获

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取细胞，操作繁琐且无法保证破骨细胞的纯度。RAW264.7细胞系是小鼠来源的破骨前体细胞，被认为是处于晚期分化阶段的破骨前体细胞，在体外经活性因子诱导后可分化为具有骨吸收功能的成熟破骨细胞，便于各种力学环境下破骨细胞的形态及功能的研究[25]。关于破骨细胞的形成机制，目前认为破骨细胞的增殖与分化主要依赖于一种肿瘤坏死因子家族的细胞因子RANKL以及巨噬细胞集落刺激因子M-CSF的诱导活性，其中M-CSF可以促进破骨细胞前体细胞的存活与增殖，而RANKL的功能主要是促进破骨细胞动态的分化过程，包括前体细胞的融合及细胞核的分裂等[26]。另外，多种细胞因子参与了破骨细胞的骨吸收功能的调控，包括肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)6、NF-κB及c-FOS等[27]。研究表明[28]，破骨细胞是力学环境下的一种重要效应细胞，适度的力学刺激可以直接抑制破骨细胞的分化活性，干扰其发挥骨吸收功能，从而导致骨重建过程向骨形成方向发展，反之失去力学环境会促进破骨细胞的分化成熟，导致骨吸收功能的亢进，引起骨质疏松症的发生。本课题组前期研究发现，不同强度的力学载荷会引起破骨细胞发生不同的力学生物学反应：低强度的生理性拉伸应变抑制破骨细胞的分化，而高强度的超生理性拉伸应变则促进破骨细胞的分化[29]。

目前认为，骨组织的力学生物学效应主要通过骨重建过程中成骨细胞与破骨细胞之间的功能转化来进行调节，但关于力学载荷下成骨细胞与破骨细胞间的相互作用及其调控机制尚不清楚。研究表明，单独培养的成骨细胞或破骨细胞，与共培养的细胞相比在细胞功能表达上有明显不同。共培养模式正在越来越多的被探索，但目前“成骨细胞-破骨细胞”的共育体系还不完善，无法用于骨组织的力学生物学研究。

国内外学者建立的成骨细胞与破骨细胞的共育模型主要包括两种方式：直接接触与间接接触。直接接触就是把成骨细胞和破骨细胞直接混杂在一起培养，通过细胞突触间相互接触，增加细胞间信号传导的过程[30]。史风雷等[31]将成骨细胞与破骨细胞混在一起培养, 观察在体外成骨细胞与破骨细胞在功能和结构上的交互作用。本课题组在前期也尝试进行了成骨细胞与破骨细胞的直接混合培养，结果发现这种培养方式的缺点在于成骨细胞的生长速度过快，在3 d左右就会形成单层覆盖，从而造成破骨细胞的生长劣势以致大量消失，更无法诱导大量破骨细胞的分化成熟，因此不利于长期的共培养研究，而且两种细胞直接混合仅能进行细胞形态学观察，进行分子生物学检测将具有较高难度。间接接触是指细胞虽然在同一个培养环境下，但细胞并不直接接触，而是通过细胞分泌的各种活性物质影响对方的生物学功能[32,33]。目前间接接触的共育模型主要采用上下两层的培养方式，这一体系具有培养上清液能够充分交流，而细胞无法自由通过的特点，而且

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培养体系的两种细胞都可以在显微镜下进行清晰观察[34]。鲁秀敏等[35]在培养皿中以金属网作为支架建立成骨与破骨细胞的上下两层培养体系，发现在不同的培养阶段可以提取两种细胞的RNA与蛋白质，在分子水平检测相关基因的表达情况。但这种共育模型也存在一定的缺陷：如果上层的细胞贴壁不牢固，会脱落到下层细胞的培养室中，从而造成两种细胞的直接接触。因此，本课题主要采用Corning 公司的Transwell小室替换金属网支架，建立体外成骨细胞—破骨细胞的共培养体系，此共育体系即可保证成骨细胞与破骨细胞间各种活性因子的交流，又可保证两种细胞间的绝对隔离，从而利于研究力学环境下成骨细胞与破骨细胞间的相互作用及其调控机制。

1.2研究目的和意义

成骨细胞和破骨细胞是骨组织中特有的两种细胞，是力学环境下骨重建过程中的关键效应细胞。在不同的力学加载条件下，成骨细胞和破骨细胞均可直接感受力学信号，并转化为不同的生物学信号，导致骨重建过程向骨形成或骨吸收方向发展，从而引起骨量的重新分配和骨结构的重新排布。本课题组的前期研究表明，适当的力学刺激可以影响成骨细胞的骨形成功能，亦可调节破骨细胞的骨吸收功能，并且这些调控作用与力学加载强度密切相关。

目前认为，骨组织的力学生物学效应主要通过骨重建过程中成骨细胞与破骨细胞的功能转化来进行调节，但关于力学载荷下成骨细胞与破骨细胞间的相互作用及其具体的调控机制尚不清楚。研究发现，单独培养的细胞与共培养的细胞相比，在细胞功能表达上具有明显不同，共培养模式正在越来越多的被探索，但目前“成骨细胞-破骨细胞”的共育体系还不完善，无法用于力学环境下骨重建机制的研究。因此，本研究试图通过Transwell小室，建立成骨细胞-破骨细胞的体外共培养体系，观察不同加载强度的基底拉伸应变下，成骨细胞对破骨细胞分化与凋亡的调控作用，并探讨力学载荷下成骨细胞调控破骨细胞分化、凋亡的作用机制。

1.3研究内容与研究方法

1.3.1研究内容

(1)成骨细胞与破骨细胞体外共培养体系的建立

1）共育体系中成骨细胞增殖活性的鉴定

2）共育体系中成骨细胞分化活性的鉴定

3）共育体系中破骨细胞分化活性的鉴定

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