酶工程2012年1月考试复习题

酶工程复习题

一、名词解释、

1、酶学： 研究酶的化学本质、结构、作用机制、分类、辅酶和辅因子等的学科。

2、米氏常数：米氏常数Km是酶促反应速度n为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。 3、酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。

4、转录：以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。

5、翻译：以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。

6、操纵子：基因表达的协同单位，是由启动子，操纵基因，结构基因，调节基因组成的。 7、葡萄糖效应：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”，这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。 8、胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少。

9、酶的提取：把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来，将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液的过程。

10、蛋白质透析：借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。

11、电泳：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。 12、酶活力：又称酶活性，即单位时间内酶促反应的产物生成量，是酶催化某一化学反应的能力。

13、酶比活：酶活力（u/ml）与蛋白质含量（mg蛋白/ml酶液）的比值，比活力越高，酶纯度也越好。 14、酶活性中心：是由结合部位和催化部位组成的，结合基因影响底物中某些化学键的稳定，催化底物发生化学反应并将其转化成产物 ，催化部位与底物相结合，使底物与酶的一定构象形成复合物 。

15、酶的化学修饰：通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。

16、酶的蛋白质工程：是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白质分子的设计和改造。 17、固定化酶：固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。

18、酶的半衰期：在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。

19、酶非水相催化：酶在非水介质中的催化作用称酶的非水相催化。

20、生物柴油：生物柴油是利用生物油脂生产的有机燃料，是由动物、植物或微生物油脂与小分子醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可以代替柴油作为柴油发动机的燃料使用。

21、酶反应器：以酶或固定化酶作为催化剂进行酶促反应的装置称为酶反应器(Enzyme reactor)。

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二、解答题

1、酶工程研究的主要内容。

答：1）、化学酶工程（初级酶工程）： 酶化学与化学工程技术相结合的产物。主要研究内容：酶的制备、酶的分离纯化、酶与细胞的固定化技术、酶分子修饰、酶反应器和酶的应用。

2）. 生物酶工程（高级酶工程）： 在化学酶工程基础上发展起来的、酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。 生物酶工程主要研究内容：（1） 用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）如：尿激酶原和尿激酶是治疗血栓病的有效药物。用DNA重组技术将人尿激酶原的结构基因转移到大肠杆菌中，可使大肠杆菌细胞生产人尿激酶原，从而取代从大量的人尿中提取尿激酶。 （2）蛋白质工程技术定点改变酶结构基因（突变酶）

如：酪氨酰－tRNA合成酶，用Ala5（第5位的丙氨酸）取代Thr51（第51位的丝氨酸），使该酶对底物ATP的亲和力提高了100倍。

（3）设计新的酶结构基因，生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。 2、千佃一郎对酶学的主要贡献是什么？

答：1969年，日本千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L－氨基酸。

3、酶合成调节的类型

答：1）.诱导 (induction)： 组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。

2）.阻遏 (repression) ： 分解代谢物阻遏(catabolite repression)；反馈阻遏(feedback repression

4、如何通过控制条件提高酶产量？ 答：（一）菌种选育（一劳永逸） 1.诱变育种： (1) 使诱导型变为组成型——选育组成型突变株； (2) 使阻遏型变为去阻遏型——选育营养缺陷型突变株；解除反馈阻遏——选育结构类似物抗性突变株 ；解除分解代谢物阻遏—选育抗分解代谢阻遏突变株；2. 基因工程育种。

（二）条件控制：

1）. 添加诱导物：酶的底物类似物最有效。

2）. 降低阻遏物浓度;除去终产物;产物阻遏;添加阻止产物形成的抑制剂;避免使用葡萄糖。分解代谢物阻遏 ：避免培养基过于丰富；添加一定量的cAMP。 3）.添加表面活性剂：离子型，对细胞有毒害作；增加细胞通透性、 4）. 添加产酶促进剂

5、酶生物合成的模式有哪些？

答：1）. 生长偶联型（又称同步合成型）：酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。 生长偶联型中的特殊形式——中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的mRNA是不稳定的。 2）.部分生长偶联型（又称延续合成型）：酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产

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物阻遏。所对应的mRNA相当稳定 3）.非生长偶联型（又称滞后合成型）：只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的mRNA稳定性高。

6、优良产酶菌种应具备的条件

答：（1）酶产量高；（2）易培养（生长速率高、营养要求低）；（3）遗传性能稳定，不易退化；（4）易分离提纯； （5）安全可靠（不是致病菌） 7、细胞破碎的方法有哪些？

答: ① 机械法：液体剪切：搅拌、匀浆。固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。

② 物理法：超声波破碎法；渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）平衡后迅速转入低渗溶液或水； 冻融法：反复低温冰冻，室温融化。

③ 化学法：应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。 有机溶剂处理：破坏膜磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯仿等。

表面活性剂处理：常用非离子型表面活性剂，如Triton X-100，Tween等。 ④ 酶解法（enzymatic lysis）： 外加酶法：根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。自溶法（autolysis）:细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发生溶解的现象。 8、如何确认细胞破碎的情况？

答; ① 直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，显微镜或电子微粒计数器计数；破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 ② 测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 ③ 测定释放的蛋白质量或酶活力：测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放 量，估算破碎率。

9、酶的提取方法有哪些？ 答：①离心提取

②盐溶液提取：常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 ③酸、碱溶液提取 ④有机溶剂提取

10、比较三种常用蛋白质离心方法的主要特点 答; ① 差速离心 （differential centrifugation）：用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。

特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。 优点：操作简单 。

缺点：1）分离效果较差， 不能一次得到纯颗粒。2）壁效应严重。3）沉降的颗粒受到挤压。 ② 密度梯度离心 （density gradient centrifugation）：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。 常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。 特点:区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度；适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。

③ 等密度梯度离心 又称沉降平衡离心：根据颗粒的密度不同而进行分离。离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。 常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。

特点：介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度；适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。

11、盐析沉淀酶的原理是什么？

答：①基本原理（盐溶和盐析）:向蛋白质或酶的水溶液中 加入中性盐，可产生两种现象： 盐溶（salting in） ：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。

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盐析（salting out） ：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。

高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。 不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。

12、有机溶剂沉淀酶有何优缺点？

答：优点：分辨率比盐析法高；沉淀不需脱盐 ；溶剂易蒸发，沉淀易离心

缺点：容易引起蛋白质变性失活；有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。 13、酶纯化的基本原则？

答：①建立一个方便灵敏的分析方法；

②选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤；

③常在低温（4℃）条件下进行纯化，以避免酶的变性。 14、层析法的基本原理？

答：利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。

流动相：携带样品流过整个系统的流体.有两种状态：液体作为流动相和气体作为流动相 固定相: 静止不动的一相.两种状态

固体吸附剂作为固定相；以吸附在固体上的液体作为固定相。 15、按层析过程的机理把层析分成哪些类型？

答：吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附 性能的差异。

分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。

凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。 16常用的凝胶种类有哪些？

答:凝胶过滤（gel filtration）又称分子筛层析（molecular sieve chromatography）、排阻层析（exclusion chromatography）,是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。 凝胶的种类和性质: 交联葡聚糖凝胶（dextran gel):商品名:Sephadex 型号 Sephadex G－10至G-200 ,G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围越大。

琼脂糖凝胶（agarose gel):依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。

聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）商品名为Bio-Gel,型号从 Bio-Gel P－2至P-300，P值越大，孔径也越大。 以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。

17、电泳的原理是什么？ 答：在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。 18、聚丙烯酰胺凝胶电泳的效应有哪些？

答：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。

分离效应 :PAGE根据其有无浓缩效应，分为： 连续电泳:采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统 不连续电泳:采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系

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电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。 分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。

浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。 19、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理？

答 : SDS是种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。

因此，蛋白质—SDS复合物在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。 20、酶结晶受哪些因素影响？

答：结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。 1、 酶的纯度:纯度越高越易结晶（> 50％ ）

2.酶的浓度 （恰到好处）:浓度越高越易结晶，控制在饱和区以上，过饱和区以下的介稳区内。3. 结晶温度 4. 溶液pH 5. 离子强度 6. 晶核 7. 结晶时间 21、设计酶纯化方案的依据是什么？

答：根据有效成分和杂质之间理化性质的差异 调节溶解度：沉淀法

根据分子大小、形状的不同：离心分离，膜分离，凝胶过滤 根据分子电荷性质的不同：离子交换层析，电泳 根据专一性结合的方法：亲和层析 其它：吸附层析，疏水层析 22、酶活性中心有哪些共性？

答：(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 (2)活性部位是一个三维实体。

(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。

(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。 23、限制酶大规模应用的原因是什么？

答：1)细胞外稳定性差； 2)酶活性不够高；3)具有抗原性。 24、酶化学修饰的原理? 答：1) 如何增强酶的稳定性与耐热性;修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。

2) 如何保护酶活性部位与抗抑制剂：大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。

3) 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：

大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。 4) 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境

酶的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/fntv.html