65-人巨细胞病毒核酸检测标准操作程序
更新时间:2023-09-13 21:57:01 阅读量: 教学研究 文档下载
北京泰普舜康医学检验所作业指导书 编号:BJTIB-SOP-PCR064
人巨细胞病毒核酸定量检测标准操作规程(荧光PCR法) 第一版
第1页 共8页 第0次修改 人巨细胞病毒核酸定量核酸检测标准操作规程
(荧光PCR法)
1.目的
规范人巨细胞病毒(HCMV)核酸DNA(荧光PCR法)检测操作流程,准确进行人巨细胞病毒(HCMV)DNA分析。 2.应用范围
使用中山大学达安基因股份有限公司人巨细胞病毒(HCMV)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)和PE GeneAmp 5700、ABI Prism 7000、ABI Prism 7700等仪器进行人巨细胞病毒(HCMV)DNA检测。 3.职责
由PCR实验室制定程序文件,专业技术人员负责执行,实验室主管负责监督实施。 4.内容
4.1 实验原理和临床应用
本品选取人巨细胞病毒珠(即人疱疹病毒5型)-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因的一高度保守的非编码区为扩增靶区域,设计特异性引物及荧光探针,扩增片段长度为86bp,利用实时荧光定量PCR技术,定量检测尿液、乳汁、血清或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒DNA。
本品用于器官移植、骨髓移植及HIV阳性/AIDS患者尿液、乳汁、血清或淋巴细胞中的人巨细胞病毒(HCMV)感染的检测,用于人巨细胞病毒感染的辅助诊断和疗效监控,不用于血源筛查。本品检测结果仅供临床参考,不能单独作为确诊或排除病例的依据。 4.2
标本采集
4.2.1 使用标本类型:尿液、乳汁、血清和淋巴细胞 4.2.2 标本采集;由合作单位按照以下要求进行采集。
4.2.2.1 尿或乳汁:取晨尿或成熟乳1ml于1.5ml的无菌离心管中,离心取沉淀即为标本。标本可立即用于测试,也可保存于-20℃待测,保存期为6个月。
4.2.2.2 血清:用无菌注射器抽取受检者静脉血1ml,注入无菌1.5mlEppendoff管,4℃静置过夜。吸取上层血清(注意勿带入红细胞)至另一无菌1.5mlEppendoff管中,即为血清标本。标本可立即用于测试(48小时以内),也可以保存于-20℃待测,保存期为6个月。
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第2页 共8页 第0次修改 4.2.2.3 淋巴细胞:取静脉血(EDTA抗凝)1ml,利用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞即为标本。标本可立即用于测试,也可保存于4℃待测,保存期为24小时。 4.3 试剂准备
4.3.1 供应商:中山大学达安基因股份有限公司
4.3.2 此实验试剂应放在冰箱-20℃保存,在实验前5分钟取出备用,实验后应立即放回冰箱-20℃。
4.3.3 如果试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂,应及时更换。 4.4 质控品
4.4.1 质控品来源:随试剂盒,由厂家提供。 4.4.2 质控品保存条件:置于-20℃冰箱中保存。 4.4.3 质控频度:每次实验均需做质控。 4.5 操作过程说明 4.5.1 DNA提取
4.5.1.1 质控品处理:分别取出阴性、阳性质控品,8000rpm离心数秒,各吸50ul至1.5ml灭菌离心管中,瞬时离心后95℃干浴2min,立即冰浴2-5min后13000 r/min离心1min,上清 液用于PCR扩增。 4.5.1.2 样本处理 4.5.1.2 样本处理
4.5.1.2.1 取全血500ul至干燥玻璃试管中,加入生理盐水500ul轻摇混匀; 4.5.1.2.2 取干燥玻璃试管加入1ml淋巴细胞分离液;
4.5.1.2.3 将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中(注意沿着管壁,速度要慢);
4.5.1.2.4 2000rpm离心20分钟(建议用水平离心机);
4.5.1.2.5 吸取白细胞层(从上往下第二层),加入1.5ml离心管,12000rpm离心5分钟; 4.5.1.2.6 去上清,沉淀中加入50ulDNA提取液充分混匀,100℃恒温处理10±1分钟;
12000rpm离心5分钟,上清备用。
4.5.2 加样: 从4℃冰箱取出处理好的样本以及质控品转移至加样区,取上清液5ul加至PCR 反应管进行PCR扩增。
4.5.3 Mx3000P荧光定量PCR仪的设置及结果分析 4.5.3.1 打开计算机电源。
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第3页 共8页 第0次修改 4.5.3.2 将Mx3000P电源开关打开,在大约1分钟的时间内,仪器将会自检并且能听到滤镜轮转动的声音。打开电脑上的Mx3000P软件,确定软件界面右下面的联机标志呈现绿色
。如果不是绿色而是红色,软件会提示
要继续稍等片刻,待仪器自检完成,会自动连接计算机。
,这时只需
4.5.3.3 在软件的弹出框中选择您要进行的实验类型,
一项“Quantitive PCR(Multiple Standards)”进行绝对定量分析。 4.5.3.4 确定卤钨灯已经打开。钨灯正在预热;
(绿色)则说明卤钨灯已经打开;
通常选择第
(黄色)则说明卤
(红色)则说明卤钨灯没有被打开,这时需要用鼠标点击这个标志将
(绿色)。
光源打开。在卤钨灯已经被打开的情况下,软件界面右下方会显示4.5.3.5 最好在仪器与光源预热20分钟后开始实验。 4.5.3.6 在
里,对所选孔进行设定,在Well type中设定Standard
(标准 品)、NTC(阴性对照)、unkown(样品)等,并选择正确的荧光通道(FAM, HEX, ROX,Cy5),参比荧光(Reference dye)选None。对于标准品,在Well type中设定为“Standard”后,再设定其模板浓度。方法为:点击可以直接点击
,10倍的浓度梯度
,在下拉菜单中选择不同的系数关系后,依次点击设定为
标准品的另外几个孔,浓度将实时显示。也可以直接点击标准品的各个孔位, 在
一栏,手工输入浓度。若要对不同的样品进行编号,则双
击所选孔,在name框中输入样品号,点击右上方的4.5.3.7 点击
,导入以前使用的96孔板设定。
,进行PCR循环的设定,可以直接点击温度、时间
改
就能显示样品编号。或者点击版面
变各项温度、时间、循环数等。在选定大步骤之后添加步骤可选定该大步骤后,点击
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第4页 共8页 第0次修改 ,或点击鼠标右键,在弹出的对话框中,选择Add Segment,则可在该
大步骤之后添加一个大步骤;若是在选定大步骤里面的小步骤后边添加一小步骤,选中该小步骤,点击鼠标右键,在弹出的对话框中选择“Add Plateau with Ramp”。 要删除某个大步骤,直接选定大步骤,点击界面右边的“
”,或者点击鼠标右
键选Delete,即可删除该步骤。如果要删除一个大步骤里的小步骤,可先选定此步骤时间和温度中间的横线,将其变红,如图标右键选Delete,即可删除该步骤。点击
(END)代表在这一步结束时采集荧光信号;
,点击界面右边的“
”,或者点击鼠
,导入以前设定的PCR程序。
(ALL)代表在这一步的全过程都采集
荧光信号,一般用作熔解曲线分析。可直接用鼠标将此图标拖到要采集信号的地方。若要去除
,可将其拖出循环设定区域。
结束之后,点击软件界面右上方的
。会弹出对话框提示:仪
4.5.3.8
器灯源正在预热,需要“马上运行”或者是“灯预热完成后再运行”?通常可直接点击“马上运行”,但最好点击“灯预热完成后再运行”,可以保护灯源。
软件界面右下方会出现运行状态显示框Run Status,点击Start开始实验。在运行过程中可以通过点击Add Cycles来增加扩增的循环数。还可以选择勾选“Turn lamp off at end of run”,在PCR运行结束之后软件将自动关闭卤钨灯。 4.5.3.9 在PCR运行的过程中可以点击4.5.3.10 PCR运行结束后,点击也可点击
,观察样品的实时扩增原始结果。
,再点击Results,软件将自动进行结果分析,
手动进行结果分析。可以手动调节阈值线(拖动)进行分析。点击
可显示标准曲线,看斜率、截距、线性相关是否在可控范围内。左下角
的可选择相应的荧光观察扩增曲线。右边的
可根据自己的需要选择显示的界面。是扩增曲线,
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第5页 共8页 第0次修改 Ct值列表,结果excel表格输出,
Ct值、扩增曲线四个面板。
标准曲线,样本起始浓度,
合并面板,包括设置、程序设定、样本
4.5.3.11分析曲线时,如果曲线不够光滑,还能用中的Smoothing
对曲线进行调节,一般Amplification average是3,可按需要将其调至较大数值,
如5、7、9,调整后曲线将更光滑,不过Ct值会稍微靠后一点,
使数据失真,通常情况下,不建议这么做。
4.5.3.12 如果需要对每条曲线进行单独的基线设置,点击中的
Baseline Correction,点击Adaptive baseline,在下面对应的各孔,单独进行基线起始和终止位置的调节。
4.5.3.13 关于Mx3000P调用前一次实验标准曲线的补充说明。点击桌面Mx3000P的软件图标,弹出话框:选择Multiple Experiment Analysis (多项实验结果分析)选项,点击“OK”,出现如下对话框,建议选择“Use common threshold”进行分析进算,然后点击
,导入需要一起分析的上机文件,点击“Finish”即可。
4.5.3.14 这里选择时要注意:1.两个或者多个实验结果要有相同的实验程序 ;2.每次程序中的循环数应该一致。在分析栏可以选择不同实验的不同反应孔进行同步分析。 4.5.3.15 分析质控结果:
阴性质控品:GBS(FAM)Ct值= 40或“No Ct”,内参照(HEX)Ct值<40,且有较好的对数增长曲线。
阳性质控品:GBS(FAM)Ct值<33,且有较好的对数增长曲线;内参照(Texas Red)Ct值≤40。
以上要求需在同一次实验中同时满足,否则本次实验无效,需重新检测。 4.5.3.16 记录实验数据。
4.5.3.17 取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后,丢入医疗废物垃圾桶内,以防止扩增管破裂而导致污染。
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