嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究学士学位论文 doc

嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究

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指导教师：

生 命 科 学 系 食品科学与工程

2011年5月

嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究

摘要：本课题对运城盐湖嗜盐放线菌YL产纤维素酶酶学性质进行了研究。DNS法对菌株YL的酶活进行测定。研究表明，该纤维素酶在50℃-90℃范围内酶活性较高，最适反应温度为60℃，说明该酶具有耐热的特性；酶促反应的最适pH是8.0，且在pH 7.0-9.0维持相对较高的酶活性，表明该纤维素酶耐碱性较好；该酶在盐度5%-17%范围内相对酶活达70%以上，最适反应盐浓度为10%，表明该纤维素酶是耐盐酶，而不是嗜盐酶；金属离子Mg2+、Zn2+对酶促反应有促进作用，Mn2+、Ca2+对该酶促反应部分抑制，而Cu2+、Fe2+对该酶促反应完全抑制，说明该酶活性的发挥受金属离子的影响较大；在特异性酶抑制剂DPEC、PMSF的作用下，相对酶活力较高，说明该纤维素酶酶活中心可能不含组氨酸和丝氨酸；同时该酶在金属螯合剂EDTA-Na的作用下，酶活力偏低，表明该酶活性的发挥依赖某种金属离子的参与。本研究对于进一步研究和应用纤维素酶具有深远意义。

关键词：嗜盐放线菌；纤维素酶；酶学性质

The activity research of cellulase producted by halophilic

actinomycete YL

Yuan Xueyun

(Life Science College, Yuncheng University, Yuncheng Shanxi，044000)

Abstract: The research aimed to study the characteristics of cellulase, produced by halophilic actinomycete YL from salt lake in Yuncheng. Acquire the cellulose enzyme activities by DNS method. The research showed as follows: the cellulase had a relatively high enzyme activity between 50℃ and 90℃, and the optimal reaction temperature is 60℃, this stated that the cellulase is thermotolerant; the optimal reaction pH value is 8.0, and the cellulase maintained a relatively activity between pH 7.0 and pH9.0, this indicated that the cellulase is alkali-resisting; the enzyme keeped the characteristics of over 70% in salinity between 5% and 17%, and the optimal reaction salinity is 10%, this revealed that the cellulase was a salt-tolerant enzyme, not a halophilic enzyme; Mg2+ and Zn2+ could activate its enzyme activity, Mn2+ and Ca2+ could partly reduce enzyme activity, while Cu2+ and Fe2+ could completely reduce the enzyme activity, this stated that metallic ions had a great influence on the cellulase; Under specific enzyme inhibitors DPEC and PMSF, the enzyme activity is relatively high, indicated that the activity center didn’t include serine and histidine; Under the EDTA-Na the enzyme activity is low, showed that the cellulase delayed on metallic ions. The research have a far-reaching significance for further research and application of cellulase.

Keywords: halophilic actinomycete; cellulase; enzyme activity

目 录

第一章 引 言 ................................................................................................................................. 1

1.1运城盐湖简介 .................................................................................................................... 1 1.2嗜盐放线菌的研究与应用 ................................................................................................ 1 1.3纤维素酶国内外研究情况 ................................................................................................ 2 1.4纤维素酶的来源 ................................................................................................................ 2 1.5纤维素酶的应用 ................................................................................................................ 3 1.6本文研究的目的和意义 .................................................................................................... 3 第二章 嗜盐放线菌产纤维素酶活性研究 ................................................................................. 5

2.1 材料 ................................................................................................................................... 5

2.1.1 菌株 ......................................................................................................................... 5 2.1.2 试剂 ......................................................................................................................... 5 2.1.3 主要仪器 ................................................................................................................. 6 2.1.4 培养基与试剂配置 ................................................................................................. 6

a．培养基 .................................................................................................................. 6 b．试剂配制 .............................................................................................................. 7

2.2 方法 ................................................................................................................................... 7

2.2.1菌株YL产纤维素酶的鉴定 ................................................................................... 7 2.2.2 酶活测定 ................................................................................................................. 7

a．粗酶液的制备 ...................................................................................................... 8 b．葡萄糖标准曲线的绘制 ...................................................................................... 8 c．羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）酶活性测定 ................................................... 9 2.2.3 粗酶特性研究 ......................................................................................................... 9

a．温度对酶活的影响 .............................................................................................. 9 b．pH对酶活的影响 .............................................................................................. 10 c．NaCl浓度对酶活的影响 ................................................................................... 10 d．金属离子对酶活的影响 .................................................................................... 11 e．特异性酶抑制剂对酶活的影响 ........................................................................ 11

2.3 结果与分析 ..................................................................................................................... 11

2.3.1菌株YL产纤维素酶鉴定结果 ............................................................................. 11 2.3.2 YL产纤维素酶酶学性质研究结果 ...................................................................... 12

a．温度对酶活的影响 ............................................................................................ 12 b．pH对酶活的影响 .............................................................................................. 13 c．NaCl浓度对酶活的影响 ................................................................................... 13 d．金属离子对酶活的影响 .................................................................................... 14 e．特异性酶抑制剂对酶活的影响 ........................................................................ 14

第三章 讨论 ................................................................................................................................. 16

3.1菌株YL产纤维素酶的鉴定 ........................................................................................... 16 3.2 YL产纤维素酶酶学性质研究 ....................................................................................... 16 致 谢 ............................................................................................................................................. 17 主要参考文献 ............................................................................................................................... 18

嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究

第一章 引 言

1.1运城盐湖简介

运城地处北纬35.02，东经110.59，位于山西省西南部，北依吕梁山与临汾市接壤，东峙中条山和晋城市毗邻，西、南与陕西省渭南市、河南省三门峡市隔黄河相望。运城盐湖，史称河东盐池，解池。位于晋南盆地的最低处，它自东北西南延伸，长约30千米，宽约3千米-5千米，海拔324.5米，最深处约6米，面积132平方公里。运城盐湖是个古老而又典型的内陆咸水湖，地质研究表明，运城盐湖诞生于新生代第三纪喜马拉雅构造运动时期，距今约0.5亿年，到新生代第四纪，受到新的地壳变化作用，形成了狭长的陷落地带，再加上运城地区属温暖半干旱大陆性季风气候，大量含盐类矿物质汇聚在这里，经过长期的沉淀蒸发，逐渐形成了今天的运城盐湖。

1.2嗜盐放线菌的研究与应用

嗜盐微生物通常生活在盐湖、盐碱地、海水、晒盐场和盐渍食物等高盐环境中，属于极端环境微生物[1]。根据微生物生长对NaCl的需求和最适生长的NaCI浓度，Larsen(1986)和Vreeland(1987)将微生物分为四类：非嗜盐微生物(Nonhalophilic)、轻度嗜盐微生物(slight halophilie)、中度嗜盐微生物(moderately halophilic)和极端嗜盐微生物(extreme halophilic)[2]。表1-l列出4类微生物生长对盐的需求及耐盐范围。可见，中度嗜盐菌是指一大类生长离不开NaCl的、能够适应很宽的盐浓度范围的、庞杂的异源微生物生理类群。

表1-1 不同微生物的生长对盐的需求及耐盐范围

Fig.1-1 Microbial growth in different salt requirement and salt on the range

微生物种类 对NaCl的需求 NaCl浓度范围 最适NaCl浓度

非嗜盐微生物 不需要 >1%抑制生长 -- 轻度嗜盐微生物 少量需要 -- 1-3% 中度嗜盐微生物 需要 0.1-32.5% 5-10% 极端嗜盐微生物 需要 9-35% 20%

备注 中度嗜盐微生物与极端嗜盐微生物所处的环境是相同的

中度嗜盐菌因有极宽的耐盐范围，其分类特征、系统发育地位、渗透调节机制以及遗传学具有重要的基础理论研究价值。我国盐碱地面积广阔，通过对中度嗜盐菌的渗透调节机制的研究，以期分离出耐高盐的基因，转入植物体中，以获得耐盐农作物新品种，这将对我国农业发展有着划时代意义。

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嗜盐放线菌有关的应用研究主要集中在其产生酶的相关研究。嗜盐放线菌为了适应强大的渗透压而维持正的膨胀压，常在细胞内富集一些低分子量的无机复合物，可用于生物技术上生产调节剂。放线菌还能产生胞外多糖及其他聚合物，蛋白含量极高，同时也产生大量的抗生素、维生素等。他们具有的生理特征从而使其更具商业开发价值。

嗜盐放线菌在生物工程应用上的优势体现在：首先，大多数嗜盐放线菌能在高盐环境中生长，进而减少了生产中污染机会；其次，嗜盐放线菌相对于其它极端微生物多数易培养，大多可利用广泛的复合物作为唯一的碳源和能源生长；此外，嗜盐放线菌因其具有完善的遗传体系，故具有良好的工业化基础。总之，嗜盐放线菌具有广阔的应用前景。

1.3纤维素酶国内外研究情况

20世纪初，有人在蜗牛的消化道内发现了纤维素酶，很多学者便开始对纤维素酶进行研究。一个世纪以来，人们对纤维素酶的研究主要经历三个发展阶段。

20世纪50年代，主要是对纤维素产生菌种的分离筛选等，虽然当时已建立了一套菌种分离筛选方法，但只是对纤维素酶的基础研究。60至70年代，世界人口急剧膨胀，粮食短缺，为寻找新的食物来源，有研究者利用纤维素生产单细胞蛋白。期间，随着生物化学实验技术进一步发展，有学者对纤维素酶开始进行分离纯化，这一进展不仅加快了纤维素酶的研究步伐，更加促使工业上实现纤维素酶制剂的生产。70年代后，全球人口急剧增长，经继迅猛发展，能源短缺严重，与此同时，利用纤维素酶降解产物来开辟新能源成为研究重点。现今很多发达国家对纤维素酶的酶制剂实现了工业化生产，纤维素酶的应用价值日益凸显。

我国对纤维素酶的研究已有50年的历史，且在纤维素酶基础研究方面获得显著成果，同时还选育出一大批优良的纤维素酶产生菌种，在纤维素酶分子水品研究方面成果颇丰。此外，我国也致力于纤维素酶的应用研究，在纺织、洗涤、新能源生产、饲料、食品等方面取得了较大的进展。如今，我国已经是世界上四个能够生产纤维素酶的国家之一[3]。

1.4纤维素酶的来源

纤维素酶来源广泛，自然界中存在大量可以产生纤维索酶的微生物，真菌、细菌、放线菌等。以纤维素为食的反刍动物牛、驴等，其胃肠内就存在大量的产纤维素酶的微生物。还有一些昆虫，如白蚁的肠道也可产生纤维素酶。来源不同的纤维素酶其特点也不尽相同。

真菌产纤维素酶往往酶活较高，人们研究的最多，且产纤维素酶的真菌以丝状真菌为

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主，其中对木霉菌属的研究也最为透彻。

相对真菌而言，细菌产生的纤维素酶量较少，对纤维素的降解能力也较弱。但芽孢杆菌可产生碱性纤维素酶，这相对于真菌产生的酸性纤维素酶则具有较大的应用前景。 放线菌产纤维素酶的活力较高，且所产生的纤维素酶往往具有耐碱的特性。常见的可降解纤维素的放线菌有以下种类：链霉菌属、高温放线菌属和弯曲热单孢菌等[4-7]。

1.5纤维素酶的应用

纤维素酶应用很广泛，在纺织、洗涤、新能源生产、饲料、食品等方面都显示出了巨大的应用价值[8]。

纺织品的麻、棉等很多都是纤维素成分，如果用纤维素酶对其进行处理，使纤维遭到适度破坏，就可以使纺织品变得更加柔润，光滑，吸水性增强而且手感较好，这极大地满足了人们对于纺织品舒适度和美观度的需求，由此在国际纺织工业上得到了大力的推广和广泛的应用。

纤维素酶在洗涤行业也达到了大规模的应用。应用碱性纤维素酶对纯棉布料的去污变得简单方便，得到了人们的一致好评。

当今世界环境污染、能源短缺问题已经成为人们迫在眉睫解决的重大问题。若将纤维素作为新能源的原料来源，在纤维素酶的作用下将纤维素分解成可溶性糖类，再进一步转化为新能源乙醇，这对于缓解或解决人类的能源危机意义重大。

纤维素物质往往是很多畜禽的饲料之一，但一般仅局限于一些反刍动物具有消化纤维素的能力。若将纤维素酶作为纤维素类饲料添加剂，在纤维素酶的作用下，可将一部分纤维素分解为易于消化的糖类，利于牲畜的进食吸收，且易使其肥育。

当然，纤维素酶在食品领域也得到了大规模的推广应用。纤维素酶往往与其他酶类乳半纤维素酶、淀粉酶等协同作用，进而改造了食品的色度、味度、营养度和其他品质。

1.6本文研究的目的和意义

嗜盐放线菌不仅可以产生大量有重要意义的酶、聚合物等，而且因它们具有有用的生理特征而使其更具有商业开发价值，它可以使某些新的生物技术手段成为可能。

纤维素类物质是自然界中最丰富的一种可再生资源和能源。近年来，有关纤维素酶的研究报道较多，产菌种主要是曲霉、木酶的等真菌，然而这些菌种存在着产酶成本高、对碱稳定性不高、作用范围窄等问题。该研究从运城盐湖筛选分离出的一株产纤维素酶的嗜盐放线菌，其产生的纤维素酶具有良好的盐度稳定性和适应性，通过对此酶的活性研究，

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即在不同温度、pH、NaCl浓度、金属离子及酶抑制剂的作用下测定酶活的大小，以获得该纤维素酶反应的最适条件。若对其产生菌进一步诱变育种[10]，以提高其纤维素酶的酶活产量，这对于降低纤维素酶生产成本、推动生物乙醇的发展及促进运城工业的进程具有重要意义。

本实验为对运城盐湖嗜盐放线菌YL产纤维素酶酶学性质的研究，通过测定该纤维素酶在不同温度、pH、NaCl浓度及金属离子条件下的酶活力，可知该酶发挥酶活性的最适反应条件。此外，通过特异性酶抑制剂DPEC、PMSF和EDTA-Na对该酶的作用，可知此纤维素酶酶活中心组成，这对于进一步研究和应用该纤维素酶具有指导作用，也将促进运城盐湖微生物资源的开发和利用。

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第二章 嗜盐放线菌产纤维素酶活性研究

2.1 材料

2.1.1 菌株

采自运城盐湖泥样，经分离筛选，得到菌株YL。 2.1.2 试剂

表2.1 试剂一览表 Fig.2-1 Reagent list 试剂名称 硝酸钾（KNO3） 七水硫酸镁（MgSO4·7H2O） 碳酸钙（CaCO3） 磷酸氢二钾（K2HPO4） 氯化钾（KCl） 氯化钠（NaCl） 羧甲基纤维素钠（CMC-Na） 一水硫酸锰（MnSO4·H2O） 七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O） 无水硫酸铜（CuSO4·5H2O） 氯化钙（CaCl） 磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O） 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 柠檬酸（C6H8O7·H2O） 3，5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7） EDTA-Na(乙二胺四乙酸二钠C10H14N2O8Na2·2H2O) 可溶性淀粉 酸水解酪蛋白 规格 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生产厂家 天津汇英化学试剂有限公司 天津大茂化学试剂厂 天津瑞金化学品有限公司 西安化学试剂厂 天津市化学试剂三厂 天津大茂化学试剂厂 天津市科密欧化学试剂有限公司 天津市化学试剂三厂 天津瑞金化学品有限公司 河北保定化学试剂厂 天津瑞金化学品有限公司 天津市泰兴试剂厂 天津市泰兴试剂厂 河北保定化学试剂厂 上海蓝季科技发展有限公司 天津瑞金化学品有限公司 天津大茂化学试剂厂 北京奥博星生物技术有限责任公司 5

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琼脂粉 PMSF(苯甲基磺酰氟C5H5CH2SO2F) DPEC(焦碳酸二乙脂C6H10O5) 刚果红（C32H22N606S2Na2） 酒石酸钾钠 亚硫酸钠 结晶酚 氢氧化钠 葡糖糖 异丙醇 注：实验中所用水均为蒸馏水。

分析纯 优级纯 优级纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 北京奥博星生物技术有限责任公司 Amresco 0754 Amresco 0379 北京化工厂 天津市塘沽新化化工厂 天津大茂化学试剂厂 北京奥博星生物技术有限责任公司 天津大茂化学试剂厂 北京奥博星生物技术有限责任公司 2.1.3 主要仪器

表2-2 主要仪器一览表 Fig.2-2 List of major equipment 设备名称 电子天平 恒温水浴锅 离心机 恒温培养箱 摇床振荡培养箱 分光光度计 电热鼓风干燥箱 型号 AL204 HHS TGL-16G DNP-9052 HZQ-X100 UV1102 DAG-9070A 生产厂家 梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司 天津华北实验仪器有限公司 上海安亭科学仪器厂 上海精宏实验设备有限公司 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 上海制造 上海精宏实验设备有限公司 2.1.4 培养基与试剂配置

a．培养基

(1) 基础培养基（淀粉酪素培养基）

KNO3 2g , KH2P04·3H2O 2 g，MgS04·7H20 0.05 g，NaCl 50 g，可溶性淀粉10g , 酪素 0.3g , FeSO4·7H2O 0.01g , CaCO3 0.02g , KCl 20g ,加蒸馏水至1000 ml，pH调至8.0, 121℃灭菌15-20min (2) CMC-Na固体培养基

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基础培养基 + 1%的CMC-Na +（2%+0.5）的琼脂 b．试剂配制

(1) 3，5一二硝基水杨酸(DNS)溶液的配制[11]

A液：先用少量热水溶解185 g酒石酸钾钠，再定容至500 ml。

B液：取500ml大烧杯，称取DNS(3，5一二硝基水杨酸)6．3 g用少量的蒸馏水溶

解。配置2 mol/l的NaOH溶液，加262 mLNaOH溶液于DNS溶液中。将B液加入A液中，再依次加入5 g结晶酚、5 g无水亚硫酸钠，搅拌使其充分混匀，冷却后在容量瓶中定容至1000 ml，混匀后转移至棕色瓶中贮存，室温放置一周后使用。

(2) 1mg/ml葡萄糖溶液 准确称取10mg分析纯的无水葡萄糖，用枪定容至10ml。 (3) 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH3.0-8.0)

pH 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 0.2mol/LNa2HPO4(ml) 4.11 7.71 10.30 13.63 16.47 19.45 0.1mol/L 柠檬酸（ml） 15.89 12.29 9.70 7.37 3.53 0.55 (4) 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0-10.0)

pH 9.0 10.0 0.2mol/L 甘氨酸（ml） 50 50 0.2mol/L NaOH (ml) 8.8 32.0 注：配置好的溶液均加水稀释至200毫升。

2.2 方法

2.2.1菌株YL产纤维素酶的鉴定

用接种环将发酵液中的菌落转移到CMC-Na平板上，划线，37℃恒温培养4d， 1mg/ml刚果红染色1 h，然后1 mol/l的NaCl溶液洗脱。若在菌落周围形成透明圈的则证明嗜盐放线菌YL可产纤维素酶[12] 。 2.2.2 酶活测定

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酶活定义[13]：在pH8.0, 50℃条件下，每分钟水解CMC-Na产生相当于1μg还原糖所需的酶量，定义为一个酶活单位，用U/ml表示。

酶活力U/ml=葡萄糖含量（μg）·稀释倍数/(30min·0.5ml)

a．粗酶液的制备

取于37℃下培养三天的摇瓶培养液，分装于离心管，然后在10000r/min转速下离心10min, 上清液即为粗酶液。

b．葡萄糖标准曲线的绘制

DNS(3，5-二硝基水杨酸)与还原糖一起沸水浴后可生成棕红色的氨基化合物，因还原

糖的含量不同其生成物的量也有差异，导致颜色深浅不一，通过其在540nm处的吸光度来判断生成物的量，进一步可换算成溶液中还原糖的量[14]。

方法：取8支试管，分别加入0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml

1mg/ml的葡萄糖标准溶液，均补蒸馏水至2ml，再加入1.5ml DNS试剂混合均匀，沸水浴加热5min, 取出用流动水冷却至室温，空白管溶液调零后，稀释三倍后于540nm波长处测OD值（表2-3），以OD540值为横坐标，葡萄糖含量（mg）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线（表2-4）

表2-3 葡萄糖标准曲线OD值测定结果

Fig.2-3 OD value of the determination results of glucose standard curve 测定项目 含糖量(mg) 葡萄糖（ml） 0 1 2 3 4 5 6 7 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 蒸馏水（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 DNS试剂（ml） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 OD540值

0 0.315 0.723 1.128 1.416 1.565 1.799 1.917 8

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2.52.01.5OD5401.00.50.00.00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖含量（mg）

表2-4 葡萄糖标准曲线 Fig.2-4 Glucose standard curve

标准曲线的回归方程: Y=1.5432X+ 0.064 相关系数：R2=0.990442944

c．羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）酶活性测定

取pH值8.0的1.00%的磷酸氢二钠-柠檬酸CMC-Na缓冲溶液1.0ml，加入酶液0.5ml, 50℃保温30min, 沸水浴反应5min,流动水冷却至室温，用1.5ml的DNS试剂显色后，稀释3倍后测定OD值，OD值越大说明该菌株的酶活力越强[12]。 2.2.3 粗酶特性研究 a．温度对酶活的影响

取16支试管，按表2-5加入下列试剂，分别在温度30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃下保温30min,用DNS法（沸水浴反应5min, 流动水冷却至室温，1.5mlDNS试剂显色）测酶活性，稀释3倍，540nm下测OD值。根据OD值可知酶活大小。

表2-5

加入试剂 温度 30℃ 40℃ 50℃ 实验组 CMC-Na缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 粗酶液/ml 空白组 CMC-Na缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 蒸馏水/ml 9

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60℃ 70℃ 80℃ 90℃ 100℃ 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 注：表中CMC-Na缓冲液为pH值8.0的1.00%的磷酸氢二钠-柠檬酸CMC-Na缓冲溶液

b．pH对酶活的影响

取16支试管，按表2-6加入下列试剂，于60℃下保温30min, 用DNS法（沸水浴反应5min, 流动水冷却至室温，1.5mlDNS试剂显色）测酶活性，稀释3倍，540nm下测OD值，根据OD值，可知酶活大小。

表2-6

加入试剂 pH 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 实验组 CMC-Na缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 粗酶液/ml 空白组 CMC-Na缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 蒸馏水/ml 注：表中的CMC-Na缓冲液为质量分数为1.00%的pH值与表相对应溶液的CMC-Na缓冲溶液。

c．NaCl浓度对酶活的影响

(1) 取16支试管， 8支分为实验组，8支为空白组，盐度（NaCl浓度）为2.0%的实验管与空白管分别加入0.5ml的粗酶液和0.5ml的蒸馏水，其它盐度（5. 0%、7.0%、10.0%、12.0%、15.0%、17.0%、20.0%）以此类推，操作一样，于50℃下保温1h。

(2) 再加入质量分数1.0%的pH值8.0的1.00%的磷酸氢二钠-柠檬酸CMC-Na缓冲溶液1ml，于60℃下保温30min, 用DNS法（沸水浴反应5min, 流动水冷却至室温，1.5mlDNS试剂显色）测酶活性，稀释3倍，540nm下测OD值，根据OD值可知酶活大小。

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d．金属离子对酶活的影响

(1) 取14支试管，7支为实验组，7支为空白组，1号实验组与空白组试管均加入质量分数为10.0%的K+ 溶液1ml（其他6组同样加入质量分数为10.0%的Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+ 溶液1ml），实验组各管均加入1ml的粗酶液，空白管相应的加入1ml的蒸馏水。

(2) 再取一支加有1ml的粗酶液和1ml的蒸馏水，以上15支试管均于50℃下保温1h，此后，从每支试管中取出1.5ml(即每支试管均保留0.5ml),另取一支加有0.5ml蒸馏水的试管。

(3) 向16支试管中均加入质量分数1.0%的pH值8.0的1.00%的磷酸氢二钠-柠檬酸CMC-Na缓冲溶液，于60℃下保温30min, 用DNS法（沸水浴反应5min, 流动水冷却至室温，1.5mlDNS试剂显色）测酶活性，稀释3倍，540nm下测OD值，根据OD值，可知酶活大小。

e．特异性酶抑制剂对酶活的影响

取5支试管，编号分别为1、2、3、4、5，按下表2-7进行操作:

表2-7

管号 2.0%PMSF(ml) 2.0íTA-Na(ml) 2.0%DPEC(ml) 蒸馏水(ml) 粗酶液(ml) 1 1 - - - - 2 - 1 - - 3 - - 1 - - 4 - - - 1 - 5 - - - - 1 50℃水浴保温1h，然后每支试管保留0.5ml

1.0%CMC-Na(ml) 1 1 1 1 1 1.5 1.5 1.5 60℃水浴保温30min DNS(ml) 1.5 1.5 沸水浴5min, 取出，流动水冷却至室温

然后于540nm下测定OD值，根据OD值，可知酶活大小。

2.3 结果与分析

2.3.1菌株YL产纤维素酶鉴定结果

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嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究

图2-8 刚果红染色鉴定纤维素酶 Fig.2-8 Congo red staining of cellulase

如图2-8所示，菌落周围形成透明圈且透明圈明显，则可证明此嗜盐放线菌YL产纤维素酶，且此纤维素酶活力较强。 2.3.2 YL产纤维素酶酶学性质研究结果

a．温度对酶活的影响

由图2-9可知，该酶在50℃-90℃这一范围内酶活性保持在70%以上，最适温度为60℃，100℃时虽然相对酶活较低，但也达到了60%以上，表明该放线菌株产生的纤维素酶具有一定的耐热性。

10090相对酶活（%）807060502030405060708090100110温度/℃

图2-9 温度对纤维素酶活的影响

Fig.2-9 Effect of the temperature on the activity of the esterase

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嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究

b．pH对酶活的影响

由图2-10可知，该酶酶促反应最适pH值为8.0；pH小于8时，随着pH的升高，酶活性逐渐提高；随着pH增大，酶活有所下降。这可能是在不同的pH条件下，酶和底物结合的情况不一样，进而影响了酶活。该酶在pH7.0-9.0维持相对较高的酶活性，说明该纤维素酶发挥其酶活须在碱性条件下进行，同时也暗示了此酶制剂在棉织品生物整理剂及洗涤工业中将具有良好的应用前景。

10080相对酶活（%）6040200345678910pH

图2-10 pH值对纤维素酶活的影响

Fig.2-10 Effect of the pH on the activity of the esterase

c．NaCl浓度对酶活的影响

由图2-11可知，盐浓度对纤维素酶活有一定的影响作用，具体为在盐度小于10.0%时，酶活随盐浓度的增加而增加，在10.0%时达到最大值，随后，随着浓度的增加而有所下降。但该酶在盐度5%-17%范围内相对酶活达70%以上，表明该纤维素酶属耐盐酶，而非嗜盐酶。

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100相对酶活（%）908070602%5%7 %NaCl 浓度。

图2-11 NaCl浓度对酶活的影响

Fig.2-11 Effect of the salinity on the activity of the esterase

d．金属离子对酶活的影响

由图2-13可知，纤维素酶的活性受金属离子的影响较大，K+ 、Mg2+、 Zn2+对酶促反应有促进作用，其中Mg2+、 Zn2+最为显著，Mn2+、Ca2+对该酶促反应部分抑制，而Cu2+、Fe2+对该酶促反应完全抑制，这可能是由于酶与不同金属离子结合的情况不一样，从而影响了酶活。

表2-12 金属离子对酶活性的影响

Taba2-12. Effect of the metal irous on the activity of the esterase 2

金属离子 对照 K+ Mg2+ Mn2+ Zn2+ Ca2+ Cu2+ Fe2

+

相对酶活力（%）100 118 398 50 746 53 0 0

e．特异性酶抑制剂对酶活的影响

通过表2-12，该酶在DPEC（组氨酸残基修饰剂）、PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）的作用下，相对酶活力较高，说明该纤维素酶活性中心可能不含组氨酸和丝氨酸；该纤维素酶在金属螯合剂EDTA-Na的作用下，酶活力偏低，进而表明该酶活性的发挥需要某种金属离子的参与。

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表2-13 特异性酶抑制剂对酶活的影响

Fig.2-13 Effect of the specific enzyme inhibitors on the activity of the esterase

酶抑制剂 对照 DPEC PMSF EDTA-Na 相对酶活力（%） 100 135 139 6

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第三章 讨论

在地球表面不同环境中生长着不同类型的分解纤维素的微生物，有真菌、细菌、放线菌等。由放线菌所产生的纤维素酶一般最适pH值为中性至偏碱性，因为这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱，长期以来没有得到足够的重视[15-19]。在我国东南沿海地区、新疆地区以及山西运城盐湖分布广泛，从环境保护和资源开发等方面的应用来看，对一些极端嗜盐菌的研究是很必要的。

3.1菌株YL产纤维素酶的鉴定

在很多平板降解圈直接分离法分离产纤维素酶菌株的方法中，以刚果红法为最好。其它的方法有的受底物来源的限制，有的灵敏度低需培养较长时间，有的则因杀死菌体而需用影印移植，这就造成很多不便。而采用刚果红法则无上述缺点，刚果红对菌体无任何不良的影响，产生的透明圈清晰，非常容易辨认，特别是它的高灵敏度，只要菌落长到用肉眼可见，就可产生清晰的透明圈。刚果红法除可用于识别产纤维素酶的菌株，还可用于初步判定酶活性高低。

3.2 YL产纤维素酶酶学性质研究

通过对运城盐湖嗜盐放线菌YL产纤维素酶酶学性质的研究，表明该酶在50℃-90℃这

一范围内酶活性较高，最适反应温度为60℃，说明该酶具有耐热的特性。该纤维素酶为碱性纤维素酶，最适pH为8.0，且在pH7.0-9.0间稳定性良好，这在洗涤工业方面值得推广。

同时，该纤维素酶在盐度5%-17%范围内相对酶活达70%以上，最适反应盐浓度为1.0g/l，表明该酶属耐盐酶，而非嗜盐酶。该酶活性受金属离子的影响较大，K+ 、Mg2+、 Zn2+对酶促反应有促进作用，其中Mg2+、 Zn2+最为显著，Mn2+、Ca2+对该酶促反应部分抑制，而Cu2+、Fe2+对该酶促反应完全抑制。

此外，通过特异性酶抑制剂DPEC和PMSF的作用可知，酶活力较高，说明该纤维素酶可能不含组氨酸和丝氨酸；将该酶与EDTA-Na作用，酶活力偏低，表明此纤维素酶活性的发挥需要金属离子的参与。

研究表明，运城盐湖嗜盐放线菌YL所产纤维素酶耐热、耐碱、耐盐，其优良特性在纺织、洗涤、新能源生产、饲料、食品等方面都显现出了巨大的应用潜力,并在缓解和解决环境污染、能源危机等问题上意义深远。

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嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究

致 谢

四年的大学生涯即将结束，借此机会向所有给予我指导和帮助的老师和同学致以深深的谢意。

首先，本课题的研究过程及论文是在老师精心指导和真诚帮助下完成的，从论文的选题、设计、实施到撰写，每个过程都倾注了李老师的汗水。李老师勤恳敬业、治学严谨、平易近人，使我不仅向他学习了丰富的知识，更锻炼了自己独立从事课题研究的能力；同时他一丝不苟、实事求是的工作态度也深深感染了我，使我终生受益。借此机会我向李老师致以最衷心的感谢！

其次，课题的研究与论文的完成离不开生命科学系各位老师的宝贵建议和同学们的真诚帮助。感谢各位老师，真心的祝愿你们身体健康，万事如意。感谢给予过我帮助的同学及好友，衷心祝福你们学业有成，前程似锦。

此外，在本论文的撰写过程中，参阅和直接引用了一些专家学者的研究成果，我尽可能在本论文的参考文献中列出，在此谨向被引用文献的作者表示最真的敬意和感谢！

最后，向论文评阅人及答辩委员会的所有老师致以深深的感谢之情!

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嗜盐放线菌YL产纤维素酶活性研究

主要参考文献

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/fk6g.html