韩毅启动博士开题报告 - 图文

山西医科大学第二医院科技项目开题报告书 共 10 页 第 1 页

博士基金开题报告

项目名称 孤啡肽拮抗剂抑制大鼠急性心肌血

后心律失常的机制研究

申 请 人 韩毅 所在科室 麻醉科 联系电话 13753171979 填表日期 2012年11月29日

山西医科大学第二医院

科技处制表

山西医科大学第二医院科技项目开题报告书 共 10 页 第 2 页

申请项目应符合下述条件之一：

1.解决临床工作中的疑点、难点、关键点； 2.符合本专业的学科建设发展方向；

3.具有较高理论价值的基础研究项目或有较好应用前景的应用基础研究项目；

4.能创造两个效益的科技开发项目。

山西医科大学第二医院科技项目开题报告书 共 10 页 第 3 页

一、项目提出的依据、必要性和国内外的水平与动向 冠心病又称缺血性心脏病（Ischemia heart disease IHD）是世界上许多发达国家人口死亡的常见原因。2008年美国心脏病协会年度报告显示从1900年起心血管疾病一直是人类第一致死原因，而且IHD居于首位[1]。随着我国人口平均寿命的延长，急性传染病的有效控制及生活水平的逐步提高，缺血性心脏病的发病率日趋上升，已在我国人口死亡原因中占第二位[2]。因此从器官、细胞、分子水平对IHD病理学过程和相关机制的研究对该疾病的诊断、治疗、预防有重要的意义。各种类型的心绞痛和急性心肌梗死，常常导致患者的猝死。急性心肌缺血导致的室性快速性心律失常(室颤和室速)是心源性猝死的主要原因[3]。在急性心肌梗死(简称心梗)幸存的人群中, 50%以上仍死于致命的室性心律失常[4]。 急性心肌缺血时全身交感-肾上腺素能活性增强，不仅使血浆儿茶酚胺水平上升，而且其引起的伤害性感受可以通过神经源性机制，向中枢端释放某些介质，传递疼痛信息[5]；局部也向外周释放某些神经递质或炎症介质等化学活性物质，导致和加重神经所支配组织发生炎症反应[6]。研究表明[7]，交感--肾上腺素能活性增强是急性心肌梗死期间发生致命性室性心律失常的重要原因之一。然而，单纯抑制交感神经活性，如：β受体阻滞剂的应用，并不能完全降低AMI的致死率和发病率。近年来大量有关心肌缺血性疾病的临床和实验研究使我们认识到心肌缺血并非是仅仅局限于心脏本身的病变——缺血的心肌引起的疼痛可能作为全身伤害性刺激的始动因素，引发剧烈的全身应激反应而使中枢神经系统缺血心脏相互作用，并进而引起多种感觉神经肽的释放，这些物质构成一个复杂网络，调节机体内环境的稳态。许多研究表明,在应激(如缺血)情况下,中枢和外周可通过不同机制产生和释放大量阿片肽,急性心肌缺血可引起胸段背根神节（T1-5）和心肌组织中的OFQ表达明显增多[8]。对充血性心力衰竭患者血浆检测发现OFQ含量明显增高[9]，血浆OFQ含量与心力衰竭的严重程度有相关性。研究发现，孤啡肽对大鼠心脏左心室收缩与舒张功能有明显的抑制作用；孤啡肽降低大鼠离体心脏缺血后室性心律失常发生率。这些提示进一步促使我们设想OFQ对缺血心脏的保护作用，如果有，它的机制是怎样的。 前期研究发现内源性孤啡肽可能参与促进大鼠急性心肌缺血早期室性心

山西医科大学第二医院科技项目开题报告书 共 10 页 第 4 页

律失常的发生，其作用机制可能与调控（缩短）动作电位时程有关。 通过对动作电位图形观察分析发现OFQ主要通过缩短平台期来影响APD。我们知道构成动作电位平台期主要成分为L型钙通道与内向整流钾通道，去极化使Ik开放，在平台期K+外流从低水平慢慢增加，使细胞逐渐复极化。去极化到-40mv，L-Ca2+开放，Ca2+向细胞内扩散使去极化。在平台早期，两电流相当；接着L-Ca2+通道失活，K外流增加形成平台晚期。OFQ可能和大部分通过影响APD来干预心律失常发生的药物一样拥有共同靶点即对L型钙通道，内向整流钾通道开放进行调节。 本研究在先前研究基础上通过全细胞膜片钳技术，探索孤啡肽（OFQ）受体拮抗剂UFP-101抑制急性心肌缺血后室性心律失常的机制，进一步探讨神经源性机制在器官损伤中的作用。拓展对缺血性心肌病病理学认识，探索更有效的心肌保护方法和临床治疗方法。 [1] Rosamond W, Flegal K, Furie K, et al. Heart disease and stroke statistics—2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation, 2008; 117:25-146. [2] 朱妙章，袁文俊，吴博威.心血管生理学与临床。北京：高等教育出版社，2004.3 ISBN7-04-013796-8. [3] ZIPES D P, WELLENS H J. Sudden cardiac death[J]. Circu-lation,1998,98(21): 2334-2351. [4] Jardine DL, Charles CJ, ForresterMD, et a.l A neuralmechanism for sudden death aftermyocardial infarction[ J]. Clin Auton Res,2003, 13(5): 339 [5] McHugh JM, McHugh WB. Pain: neuroanatomy, chemical mediators and clinical implications. AACN Clin Issues,2000,11:168~178 [6] Longhurst JC, Tjen SC, Fu LW. Cardiac sympathetic afferent activation provoked by myocardial ischemia and reperfusion. Mechanisms and reflexes. Ann NY Acad Sci, 2001, 940:74~95 [7] 王兴祥，心肌缺血时的交感-肾上腺素能活性.国外医学内科学分册,2000,27(12)：522~ 528 [8] Guo Z,Yao TP,Wang JP,Ding JY.Acute myocardial ischemia up-regulates nociceptin/orphanin FQ in dorsal root ganglion and spinal cord of rats.Neurosci Lett 2008;433(3):274-278. [9]周秀娟,桂鸣,党瑜华,唐朝枢,石湘芸.充血性心力衰竭患者血浆孤啡肽水平观察.中华核医学杂志1998;18(4):231.

山西医科大学第二医院科技项目开题报告书 共 10 页 第 5 页

二、项目研究目标、内容 研究内容： 通过全细胞膜片钳技术，探索孤啡肽（OFQ）受体拮抗剂UFP-101抑制急性心肌缺血后室性心律失常的机制，进一步探讨神经源性机制在器官损伤中的作用进一步阐述对孤啡肽参与调节心脏生理功能的认识。拓展对缺血性心肌病病理学认识，探索更有效的心肌保护方法和临床治疗方法。 以L型钙通道，内向整流钾通道功能状态为指标，观察OFQ对其功能的影响，分析OFQ调节心律失常机制。 研究目标： （1）急性心肌缺血引起的心脏病理生理学改变。 （2）UFP-101抑制内源性OFQ可以减轻和抑制上述改变。 （3）从电生理方面确定UFP-101发挥抗心律失常的作用靶点及相应信号通路。 证实OFQ在急性心肌缺血病理过程中保护性作用，探讨其分子机制与信号转导通路。 拟解决的关键问题： （1）探索急性分离大鼠心肌细胞方法，建立稳定成熟的全细胞膜片钳系统。 （2）检L型钙通道，内向整流钾通道功能状态。 （3）外源性OFQ对上述指标的影响。

山西医科大学第二医院科技项目开题报告书 共 10 页 第 6 页

1

三 、现有研究条件和研究工作基础 1.研究工作基础： 研究一：急性心肌缺血导致大鼠脊髓及背根神经界内孤啡肽水平增加。 我们观察到结扎冠状动脉左前降支后大鼠背根神经节、脊髓、心肌及小肠OFQ水平明显升高，且这种作用可被硬膜外麻醉阻止。 该研究结果已发表到Neuroscience Letters Zheng Guo?, Tai-Ping Yao, Jin-Ping Wang, Jian-Ying Ding，Acute myocardial ischemia up-regulates nociceptin/orphaninFQ in dorsal root ganglion and spinal cord of rats，Neuroscience Letters 433 (2008) 274–278 研究二：OFQ对健康大鼠离体心脏功能具有调节作用。 通过建立Langendorff灌流离体心脏实验模型我们发现孤啡肽对健康大鼠离体心脏具有正性变力作用，负性变时作用，其拮抗剂UFP-101能拮抗其正性变力作用；可以增加NE的正性变力变时作用此作用可被其拮抗剂UFP-101拮抗。 该研究结果已发表到《中华麻醉学杂志》 韩毅，郭政. 孤啡肽对大鼠离体心脏功能的调节作用及其对去甲肾上腺素诱发心脏功能变化的影响.中华麻醉学杂志. 2010, 30(3)：313-316 2.现有的主要仪器设备： 山西医科大学第二医院麻醉学科现有麻醉实验室用于麻醉学基础研究。已具备细胞电生理学，机能学，组织病理形态学和分子生物学研究的仪器设备。具有良好的动物实验和信息查询条件。已具有的主要实验设备： Leica CM-1850恒冷箱切片机（Leica公司，德国） 奥林巴斯BX-51荧光显微镜（TKO光学仪器株式会社,日本） Axonpatch 200B膜片钳放大器（美国Axon公司） Digidata 1322A数模转换器（美国Axon公司） MC1000e微操纵器（美国SD公司） 501A超级恒温器（上海实验仪器有限公司） PC-10微电极拉制仪（日本Narishige公司）

山西医科大学第二医院科技项目开题报告书 共 10 页 第 7 页

MPS-2多通道快速微量加药系统（武汉华中仪博公司） 低温离心机（2-16PK,Sigma，USA） Mx3005P实时荧光定量PCR仪（Stratagene，USA） 2. 研究技术及协作条件： （1）大鼠在体急性心肌缺血技术已相对成熟，并通过药物干预对SP,CGRP等进行研究。 （2）具备成熟的膜片钳技术，已对孤啡肽干预后L型钙通道、内向整流钾通道和瞬时外向钾通道进行研究。 （3）山西医科大学第二医院中心实验室和山西医科大学中心实验室及生化实验室是开放实验室，可以进行病理学超微形态学，生物化学分子生物学，免疫组织化学和细胞生物学研究。

山西医科大学第二医院科技项目开题报告书 共 10 页 第 8 页

四、采用的方法和技术路线 研究方法： （1）功能学方法：模型制备、记录血流动力学及心电图数据。 （2）细胞生物学方法：TTC染色观测梗死区面积。 （3）分子生物学方法：采用免疫组化及蛋白印迹技术观察OFQ受体、L型钙通道、内向整流钾通道和瞬时外向钾通的变化。 （4）电生理方法：采用膜片钳技术测量L型钙通道、内向整流钾通道和瞬时外向钾通道功能状态。 技术路线： 健康雄性SD大鼠 麻醉，尾静脉给药 （生理盐水、OFQ、UFP-101） 心功能 梗死面积 OFQ受体及各个通道变化 急性分离心肌细胞应用膜片钳技术 10min后 结扎冠状动脉 3h、6h后 开胸，取心脏标本 OFQ干预 血流动力学及心电 图数据 IK-ATP通道功能状态 TTC染色 免疫组化，蛋白印迹

结果分析 数据处理 得出结论 山西医科大学第二医院科技项目开题报告书 共 10 页 第 9 页

2

五、项目分阶段具体实施内容 时间区间 2013年1月～4月 2013年4月～2014年10月： 2014年11月～2015年1月 实 施 内 容 实验前期准备工作及开题报告。 实验阶段，完成分子生物学及功能学，电生理实验。 统计学处理实验数据，调整，补充部分实验。总结课题，撰写并发表相关学术论文。 六、成果提交形式 成果以学术论文形式提交（2～3篇）。 科室意见 科主任 年 月 日

山西医科大学第二医院科技项目开题报告书 共 10 页 第 10 页

科技处审查意见 负责人 年 月 日 3

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/ffur.html