响应面法在生物过程优化中的应用

响应面法在生物过程优化中的应用

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食品工程

FOODENGINEERING

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2010年第2期

6月出版

摘要生物过程优化的目的在于提高终产物的产率，是生物技术产业化不可缺少的一项工作。近年来国内外较为常用的生物过程优化技术包括非统计优化技术和统计优化技术两大类。在生物过程优化中，响应面法是一个更为有效的优化技术。

关键词生物过程；优化技术；响应面法；试验设计

AbstractThebiologicalprocessoptimization，itspur-poseistoimprovetheyieldofthefinalproduct，isanin-dispensableworkforbiotechnologyindustry.Biologicalprocessoptimizationtechniquesincludetwomajorcate-gories，i.e.non-statisticaloptimizationtechniquesandstatisticaloptimizationtechniquesathomeandabroadinrecentyears.Amongthebiologicalprocessoptimization,theresponsesurfacemethodisamoreefficientoptimiza-tiontechniques.Severalcommonoptimizationtechniqueswerecomparedwitheachother，theprincipleanddesignmethodoftheresponsesurfacemethodanditsapplica-tionswereintroduced.

Keywordsbiologicalprocess；optimizationtech-niques；responsesurfacemethod；experimentaldesign生物过程中的各个因素均会影响生产成本，决定能否产业化。生物过程优化可以使发酵生产过程

*项目基金：河南省高等学校青年骨干教师资助计划；郑州市科技攻关项目（0910SGYS34370-2）

**田泱源，男，1987年出生，河南工业大学在读硕士研究生。收稿日期：2010-03-18

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·综述评论·

响应面法在生物过程优化中的应用*

Applicationofresponsesurfacemethodonbiologicalprocessoptimization

田泱源**李瑞芳

（河南工业大学生物工程学院，郑州450001）

TIANYang-yuan**LIRui-fang

(Collegeofbioengineering，Henanuniversityoftechnology，Zhenzhou450001，China)

中的所有因素最佳化，使终产物产率最高。因此，

生物过程优化在生物技术产业化中具有非常重要的意义。

1几种常见生物过程优化技术的比较

1.1单次单因子法

单次单因子法是传统的优化方法，即每次实验只改变一个因子而保持其他因子不变的优化方法。当考察的因子较多时，这种优化方法需要的实验次数较多、实验周期较长，还可能因实验批次的不同和实验条件的不一致导致不可靠甚至错误的结论，而且这种方法还不能够分析因素之间的交互作用。但由于不需要数学统计方面的知识，而且操作简单、结果也能直观地用图表显示，单次单因子法仍然是常见的生物过程优化方法之一。1.2正交试验设计

正交试验设计在生物过程优化研究中应用非常广泛。他比常用的单次单因子法有很多优越性。实验次数明显少于同因素同水平的单因素实验，可以通过方差分析得到影响实验结果的主次因素，以及考虑因素之间的交互作用等等。但是在正交试验中，当考虑因素之间的交互作用时，正交试验次数会大大增加，如选用五因素五水平正交试验，不考虑因素间的交互作用时，需进行25次试验，但要考虑交互作用时，就需进行125次试验，大大增加了实验工作量。对于长周期的实验而言，就需花去大量的时间、人力和物力。另外正交试验在最后选

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取最佳实验方案时，对于不显著因素的选取一般是

凭经验。因此，正交试验对于创新实验是不宜选择的。

为了弥补传统的单次单因子法和正交试验设计法的缺陷，近年来许多生物过程优化技术已采用了统计学方法。常见的优化技术包括响应面法（re-sponsesurfacemethodology）、调优运算（evolutionaryoperation）、典型分析法（canonicalanalysis）、单纯形法等，其中响应面法是近年来应用最多的一种优化技术。

1.3调优运算

调优运算是美国博克斯1957年提出来的一种用于探索最优生产条件的数理统计方法。按照一个仔细规划好的、对生产条件作细微调节的程序来操作装置、设备，再用简单的数理统计方法来处理获得的信息，从而可以确定好条件变化的方向。调优运算是在实际生产过程中对实验室得到的最优条件进行调整，以求在生产的每个阶段均能达到最优条件的一种优化试验设计方法。他的特点是在生产中进行试验，条件变动幅度小，不会影响正常的生产，当达到既定目的可立即停止试验，因此，试验费用较低。但该优化技术不适用于生物过程优化的最初设计。

1.4典型分析法

典型分析法是利用综合变量对之间的相关关系来反映两组指标之间的整体相关性的多元统计分析方法。他的基本原理是：为了从总体上把握两组指标之间的相关关系，分别在两组变量中提取有代表性的两个综合变量U1和V1（分别为两个变量组中各变量的线性组合），利用这两个综合变量之间的相关关系来反映两组指标之间的整体相关性。其基本思想是：

假设分析两组变量X（X1、X2、X3、...X）n、Y（Y1、Y2、Y3、...Ym）之间的相关性，若用原始方法分别计算两组变量之间的全部相关系数，这样即繁琐又不能抓住问题本质。典型分析法则需提取U（U1、U2、U3、...U）V1、V2、V3、...V）p、V（q，使U1与X1有线性关系，V1与Y1有线性关系，......分析Ui和Vi的相关关系，然后找出X、Y之间的相关关系。典型分析法的原理可用图1表示。

这种方法的优点是可以同时分析一组可变量与一组依变量之间的关系，而不适合用于分析只有一个依变量的情况。

1.5单纯形法

单纯形法是美国科学家豪丹西格1947年首先提出的。他是在一定图形顶点上按一定的规则进行试探性搜索，其试验点根据试验情况逐步调整到最佳条件，是一种动态调优的方法。其基本原理是：

设S=f（X，Y），其中S为产物收率，X为底物浓度，Y为反应时间。

第一步，首先安排3次实验，假设实验a底物浓度、反应时间固定，实验b反应时间、底物浓度均比实验a大，实验c反应时间比a短、底物浓度比实验b大，实验a、b、c分别得3个产物收率。

第二步，建立平面坐标系，以底物浓度为X轴，反应时间为Y轴。假如优化的目的是提高收率，实验a、b、c的3个结果中，设a的收率为最低，则a为最差点，取bc直线的中点o、并与a相连，延长ao至d。在基本单纯形中，使od=ao；在·ao，λ为系数，即进行改良单纯形中，使od=λo

扩张或收缩处理，目的是加快优化过程。

第三步，安排d点的实验，b、c、d组成新的单纯形。比较b、c、d3个实验的实验结果，设c的实验结果为最差，取bd的中点、与c相连，延长至e点。确定e点的位置时，同样存在是否进行扩张或收缩的选择。

第四步，安排e点的实验，b、d、e组成新的单纯形。比较b、d、e3个实验点的实验结果，设b点最差，根据上述步骤确定f点，再安排f点的实验，......，直至实验结果不再更优。单纯形法的原理可用图2表示。

因此，利用单纯形法首先要找出一组基础的组合，并以此为起点，根据最优条件，找出符合目标更优的另一组合，重复此过程，直到实验结果不再更优。单纯形法是一种直接搜索法，优点是速度

快，适应面广；但是单纯形法是一种局域的搜索

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e

y

b

反应时间

d

O

a

c

底物浓度

图2单纯形法原理示意图

x

响应面分析

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f影响因子筛选

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Plackett-Burman设计部分因子设计法

最陡爬坡实验

中心组合设计

Box_Behnken设计法

图3响应面法试验设计流程图

法，不能保证是全局的最优点。

1.6响应面法

响应面法（RSM）是1951年Box-Wilson开发的用于化学过程因子优化的一种综合性方法。响应面法采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对函数响应面和等高线分析，精确研究各因子与响应值之间的关系，寻求最优工艺参数，解决多变量优化问题。他可以用于描述单个试验变量对响应值的影响、确定试验变量之间的响应关系、描述所有试验变量对响应值的综合影响。响应面法具有实验次数少、周期短、精度高等特点，可快速有效地确定多因子系统的最佳条件，因此，是一种有效地优化基础实验条件的技术。RSM已经在食品、医药、生物等领域广泛应用。

3响应面法在生物过程优化中的应用

3.1Plackett-Burman设计法的应用

Plackett-Burman设计法是一种两水平的实验设计方法。他试图用最少的实验次数使因子的主效果得到尽可能精确地估计，适用于从众多的考察因子中快速有效地筛选出最重要的几个因子，供进一步优化研究用。但该法不能考察各因子的交互作用。因此，他通常作为培养基优化的初步实验，用于确定影响培养基的重要因子。

Plackett-Burman设计法采用Hadamard矩阵，设计的准则为：①对k个因子，需要进行N=k+1个实验，为便于进行方差分析，往往要求k至少包括1～3个虚构变量，即空项，且k为奇数；②每个因子取两水平，即用“+”、“-”分别代表其高、低水平，低水平为原始培养条件，高水平取值约为低水平的1.25倍。③矩阵每行含“+”的数目为（k+1）/2，含“-”的数目为（k-1）/2，而每列含“+”、“-”的数目相等；④矩阵第一行任意排列，但必须符合上述要求，最后一行全部为“-”；其余行以上一行的最后一列为该行的第一列，上一行的第一列为该行的第二列，其余类推。根据实验结果，计算出各因子的t值和显著水平。一般选择显著水平大于80%的因素作为重要因素。

ChennupatiS等利用Plackett-Burman设计法对影响Rhodotorulamucilagi-nosa产生脂肪酶的重要因子进行筛选，其中淀粉、大豆粕和大豆油对脂肪酶的影响都高于80%，是重要的因子。刘海燕等以MRS为基础培养基，对12个乳酸菌生长促进因子以及培养基的初始pH，采用Plackett-Burman设计法进行筛选，蔗糖、乳清粉、啤酒和初始pH四个

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响应面法在生物过程优化中的试验设计

响应面法一般包括以下几个步骤：

a）影响因子的筛选：确定各因子的影响程度，

选择显著影响响应值的因子。现在国际上常用的方

frac-法有Plackett-Burman设计法和部分因子设计（tionalfactorialdesign，FFD）。b）最陡爬坡试验确定主要影响因素的水平：以试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速经济地逼近最佳区域。

c）利用中心组合设计（centralcompositede-sign，CCD）和Box-Behnken设计法进行响应面分析，寻求最佳的试验条件以及因素间的交互作用。响应面试验设计过程可以用图3表示：

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田泱源，等：响应面法在生物过程优化中的应用11

重要因素对植物乳杆菌的增殖比较明显。孙力军等采用Plackett-Burman法设计对影响B.amyloliquefa-ciensES-2-4产脂肽类抗菌物质产量的12个因子进

行筛选，确定影响抗菌物质产量的关键因子为KCl、FeSO4和温度。

3.2部分因子设计法

部分因子设计法（FFD）也是一个两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一个多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。但部分因子设计实验的次数要比Plackett-Burman法多，如6因子的26-2部分因子设计需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。Albuquerque利用24部分因子设计法研究Can-didalipolytica发酵生产生物乳化剂的培养基，从玉米油、（NH）NH）42SO4、（22CO、KH2PO4四个因子中筛选出（NH）NH）42SO4、（22CO、KH2PO4都为显著影响因子。刘金国等利用26-2部分因子试验筛选出链霉菌702发酵产抑真菌物质的关键因素为玉米淀粉和蛋白胨，然后由所拟合的数学模型确定产抑真菌物质随两者的变化趋势，利用最陡爬坡法确定其最佳值，并以此作为响应面法的中心值进一步优化。

上述两种设计方法通常作为响应面优化法的初步实验，从影响生物过程的众多因子中筛选出重要的因子，然后利用响应面优化技术确定生物过程的最优化组合。

3.3中心组合设计法

中心组合设计（CCD）是一种国际上较为常用的响应面法，是一种5水平的试验设计法。采用该法能够在有限的实验次数下，对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价，而且还能对各因子进行优化，以获得影响培养基的最佳条件。对k个因子的2k中心组合设计需要的实验总数N=2k+2k+n0，其中2k为轴点的实验次数，n0为中心点重复的实验次数。对由实验方案所得实验结果按下面的多元二次方程进行拟合，以用于描述各因子对生物过程的影响。

y=β0+∑βiXi+∑βiiX2i+∑βijXiXj

根据拟合的数学模型及方差分析结果，评价每个因子及其交互作用对生物过程的影响程度，并利用响应面等高图直观地描绘其结果，最后从数学模

型和响应面等高图求出目标最大时的最优化条件。ChauhanAK等利用中心设计法对Streptomyceslavendulae发酵生产胆固醇氧化酶进行详细研究，对麦芽膏、大豆粕、K2HPO4和MgSO4进行试验设计，根据其回归分析结果，模型的复相关系数R2=0.9992，这说明该模型与实验数据的拟合程度达到99%，而且还计算出当麦芽膏、大豆粕、K2HPO4、MgSO4分别为20g/L、20g/L、0.6g/L、2.0g/L时胆固醇酶的活力最高，达到2.21U/mL，而当所有因素都处于中心水平时，胆固醇酶的活力为1.67U/mL，可见优化后活力提高了32%。Gao等用中心设计法对Lactobacillusfermentum发酵培养基进行优化，选取了蛋白胨、尿素及酵母膏3个重要因子进行设计分析，得出在蛋白胨14.4g/L、尿素0.5g/L、酵母粉7.3g/L的情况下，Lactobacil-lusfermentum的生物量最高，达到1.8×109CFU/mL，比优化前提高了64%。顾骏等采用中心设计法对他克莫司发酵培养基进行优化设计，选择了葡萄糖、花生粉和酵母粉为重要因素进行分析，得到的模型复相关系数R2=0.9007，最优点为葡萄糖6.14g/L、花生粉12.28g/L、酵母粉1.52g/L，他克莫司的产率由60%提升到了90%。3.4Box-Behnken设计法

Box-Behnken设计法是另一种国际上常用的响应面法，是一种三水平的实验设计法，同样具有响应面的优点。

杨梅等研究苏云金芽孢杆菌发酵培养基的优化，先采用Plackett-Burman设计分析培养基的配方，确定了玉米淀粉、黄豆饼粉和酵母粉为显著因素，运用最陡爬坡实验确定了3种重要因子的最适浓度范围，然后通过Box-Behnken设计得出3种重要因子的交互作用及最佳条件，确定苏云金芽孢杆菌LLB19菌株产芽孢最佳发酵培养基为：玉米淀粉20.0g/L，黄豆饼粉26.7g/L，酵母粉5.5g/L，K2HPO40.3g/L，MgS0·47H2O0.2g/L，CaCO30.4g/L，ZnSO40.2g/L。在最佳发酵培养基条件下，LLB19芽孢数为4.25×107个/mL，与初始培养基条件下芽孢数3.41×107个/mL相比提高了24.6％。王雪莲等对枯草芽孢杆菌B579的培养基进行优化，得到黄豆饼粉、牛肉膏、玉米粉3种重要因子的最适浓度分别为13.97g/L、8.89g/L、12.57g/L，枯草杆菌的最大生物量达到1.22×1010CFU/mL，是优化前的30倍。（下转第53页）

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张桂，等：酶法检测食品中铅离子的研究53

采用酶法测定食品样品的具体条件为：脲酶用量2.0mL、反应温度30℃、反应时间20min、显

色时间30min。测定结果见表1。

表1

样品番茄酱(Pb)松花蛋(Pb)

食品样品中铅含量测定结果

脲酶法检测结果

mg/kg0.6890.231

t值2.2872.245

石墨炉法检测结果

mg/kg0.7650.258

番茄酱和松花蛋的预处理液中，6μg/mL的铅溶液加标回收率分别为98%和85%，因而认为脲酶法的检测结果是确实可行的。

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注：表内数据均为3次测定结果的平均值。

t0.05（3）=2.3534，表中t值均小于此值，说明

p=0.95，差异不显著，可认为脲酶法的检测结果与原子吸收分光光度法的检测结果没有明显差异，在

（上接第11页）

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随着统计软件的不断开发，上述统计优化技术（包括试验设计、模型拟合、方差分析、响应面图解和最优条件的分析）都可以用商业化的统计软件来完成，如著名的统计软件SAS和DesignExpert。

［5］郝学财，余晓斌，刘志钰，等.响应面方法在优化微生物

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4小结

生物过程优化是一个极其复杂的试验过程，而

（1）:1277-1280.

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液体发酵抗菌脂肽培养基及其主要影响因子筛选［J］.食2008（5）：60-63.品工业科技，

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佳培养基响应面法优化［J］.江苏农业学报，2009，25（1）：212-215.

且在生物技术产业化过程中又是一项十分重要的工

作。科研实践表明，合理使用优化方法，在生物过程优化工作中可获得事半功倍的效果。响应面法的应用研究结果表明，响应面法可以从更广泛的范围内考察因素之间的组合，以及对响应值的影响。随着统计软件的发展，统计优化技术，尤其是响应面法将在优化过程中得到越来越广泛的应用。选择合适的统计软件，能够迅速、可靠、简易地进行优化实验的安排和数据分析，寻找生物过程的最佳组合。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/fdj4.html