微生物生物学实验指导 - 图文

目 录

实验规则????????????????????????????????2

实验一 环境中微生物的检测?????????????????????????3 实验二 细菌的简单染色???????????????????????????7 实验三 细菌的革兰氏染色??????????????????????????10 实验四 细菌的芽孢染色???????????????????????????12 实验五 细菌的荚膜染色???????????????????????????14 实验六 细菌的鞭毛染色及其运动性观察????????????????????16 实验七 放线菌的形态观察??????????????????????????19 实验八 酵母菌形态及细胞结构的观察?????????????????????23 实验九 丝状真菌形态观察????????????????????????26 实验十 几种常用培养基的制备???????????????????????30 实验十一 高压蒸汽灭菌和干热灭菌??????????????????????35 实验十二 噬菌体效价的测定?????????????????????????40 实验十三 微生物对大分子化合物的水解??????????????????43 实验十四 微生物对糖的利用?????????????????????????46 实验十五 营养元素对微生物生长的影响 ???????????????????48 实验十六 温度对微生物生长的影响??????????????????????50 实验十七 pH值对微生物生长的影响?????????????????????52 实验十八 紫外线对微生物生长的影响?????????????????????55 实验十九 抗生素对微生物最低抑制浓度（MIC）的测定?????????????57 实验二十 大肠杆菌生长曲线的测定????????????????? ???? 60 实验二十一 显微镜下细胞直接计数?????????????????????? 63 实验二十二 显微镜下测量微生物细胞的大小?????????????????? 66 实验二十三 乳酸发酵及乳酸菌的分离和鉴定??????????????????70 实验二十四 稀释法平板法分离土壤中的微生物?????????????????78

附录Ⅰ????????????????????????????84 附录Ⅱ?????????????????????????????91 参考文献????????????????????????????94

实 验 规 则

1． 按时上课，不得迟到早退。如有疾病不能上课者，应向任课教师提供医院证明。

2． 实验前请先预习《微生物生物学实验》相关内容，明确实验目的、原理、操作方法，

以保证实验顺利进行。

3． 做实验时要严格遵守实验纪律及操作规程，培养严肃认真的科学态度。不得随意涂改、

编造实验数据，对实验结果进行认真分析。

4． 在实验台上除实验用具和实验指导外，不得乱放其它物品。勿将菌液、染液、药品等

洒在桌面上或地面上，如有菌液污染桌面或地面时，不要随便涂抹，应该用75%酒精或5%石炭酸溶液消毒。

5． 实验过程中保持实验室肃静，不得随便走动，不得高声谈笑。

6． 接种时必须严格遵守无菌操作规程，不得讲话。接种用的接种环、接种针及其它接种

用具，在使用前后必须经过火焰灭菌或放在指定的消毒器皿内，不得随便放置。

7．实验完毕时，必须整理实验台，擦净桌面，打扫地面后方可离开。

8．爱护仪器、用具。节约药品，并按指定方法使用，不得自己乱用。如有损坏或故障必须

及时报告指导教师，并登记在物品损坏登记簿上。

9．按时观察实验结果，以实事求是的科学态度完成实验报告，力求简明准确。实验报告包

括实验目的、原理、方法、结果及回答问题（讨论）等五部分内容。字迹要清楚，绘图用铅笔。

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实验一 环境中微生物的检测

目的

1．用实验证明在我们生活的环境周围存在着各种各样的微生物； 2．了解无菌操作在微生物实验中的重要性。

原理

微生物生活在我们周围，其中有些附着于尘埃上，有些漂浮于大气中，还有些沉降在各种物体的表面。土壤中微生物的种类和数量最多。此外，在人体和动物体的口腔、呼吸道、消化道以及动植物体表都存在着各种各样的微生物。由于这些微生物个体微小、结构简单、人们很难用肉眼看到，因而常常忽略了它们的存在。有些微生物种类对我们人类有益，有些则往往能引起工农业产品及实验室中各种实验材料的污染。在实际工作中，必须牢固建立无菌操作概念，熟练各种微生物操作技术，防止杂菌污染。在我们生活的环境中存在着种类繁多的微生物，在适宜的温度下，将这些微生物接种到适合于它们生长的固体培养基表面，经过一段时间，即可由单个菌体或孢子生长、繁殖形成一个个肉眼可见的菌落。根据各种微生物菌落形态的不同，即可初步辨别出细菌、放线菌、酵母菌和丝状真菌。

材料

1．5套无菌培养皿

2．150ml细菌培养基（LB）

方法

1．制备培养基平板：

点燃酒精灯，取5套无菌培养皿置于左手边，再取1瓶熔化好的培养基（冷却至45℃

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左右）置于右手边，按照无菌操作法, 即右手拿好装有培养基的三角瓶，左手拔下棉塞，并在火焰上轻烧瓶口，边烧边转动。然后用左手大拇指和食指打开皿盖，使之成45°角，向每皿中到入约15毫升培养基，平放，待其凝固。如图1-1所示。 2．接种：

（1）取1套培养基平板，打开皿盖，15-20分钟后，盖好皿盖并注明处理方式； （2）取1套培养基平板，在酒精灯旁打开皿盖，取一钱币于培养基表面轻轻涂抹后，盖好

皿盖并注明处理方式；

（3）取1套培养基平板，打开皿盖，用力将衣物上或头发上灰尘摇落在培养基表面，盖好

皿盖并注明处理方式；

（4）取1套培养基平板，打开皿盖，将平板放在距口6-8厘米处，用力咳嗽，盖好皿盖并

注明处理方式；

（5）不打开第5套培养基平板，注明为对照，以“CK” (check) 表示； 3．将所有培养皿倒置，于28℃温箱中培养一周，观察结果。

结果

将结果填入下表：

表1-1 环境中微生物检测结果

培养皿号 NO．1 NO．2 NO．3 NO．4 NO．5

菌落数 （个） 菌落 类型 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 大小 3

菌 落 特 征 形态 表面干湿 颜色 边缘

图1-1 制备培养基平板

问题

1．菌落是怎样形成的？

2．为什么在培养过程中要将培养基平板倒置？ 3．为什么在实验中要留空白对照？

4．比较测试培养皿和对照培养皿中的菌落数说明什么问题？ 5．通过实验谈谈你对无菌操作的认识？

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图1-2 细菌菌落特征

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实验二 细菌的简单染色

目的

1．学习微生物涂片和染色的基本技术，掌握细菌简单染色法； 2．学习无菌操作，并巩固显微镜的使用方法； 3．学习在油镜下观察细菌的个体形态。

原理

由于细菌体积小、菌体透明，活体细胞内含有大量水分，且对光线的吸收和反射与周围背景没有显著的明暗差，因而很难在普通光学显微镜下观察它们的形态和结构。只有经过染色，借助颜色的反衬作用才可看清菌体形态以及菌体表面结构。染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。

能够使微生物着色的化合物被称为染色剂，染色剂一般都是成盐化合物。目前普遍采用的微生物染色剂多为苯的衍生物，其化学结构中除含有苯环外，还连接有发色团和助色团。发色团可使化合物显色，而助色团则能增加色度，并因具有电离特性，可与菌体细胞相结合，从而使其着色。

含有酸性助色团（如羟基-OH）的染色剂称为酸性染色剂，其电离后分子带负电，可与钠、钾、钙、氨等离子结合，多用于细胞质的染色，如酸性品红、刚果红等。含有碱性助色团（如氨基-NH2）的染色剂称为碱性染色剂，其电离后分子带正电，主要用于细胞核和异染粒等酸性细胞结构的染色。由于细菌细胞质中布满核物质和异染粒等结构，因此细菌染色一般采用碱性染色剂，通常包括氯化物、硫酸盐、醋酸盐或草酸盐等。

细菌的简单染色，即只利用一种染色剂使菌体着色。此法操作简单，适用于细菌形态的观察。通常细菌的简单染色也采用碱性染色剂，如结晶紫或碱性品红等，碱性染料不是碱而是一种盐，电离时染料离子通常带正电荷。而在中性、碱性或弱酸性的溶液中，细菌细胞通常带有负电荷，这样带正电荷的染料离子就容易与带负电荷的菌体细胞相结合并使其着色。染色后便于观察细菌的形态、大小和排列方式等特征。

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材料

1．菌种：大肠杆菌（Esecherichia coli）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

2．染料：草酸铵结晶紫染液。

3．其它：载玻片，无菌水，洗瓶，擦镜纸，吸水纸，二甲苯或无水乙醚：无水乙醇（3：1）混合液，香柏油及接种用具。

方法

一、细菌的简单染色

1．涂片：在洁净的载玻片中央滴1小滴无菌水，用无菌接种环（火焰灭菌）挑取少量大肠杆菌或金黄色葡萄球菌分别与无菌水充分混合，涂成极薄的菌膜；（注意：菌量不宜过多，否则菌体堆积成块不易看清个体形态！）

2．固定：手执玻片一端，将有菌膜的一面朝上，通过微火3-4次，使水分蒸干；（注意：可用手背接触涂片反面，以不烫手为宜。否则过分烘烤会导致菌体变形！）

3．染色：将玻片置于玻片架上，待其冷却后，在涂片部位滴加适量（盖满菌膜）的草酸铵结晶紫染液，染色1分钟；

4．水洗：倾去染液，用普通蒸馏水自玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染液的颜色为止。 5．干燥：用吸水纸吸去多余水分；（注意：勿擦去菌体！）

6．镜检：在低倍镜下找到视野后，转换油镜观察，绘制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌形态图； 7．清理：实验完毕后，清洁油镜头，整理显微镜使其复原并在记录本上登记。将染色片放入含有5%苯酚的废片缸中。

二、油镜的使用和清理 1．油镜的使用：

（1）在低倍镜下找到镜检部位后，用粗螺旋将镜筒提升约2厘米，将油镜转置镜筒正下方；

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（2）在镜检部位滴上1滴香柏油；

（3）从侧面注视，用粗螺旋将镜筒小心降下，使油镜侵入香柏油中，让镜头几乎与标本相

接；（注意：不要用力过猛以免压碎玻片损坏镜头！）

（4）从目镜观察，调节光线使其明亮，再调节细螺旋使镜筒缓慢提升，直至视野内出现清

晰物象为止。 2．油镜的清理：

观察完毕，提升镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，接着用另一张擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹，最后用干净擦镜纸再擦拭两遍以除去残留的二甲苯。涂片处香柏油的处理与此相同。（注意：不要过量使用二甲苯，以免其残留在镜头上影响观察！）

结果

分别绘出油镜下大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图，注明放大倍数，并描述它们的排列方式。

问题

1．制片时为什么要固定？固定时应注意什么事项？

2．在使用低倍镜、高倍镜和油镜进行观察时应如何调节光线？ 3．你在染色过程中遇到什么问题？应如何避免？ 4．在使用和清理油镜过程中应注意哪些问题？

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实验三 细菌的革兰氏染色

目的

了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。

原理

细菌的革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。该方法可将所有细菌区分为革兰氏阳性（G＋）和革兰氏阴性（G－）两大类，是细菌学上比较重要和广泛应用的鉴别染色法。

该方法的基本步骤为：先用结晶紫（初染剂）进行简单染色，再用碘液（媒染剂）媒染，碘液能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染色剂与细胞的结合力， 随后用95%乙醇脱色，最后用番红（复染剂）进行复染。。

细菌的细胞壁成分和结构不同，因而对革兰氏染色产生的反应不同。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网格状结构组成，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而使网状结构的孔径缩小，细胞通透性降低，结果使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此呈现蓝紫色；相反，革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，因而导致细胞壁通透性增加，并使结晶紫-碘复合物容易被乙醇脱色，最后被染上复染液番红的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色结果不仅与酒精脱色程度有关，同时也与菌龄密切相关，通常用处于对数生长期的菌体进行染色为宜。若菌龄过老，可导致革兰氏阳性菌被染成阴性。

材料

1．菌种：大肠杆菌（Esecherichia coli），37℃ 培养12~16小时

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），37℃ 培养16~18小时 2．染料：草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红染液

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3．其它：载玻片，无菌水，洗瓶，擦镜纸，吸水纸，二甲苯，香柏油及接种用具

方法

1．涂片：取一洁净的玻片， 滴加1滴无菌水。以无菌操作法取大肠杆菌涂片，干燥固定； 2．染色：

（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴覆盖于涂片处约1分钟，水洗； （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并用碘液覆盖1分钟，水洗；

（3）脱色：倾斜载玻片，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗直至流出的乙醇不带紫色为止，

立即用水冲净乙醇；

（4）复染：用番红染液覆盖1分钟（可适当延长时间至2分钟），水洗，风干；

采用相同的方法进行金黄色葡萄球菌的革兰氏染色（也可在教师指导下进行混合涂菌）； （6）镜检：干燥后置油镜下观察；

（7）清理：整理桌面，将显微镜恢复原样，将废片放入废片缸内。

结果

根据各菌革兰氏染色反应结果，填写表3-1：

表3-1 细菌的革兰氏染色

菌名 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌

菌体颜色

菌体形态（图示）

G＋或G－

问题

1．革兰氏染色的关键步骤是什么？为什么？应当如何控制？

2．当需要对一株未知菌进行革兰氏染色时，应从哪些方面注意控制条件，才能保证对菌株的染色结果可靠？

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实验四 细菌的芽孢染色

目的

学习并掌握细菌芽孢染色的原理及方法。

原理

芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染色剂亲合力不同的原理，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而加以区别。芽孢通常具有厚而致密的壁，透性低，不易着色和脱色，当用着色力强的弱碱性染色剂孔雀绿在加热条件下染色时，芽孢和菌体同时着色，进入菌体的染色剂可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。经对比度大的复染液番红染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，呈绿色；而菌体被复染剂染成红色，易于区别。进行芽孢染色的菌株应控制其培养时间，如菌株培养时间过长，芽孢则从菌体脱落出来。因此，如果需要观察芽孢在菌体内着生的位置，一定要根据各菌的特点来确定培养时间。

材料

1.菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），26℃-28℃ 培养2~3天； 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），26℃-28℃ 培养2天； 2.染色剂：孔雀绿染液，番红染液

3.其它：载玻片，无菌水，洗瓶，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，接种用具

方法

1．制片：将枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌分别涂片、干燥固定；

2．染色：用吸水纸块盖住涂片处，然后在吸水纸上滴加孔雀绿染液至饱和。加热使染液微

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冒蒸汽后，保持5分钟。注意：加热时应不断添加染液，不要使吸水纸干燥；

3．水洗：待玻片冷却后，用镊子除去吸水纸，再用水瓶轻轻冲洗至孔雀绿不再褪色为止 4．复染：用番红染液染色1~2分钟，水洗； 5．镜检：涂片干燥后，置油镜下观查； 6．清理：清理显微镜、废玻片及桌面。

结果

观察染色结果，绘图。(注意芽孢在菌体内的位置、大小和形状)

问题

1．为什么在孔雀绿加热染色时，要待玻片冷却后才能冲洗？

2．分别从菌龄、制片等方面，简述细菌芽孢染色需要注意的技术要领。

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实验五 细菌的荚膜染色

目的

学习并掌握细菌荚膜染色的原理及方法。

原理

荚膜是包围细菌细胞外的一层粘液性物质，主要成分为多糖类，不易着色，其含水量高达90%以上，易变形，因此荚膜染色通常采用衬托染色法或称负染法，即将菌体和背景分别着色，从而把不着色且透明的荚膜衬托出来。

本实验以钾细菌为材料。钾细菌是50年代分离出来的一种硅酸盐细菌，它可分解正长石和磷灰石等矿石，并释放出钾、磷等元素，又称为硅酸盐细菌。钾细菌的细胞通常单生或成对生长，有周生鞭毛，在无氮培养基中生长时能形成很厚的荚膜。

材料

1．菌种：钾细菌（Bacillus mucilaginosus），点接于阿须贝平板上，26℃-28℃ 培养3天。 2．染色剂：墨汁，使用前必须用滤纸过滤，除去墨汁中的杂质。

3．其它：载玻片，无菌水，洗瓶，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，接种用具。

方法

1．制片：在洁净载玻片的中央滴加1滴无菌水（或6%葡萄糖液），取少许培养72小时的

钾细菌制成涂片，空气中风干；

2．染色：用番红，并在涂片处染色1-2分钟，水洗， 稍风干；

3．滴加一滴墨汁在载玻片一侧，左手持此玻片，右手另拿一干净玻片作推片用，将推片边缘平整的一端与混合菌液成30°角接触，顺势将菌液推开，使其涂成一薄层，并在空气中充分自然干燥；

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4．镜检：玻片自然干燥后，置油镜下观察， 菌体为红色，荚膜无色， 背景黑色； 5．清理：清理显微镜、废玻片及桌面。

结果

绘制钾细菌荚膜染色图并描述其染色结果。

问题

1．简单染色能否观察细菌荚膜？请解释原因。

2．细菌的荚膜有何特点，在对其染色观察结果时应注意什么？

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实验六 细菌的鞭毛染色及其运动性观察

目的

1．学习并掌握细菌的鞭毛染色法； 2．学习并掌握悬滴法观察细菌运动。

原理

鞭毛是细菌的运动器官，它着生于细胞膜上。其直径通常为10~20nm，只能用电子显微镜进行观察。只有采用特殊染色方法时，才可在普通光学显微镜下看到。本实验采用银染法，即先利用媒染剂促进银离子在鞭毛上的沉积，加粗其直径，这样就能在显微镜下看到深褐色的菌体及褐色的鞭毛。媒染剂是一种可以和染色剂形成不溶性化合物并能增强染色剂和细胞亲和力的化学物质，它与细胞和染色剂都有很强的结合力，可在染色前使用，也可在加入染色剂的同时使用。按其化学性质可将媒染剂划分为碱性媒染剂和酸性媒染剂两种，前者如矾、硫酸亚铁和酒石酸锑钾等，后者如鞣酸和苦味酸等，本实验使用的媒染剂为鞣酸（也称单宁酸）。

鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一，如大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有些长鞭毛，有些则不长，弧菌和螺菌都具有鞭毛。采用鞭毛染色法虽可观察到鞭毛的形态、着生位置和数目。若只需了解供试菌株是否具有鞭毛，则采用悬滴法较简便。该法可直接在显微镜下通过观察细菌的运动状况，来推断鞭毛是否存在。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，而衰老的细菌鞭毛易脱落，因此，观察时应选用幼龄细菌。

材料

1．菌种：普通变形杆菌（Proteus vulgaris）

大肠杆菌（E.coli）

2．染料：鞭毛染液A液，鞭毛染液B液（需现用现配）

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3．其它：干净载玻片，凹玻片，盖玻片，无菌水，装蒸馏水的洗瓶，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，接种用具。

方法

一、菌株准备：将供试菌株在细菌培养基斜面上连续转接三次，每隔12小时一次， 提供

做鞭毛染色的菌株，菌龄应为12~16小时；

二、鞭毛染色：

1．制备菌液：用无菌长滴管取3-5ml无菌水，沿试管壁轻轻加入普通变形杆菌及大肠杆菌斜面上，将该试管置于37℃温箱中静置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），使菌株的鞭毛逐渐在水中舒展开；

2．制片：取一经洗液浸泡过的干净玻片，分别滴1滴菌悬液于玻片的一端，然后轻抬此端使菌悬液缓慢流向另一端，并在空气中自然干燥固定；（注意：千万不要用火烤！） 3．染色：

（1）在涂片处滴加鞭毛染液A液染色5min；

（2）用蒸馏水充分洗净A液；（注意：一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景很脏，

不易观察！）

（3）用鞭毛染液B液冲去残水，再加B液于涂片处，静置1min； （4）用蒸馏水洗净B液，自然风干； 4．镜检：在油镜下观察鞭毛的形态。

三、悬滴法观察细菌的运动

1．制备菌悬液：用无菌长滴管分别向普通变形杆菌、大肠杆菌斜面滴加5ml无菌水，制成轻度混浊的菌悬液；

2．涂凡士林：取一干净无油的盖玻片，在其四周涂少许凡士林； 3．滴菌悬液：用无菌长滴管分别向盖玻片中央滴1滴菌悬液；

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4．盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌悬液，并轻轻盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后反转凹玻片，使菌液恰好悬在凹槽中央；

5．镜检：由于菌体透明，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器，以增大反差，便于观察；可先在低倍镜下找好视野，再转换至油镜下仔细观察。注意区分细菌运动与布朗运动的区别；

6．清理：清理显微镜、废玻片及桌面。

结果

1．油镜下观察普通变形杆菌的鞭毛形态，绘图并描述染色结果。 2．将悬滴法观察结果记录于下表：

表6-1 细菌的鞭毛染色

菌名 普通变形杆菌 大肠杆菌

运动方式

鞭毛着生位置

问题

1．为什么在染色前必须将供试菌株连续传接几代？

2．你在显微镜下看到的鞭毛是否为原来的大小和形状，为什么？

3．在不经固定和染色的情况下观察细菌，应如何调节显微镜？观察细菌运动时，如何区分 细菌的运动、布朗运动和菌液的流动？

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实验七 放线菌的形态观察

目的

1．学习观察放线菌形态的基本方法； 2．观察放线菌的个体形态特征。

原理

放线菌是一类丝状原核微生物，因其菌落在固体表面常呈放射状生长而得名。放线菌主要存在于土壤中，大部分是腐生菌，少数寄生，也有与植物共生固氮的，如弗兰克氏菌属。从土壤中分出的放线菌主要是链霉菌（主要孢子丝的形态特征见图7-1），放线菌中除链霉菌以外的其它种通常被称为稀有放线菌。

放线菌是最主要的抗生素产生菌，且约有70%的抗生素来源于链霉菌，因而其形态特征是菌种选育和分类的重要依据。放线菌通常由分枝发达的菌丝体组成，菌丝直径为0.2~1.2μm。主要由两部分组成，一部分长在培养基内，一般没有横隔，有固定和吸收养分的作用，称为基内菌丝或营养菌丝；当基内菌丝发育到一定阶段，即可向空中伸展形成气生菌丝。有的菌种没有气生菌丝。在显微镜下观察时，气生菌丝颜色较深，并且比基内菌丝粗两倍左右。有些种的气生菌丝发育到一定阶段，其顶端可形成孢子丝。有的仅在气丝上形成单个或一对球形孢子。孢子丝分直、波曲、螺旋等形状。螺旋有松、紧、大、小之分，其方向也有左旋和右旋之分，大多数种为左旋 ，少数种则为右旋。螺旋的数目也是种的特征之一。孢子丝的着生方式分为单生、丛生和轮生。轮生是指由一点出发长出三个以上孢子丝的着生方式。大部分放线菌的孢子丝长到一定阶段均可凝聚分裂形成孢子，如链霉菌；少数则以较原始的横隔分裂方式形成孢子，如诺卡氏菌。孢子有球状、椭圆状、杆状、瓜子状等形状，在光镜下即可观察。

放线菌菌落小，与培养基结合较紧密，不易用接种钩挑取，因而难以直接观察。玻璃纸培养法适合直接观察放线菌自然生长的个体形态。玻璃纸具有半透膜特性，若将放线菌

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培养在玻璃纸培养基表面，它可通过玻璃纸吸收培养基中的养分并形成菌落或菌苔，将玻璃纸剪下平贴于载玻片上即可直接观察。插片法适合进行营养菌丝、气生菌丝和孢子丝的比较观察。在接种放线菌的培养基一侧，以45°角插入无菌盖玻片，使放线菌沿培养基与盖玻片交界处生长，并附着于盖玻片上，待菌丝生长一定时间后， 取下盖玻片进行染色，即可直接观察。

图7-1 链霉菌的孢子形态

1．直丝； 2. 弯曲； 3. 簇生； 4. 单轮生，无螺旋； 5. 开环，简单螺旋形钩状； 6．松螺旋； 7.紧螺旋； 8.具螺旋单轮生； 9. 无螺旋二轮生； 10.具螺旋二轮生

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材料

1．菌种：紫色直丝链霉菌（Streptomyces violaoeorectus） 灰红紫类群

黑化链霉菌（Streptomyces nigrificans） 灰褐类群 天蓝链霉菌（Streptomyces coelicolor） 蓝色类群 丰加链霉菌（Streptomyces toyocaensis） 白孢类群

2．染色剂：石炭酸复红染液或草酸铵结晶紫染液 3．培养基：高氏一号培养基

4．灭菌物品：玻璃纸，盖玻片，1ml吸管，培养皿，镊子，玻棒，玻璃刮铲，15×150mm试管分装9ml无菌水。

5．其它：剪刀，载玻片，无菌水，洗瓶，擦镜纸，吸水纸，二甲苯，香柏油及接种用具。

方法

1．玻璃纸培养法

（1）玻璃纸灭菌：将玻璃纸和滤纸剪成培养皿大小的圆纸片，用水浸泡后交互重叠放在培

养皿中，湿热灭菌后备用；

（2）制备平板：将已融化的高氏一号培养基（冷却至45℃左右）倒入无菌培养皿，每皿

约15-20ml，凝固后备用；

（3）铺玻璃纸：用无菌镊子将无菌玻璃纸平铺于培养基表面，若其间有气泡可用无菌玻璃

棒将气泡除去；

（4）制备孢子悬液：向放线菌培养物斜面加入5ml无菌水，用无菌接种环刮下斜面孢子，

混匀备用；

（5）接种：用无菌吸管向玻璃纸表面加入0.1ml孢子悬液，然后用无菌刮铲涂匀，置28℃

培养一周后观察；

（6）制片：在洁净载玻片上滴1小滴无菌水，并稍涂布。用无菌镊子小心取出玻璃纸，再

用无菌剪刀剪下1小块，菌面朝上平贴于水滴上；（注意：其间不能有气泡！）

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（7）观察：将载玻片直接置于显微镜下观察。

2．插片法

（1）制备平板：方法同前。培养基厚度可达培养皿高度的一半；

（2）接种：用接种环从放线菌试管斜面上挑取孢子，在培养基与盖玻片之间做“之”字型

密集划线；

（3）插片：用无菌镊子取无菌盖玻片，以45°角斜插入培养基（插入深度约占盖玻片一

半长度）；

（4）培养：将培养基平板倒置于28℃培养箱中，培养7天；

（5）镜检：用镊子小心取出盖玻片，稍微加热固定，再用石炭酸复红染液染色1分钟，然

后置于载玻片上，用油镜进行观察。（注意：固定时应避免过火加热导致菌丝体变形，染色清洗时应小心以免冲掉菌丝体！）

结果

绘制各放线菌的孢子丝形态图并列表比较说明其菌体形态和菌落特征。

表7-1 放线菌的形态观察

菌名 紫色直丝链霉菌 黑化链霉菌 天兰链霉菌 丰加链霉菌

菌体形态

菌落特征

问题

1．插片法用于观察放线菌各有何优点？ 2．培养放线菌的培养基有何特点？

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实验八 酵母菌形态及细胞结构的观察

目的

1．观察酵母菌的出芽生殖方式；

2．观察酵母菌的细胞形态、主要细胞器及假菌丝形态； 3．学习并掌握区分酵母菌死活细胞的染色方法； 4．观察酵母菌的子囊及子囊孢子形态。

原理

酵母菌分属于子囊菌门和担子菌门，一些菌株未发现有性生殖。酵母通常是多形态、不运动的单细胞微生物，很多酵母细胞在一定条件下，芽殖后不脱落而形成假菌丝。它们的菌落形态类似于细菌，但体积较大。其细胞内部结构清晰，可通过不同的染色方法在高倍镜下进行区分，如中性红是液泡的活体染色剂，可将其染成红色；脂肪滴可被苏丹黑氧化而呈蓝黑色；肝糖粒可被碘液氧化呈深红褐色。无性生殖有芽殖和裂殖两种，芽殖又有单出、双出和多出之分。酵母菌的有性生殖一般能形成4~8个子囊孢子。

酵母菌的死活细胞可通过美兰染色加以区分。美兰（又称亚甲基蓝）是一种无毒性染色剂，其氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞具有较强的还原能力，可使美兰由蓝色的氧化型转变为无色的还原型。处于代谢旺盛的细胞还原美兰染料的能力强，细胞为无色，而代谢缓慢的老细胞和死细胞为浅蓝色或深蓝色。

材料

1．菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

热带假丝酵母（Candida tropicalis）

2．染料：0.1%美兰染液，0.1%中性红染液，0.5%苏丹黑染液，二甲苯，0.5%番红水溶液，碘液、0.5%孔雀绿染液，95%乙醇溶液。

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3．培养基：葡萄糖醋酸盐培养基，马铃薯葡萄糖培养基（PDA）。

4．其它：无菌盖玻片，无菌镊子，载玻片，盖玻片，无菌水，洗瓶，擦镜纸，吸水纸及接种用具。

方法

1．芽殖观察

（1）制片：取一洁净载玻片，在其中央滴1滴美兰染色液，用接种环分别取少许酿酒酵母

菌苔在染液中涂匀。再用镊子取一盖玻片，以45°角与菌悬液接触后，轻轻盖在菌悬液上，避免产生气泡，然后用吸水纸吸干多余液体；

（2）观察：将水压片置于高倍镜下观察。观察芽殖和死、活细胞的颜色。30分钟后，再

次观察死、活细胞数是否发生了变化。 2．假菌丝的观察

（1）培养：将热带假丝酵母划线接种于马铃薯葡萄糖培养基平板表面（注意倒平板不要太

厚），26℃~28℃培养1~2天，取出培养物，在无菌条件下，将一事先灭菌的无菌盖玻片轻轻压在划线处，继续培养1~2天； （2）观察：打开培养皿盖，于高倍镜下直接观察。 3．酿酒酵母细胞内结构的观察

（1）液泡：在洁净载玻片中央滴1滴0.1%中性红染液，用接种环挑取少许酿酒酵母菌苔

涂于染液中，加盖盖玻片后制成水压片，染色4-5分钟，高倍镜下观察液泡在细胞中的颜色、位置、大小和数目；

（2）脂肪滴：首先将酿酒酵母涂片、自然干燥固定，然后用0.5%苏丹黑染液染色10分钟，

倾去染液并用吸水纸吸干。接着用二甲苯冲洗涂片至洗脱液无色后，再用0.5%番红染液复染1-2分钟。水洗吸干后，在高倍镜下观察脂肪滴的颜色、位置、大小和数目； （3）肝糖粒：制一碘液水压片，染色1分钟后，高倍镜下观察肝糖粒的颜色、形状、大小

和数目。

（4）酿酒酵母菌子囊孢子的观察

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① 培养：将活化培养2~3次的酵母菌于28℃温箱中培养2-3天，然后移至葡萄糖醋酸

盐培养基斜面上，于26℃~28℃温箱中培养10天；

② 染色：从产孢培养基上挑取少许菌苔于载玻片上，涂片、加热固定后，先加孔雀绿染

色1分钟，水洗，再用95%乙醇浸润30秒，倾去乙醇，然后用0.5%番红液复染30秒，倾去染液，最后用吸水纸吸干；

③ 镜检：在高倍镜下观察子囊孢子的颜色、数目和形状。

结果

1．绘制酿酒酵母的芽殖方式图。 2．绘制热带假丝酵母的假菌丝图。

3．绘制酿酒酵母子囊及子囊孢子的形态图。

问题

1．如何辨别并确定细菌和酵母菌菌落？ 2．简要说明如何区分营养细胞和子囊孢子。

3．用美兰染液染色30分钟前后酿酒酵母菌死、活细胞数发生怎样变化？为什么？

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实验九 丝状真菌形态特征观察

目的

学习并掌握观察毛霉和根霉形态特征的基本方法。

原理

毛霉和根霉都属于真菌的接合菌门。它们是空气中最常见的污染菌。菌落生长迅速，表面呈棉花样，初为白色，以后变灰至褐灰色。菌丝单细胞无横隔，有分枝，多核。毛霉无假根；根霉有假根和匍匐丝。无性生殖产生孢囊孢子。孢囊梗直接由菌丝体上长出，孢囊梗顶端膨大形成孢囊，孢囊成熟破裂后，露出囊轴，囊轴基部与孢囊梗连接处称为囊托。毛霉无囊托，根霉的假根上方产生孢囊梗。孢囊孢子呈球形、卵形或不规则形。有性生殖形成接合孢子，常为异宗配合即由“+”“－”型菌丝接合形成。这些结构均可通过制水压片在低倍镜下进行观察。

很多青霉、曲霉及镰刀菌尚未发现它们的有性生殖阶段，常称为半知菌。 即只知其生活周期的一半。目前已发现有些菌的有性阶段属于子囊菌或担子菌。这三种菌的无性生殖阶段均有特征性的分生孢子梗及分生孢子形态和分生孢子着生方式。它们多是腐生菌，广泛分布于土壤、空气、水果和粮食中。青霉菌落多为灰绿色，菌落质地绒状、絮状、绳状或束状，成熟后表面呈粉末状。青霉菌丝可直接分化形成分生孢子梗，其顶端具有对称或不对称的扫帚状分枝，其上着生几轮小梗，小梗顶端着生成串的球状或卵状的绿色分生孢子。曲霉菌落呈绒毛状或絮状，表面有同心圆形的轮状带。分生孢子梗长在厚壁的足细胞上，不分枝，顶端膨大成球形、椭圆形或棍棒状顶囊。其表面着生一层或两层小梗，下层为柱状初生小梗，上层为瓶状次生小梗，顶端着生成串的球状分生孢子。镰刀菌菌落呈绒毛状，多为白色、粉红色或紫红色。菌丝分隔有分枝。具有两种分生孢子，小型分生孢子梗分枝或不分枝，其顶端有链状或假头状着生的小型分生孢子。大型分生孢子梗不分枝，其顶端着生镰刀状大型分生孢子，多隔，单生或丛生。

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载片培养法是研究丝状真菌生长繁殖全过程的有效方法。即将菌丝体接种在载玻片上的小块培养基薄片上，加盖盖玻片，使丝状真菌只能在载玻片和盖玻片的狭窄空间内横向生长，因而可观察到孢子萌发、菌丝生长及孢子形成的各生长阶段，且不会因观察而污染标本片。

材料

1．菌种：毛霉（Mucor）“+”、“－”型菌株

根霉（Rhizopus） 青霉（Penicillium sp.） 曲霉（Aspergillus sp.） 镰刀菌（Fusarium sp.）

2．浮载剂：乳酸酚溶液。 3．培养基：真菌培养基。

4．其它：无菌培养皿，载玻片，盖玻片，无菌水，擦镜纸，吸水纸及接种钩。

方法

1．形态观察

（1）直接观察：不打开培养皿盖，将培养皿置于载物台上，在低倍镜下直接观察毛霉和根

霉的各部分结构。

（2）制水压片：取一洁净载玻片，于中央滴1滴乳酸酚溶液，用接种针挑取少许菌丝及孢

囊于染液中，用两根接种针将其拉松散，再轻轻盖上盖玻片。注意：千万不要有气泡！置于高倍镜下进行观察。 2．毛霉接合孢子观察

（1）培养：分别在已倒好马铃薯葡萄糖培养基的平皿背面中央划一条线，于线左右分别标

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“－”“+”， 然后取相应的毛霉菌株接种，并在26℃ 恒温箱中倒置培养7天。 （2）镜检：在低倍镜下沿划线处寻找接合孢子，在显微镜下直接观察，或制成水压片进行观察。

3．载片培养法观察菌体形态结构

（1）准备材料：在培养皿内放1张圆形滤纸片，1个U型架，1片载玻片和2片盖玻片，

灭菌后备用；

（2）制薄层培养基：取一平底无菌培养皿，向内倒入约5ml已融化马铃薯葡萄糖培养基，

迅速摇匀使成薄层。凝固后，用无菌解剖刀割为1cm2 小块；

（3）制片：在无菌操作下，向U型棒支撑的载玻片上移入2小块培养基，在中央分别接

种青霉、曲霉和镰刀菌，盖好盖玻片轻压勿留气泡。然后用无菌滴管向圆滤纸片上滴加灭菌的20% 甘油，至滤纸完全湿润为止； （4）培养：26℃~28℃培养3天后开始观察。 4．菌落形态观察

制备查氏培养基平板，在平板中央分别接种青霉、曲霉及镰刀菌，26℃~28℃下恒温培养5天后，观察并比较菌落形态。

结果

1．绘制毛霉和根霉菌丝及孢囊形态结构图。

表9-1 根霉与毛霉形态图

菌种 根霉 毛霉

2．比较青霉、曲霉和镰刀菌的菌落特征，并绘制青霉、曲霉和镰刀菌的形态结构图，填入

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无性

有性

下表。

表9-2 青霉、曲霉和镰刀菌的形态观察

菌种 青霉 曲霉

菌落特征

镰刀菌

菌体形态图

问题

1．指出根霉和毛霉的形态差异。 2．制水压片时如何避免产生气泡？ 3．通过本实验总结毛霉的生活史。

4．比较实验中两种真菌形态观察方法-水压片法和玻片培养法的优缺点，你认为哪种方法

更好？

5．为避免真菌孢子污染空气，在操作时应注意哪些问题？

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实验十 几种常用培养基的制备

目的

学习并掌握常用培养基的制备方法。

原理

培养基是一种人工配制的适合微生物生长繁殖并累积代谢产物的混合养料。它通常含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六大类营养成分。就其营养物而言，可分为天然培养基如麦芽汁培养基、马铃薯培养基和合成培养基如高氏1号培养基。就其物理状态而言，可分为液体、半固体及固体培养基，前者不含凝固剂（琼脂、明胶或硅胶）而后两者通常分别含有0.5% 和2%的凝固剂。就其用途而言，可分为基础培养基、加富培养基、鉴别培养基和选择培养基。根据培养微生物种类的不同，要求培养基具有不同的pH值。大多数细菌、放线菌生长的最适pH值为中性至偏碱性，而酵母菌和霉菌则喜好偏酸性。此外，培养基的灭菌方法则应根据营养物的不同来选择，主要有高压蒸汽灭菌法、过滤除菌法等。

牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基及高氏一号培养基是几种常用的培养基，它们分别用来培养细菌、真菌及放线菌。前两者均属于天然培养基，而后者为合成培养基。牛肉膏是牛肉浸液的浓缩物，含有丰富的营养物质，可提供碳源、氮源及多种维生素。蛋白胨是酪蛋白、大豆蛋白或鱼粉经蛋白酶水解后的中间产物，含有胨、氨基酸等丰富的氮源物质。马铃薯浸汁同样也含有丰富的氮源物质和多种维生素。在培养基灭菌前应按照培养物要求调节合适的pH值。

材料

1．试剂：牛肉膏，蛋白胨，蔗糖，可溶性淀粉，马铃薯，NaCl，KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，琼脂，1mol/L NaOH，1mol/L HCl。

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2．器皿：台式天平，2000ml搪瓷锅，500ml烧杯，500ml三角瓶，500ml、1000ml量筒，漏斗，15×150mm试管，玻棒，1ml、10ml吸管，滴管。 3．其它：pH试纸，药勺，滤纸，防潮纸，纱布，棉花，线绳。

方法

1、制备牛肉膏蛋白胨培养基

（1）牛肉膏蛋白胨培养基配方如下：

牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml pH 7.0～7.2

（2）制备方法：按需要称量各药品，用量筒量取1000ml蒸馏水于搪瓷锅中，放入琼脂加

热至其全部熔化后，再加入牛肉膏、蛋白胨及NaCl至全部溶解后，补水定容至1000ml。然后用1mol/L NaOH调pH7.1。趁热分装，3个500ml三角瓶，每瓶装300ml；15×150mm试管，每支试管约装3-5ml（装量不超过试管长度的1/5）。塞好棉塞，用防潮纸包好，试管7支一捆，准备灭菌。

图10-1 棉塞制作过程 正确的棉塞

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2、配制马铃薯培养基

（1）马铃薯培养基配方如下：

去皮马铃薯 200g 蔗糖或葡萄糖 20g 琼脂 20g 自来水 1000ml pH 6.5

（2）配制方法：按需称量各药品，将洗净去皮的马铃薯切成约1cm2 小块置于搪瓷锅中，

加入1000ml自来水煮沸半小时，然后用4层纱布过滤，向滤液中加入琼脂，加热熔化后，再加入蔗糖或葡萄糖，再补足水分至1000ml，然后用1mol/L HCl调pH至6.5。趁热分装、包好同上，准备灭菌。

3、配制高氏1号培养基

（1）高氏1号培养基配方如下：

可溶性淀粉 20g NaCl 0.5g KNO3 1g K2HPO4·3H2O 0.5g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 0.01g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml

pH 7.2～7.4

（2）配制方法：按需称取各药品，先用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少量沸水并加热

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使淀粉充分溶解。向琼脂中加入少量沸水并加热使其完全溶解后，加入溶解淀粉，再逐一加入所需的NaCl，KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，然后用1mol/L NaOH调pH至7.5。趁热分装、包好，准备灭菌。

4、配制牛肉膏蛋白胨液体培养基：配方同1，只是无须添加琼脂凝固剂。制备方法同1。分装于250ml三角瓶中，每瓶分装100ml，包好后准备灭菌。

5、棉塞的制备：棉塞的形状、大小和松紧要合适，才能起到防止杂菌侵入并有利于通气的作用。加塞时应使棉塞总长度的3/5塞入试管口或三角瓶口，以防止棉塞脱落。制塞时应按口径大小取适量普通棉花铺成近方形，中间稍厚，边缘稍薄。沿对角线内折略成三角形。然后用拇指和食指将三角形的一角卷起，边卷边压紧，在卷的过程中要不断将絮状纤维往里卷，使棉塞外形光洁如未开伞的蘑菇。其过程如图10-1所示。

6、配制无菌水：将蒸馏水分装于250 ml三角瓶中，内含20-30粒玻璃珠，每瓶100ml。15×150mm试管中装9 ml蒸馏水，7支一捆，包好后准备灭菌。

（1）灭菌：以上各培养基及无菌水均可在1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃条件下，进

行高压蒸汽灭菌20分钟。

（2）摆放斜面：灭菌后待培养基冷却至50-60℃时（防止斜面上冷凝水过多），将试管口

一端搁在高度适中的木棍上，调整搁置的斜度，使斜面长度不超过试管总长度的1/2。如图10-2和10-3所示。

问题

1．何谓选择培养基，加富培养基及鉴别培养基？各有何用途？ 2．在制备培养基过程中应注意哪些问题？为什么？

3．制好培养基后为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？ 4．摆放培养基斜面时应注意什么？

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10-2 分装培养基

图10-3 斜面的放置

33

图

实验十一 高压蒸汽灭菌和干热灭菌

目的

使学生学习并掌握高压蒸汽灭菌和干热灭菌的原理及方法。

原理

高压蒸汽灭菌是实验室最常用的灭菌方法，适用于培养基，生理盐水，各种缓冲液及玻璃器皿的灭菌。常用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，灭菌锅有立式、卧式和手提式三种。图11-1所示常用手提式灭菌锅。高压蒸汽灭菌的原理是通过提高灭菌锅内的蒸汽温度以达到灭菌目的，即，使灭菌锅夹层的水加热、沸腾，不断产生蒸汽，以排除冷空气，直至空气排净后（约排气10-15分钟）关闭放气阀，使蒸汽锅密闭，这时随蒸汽压不断上升，锅内的温度也随之上升，当蒸汽压（饱和蒸汽压）升到1.05kg/cm时，锅内温度即达121.3℃，在该温度下保持20-30分钟，可将所有微生物及芽孢杀死。灭菌所需时间和温度取决于被灭培养基中营养物的耐热性、容器体积大小和装物量等因素。若灭砂土、石蜡油或含菌量大的物品则应适当延长灭菌时间。

干热灭菌适用于玻璃器皿的灭菌。常用电热烘箱进行，其结构如图11-2所示。干热灭菌主要是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到杀灭微生物的目的。细胞内蛋白质凝固性与其本身含水量相关。当菌体受热时，环境和细胞内含水量越大，蛋白质凝固就越快，反之则慢。通常干热灭菌时预先将各种器皿用纸包好或装入金属制培养皿箱、移液管筒内，再放入电热烘箱，然后打开电源，加热升温至150-160℃，维持2小时即可进行彻底灭菌。

2

仪器与材料

1．仪器：立式高压蒸汽灭菌锅，手提式高压蒸汽灭菌锅，电热烘箱。 2．需灭菌的物品：培养基，无菌水，培养皿，用报纸包好的吸管等。

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方法

1、高压蒸汽灭菌

（1）加水：向灭菌锅夹层加蒸馏水至适当水位刻度；

（2）装料：放入需灭菌的物品；注意：装量适当，使瓶口或试管口向中心摆放，不要紧贴

锅内壁，以防冷凝水沾湿棉塞！ （3）加盖：盖好灭菌锅，对称拧好螺栓；

（4）灭菌：通电加热，待灭菌锅排出大股水蒸汽时记时15分钟后，关闭排气阀。继续加热

至所需条件，如压力达1.05kg/cm即121.3℃，维持20-30分钟；

（5）降压：灭菌后立即关闭电源，待压力降至0时，打开排气阀，放空剩余蒸汽。再打开

锅盖，取出灭菌物品；

（6）后处理：灭菌完毕，放空夹层内的水，保持锅内干净。

2、干热灭菌

（1）装料：打开烘箱门，放入需灭菌的物品，关好烘箱门；（注意：勿使纸包物品紧靠烘

箱壁，以免引起火灾！）；

（2）灭菌：打开排气孔，接通电源，加热升温至160℃，关闭排气孔，维持2小时；（注

意：灭菌温度绝对不可以超过180℃！）

（3）降温：灭菌后，立即关闭电源，将温度旋钮转至0。待温度降至20℃以下时，打开烘

箱门，取出灭菌物品。

3、灭菌前玻璃器皿的包装 （1）吸管、滴管的包装：

① 裁纸：将8开报纸裁成约5cm宽的长纸条；

② 包法：将纸条一端折进约3 cm长使成双层，将吸管或滴管包进双层纸内，并与纸条

形成约30°夹角，然后在桌面上不停地卷动，让纸条成螺旋状包在管外，最后将多

35

2

余的纸条回折即可。见图11-3。

（2）培养皿的包装：将洁净干燥的培养皿装入铁皮箱，每箱60套，盖好箱盖即可。

1：安全阀； ：压力表； 2 3 4 5 6 7 8 图11-1 手提式高压蒸汽灭菌锅

：放气； 4：软管； 5：紧固螺栓； 6：灭菌桶； 7：筛架；36

：水

2 3 8

图11-2 电热恒温箱

a: 外观； b: 内部结构

1：温度计； 2：排气伐； 3：箱体； 4：控温器旋钮； 5：箱门； 6：指示灯； 7：加热开关；8：温度控伐； 9： 控制室； 10：侧门； 11：工作室； 12：保温箱； 13：电热器； 14：散热板； 15：搁板

图11-3 吸管包裹过程

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问题

1．使用高压蒸汽灭菌锅应注意哪些问题？ 2．使用电热烘箱进行干热灭菌应注意哪些问题？

3．为什么干热灭菌比高压蒸汽灭菌所需的时间长、温度高？

4．若烘箱内出现燃烧现象应如何处理？是否可以立即打开烘箱门？试解释原因。

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实验十二 噬菌体效价的测定

目的

1．学习并掌握噬菌体效价的含义及其测定原理。 2．学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。

原理

噬菌体属于细菌病毒，它不具备完整的细胞结构，只能通过寄主细胞完成自我复制。因此人类只有通过电子显微镜才可观察到它们的形态结构。但是，由于噬菌体侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞溶解死亡，并在琼脂培养基表面形成空斑-噬菌斑（Plaque），所以人们可以此来判断噬菌体的存在。

噬菌体的效价即：每毫升培养液中含有具感染性噬菌体的数量。它的测定常用双层琼脂平板法。由此法得到的噬菌斑形态、大小较一致，且清晰度高，计算准确。该方法首先在无菌培养皿内倒入营养琼脂作为底层，然后将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附后，加入冷却至45℃左右的半固体琼脂糖，迅速混匀后铺平板，作为上层, 最后倒置培养。只要噬菌体具有感染力就可形成噬菌斑。根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。

公式为： 噬菌斑形成单位（pfu/ml）= 噬菌斑数×稀释倍数×10 本实验选择的λ噬菌体EA94， 是一被改造的烈性噬菌体。

材料

1．菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）LE392 2．噬菌体：λ噬菌体EA94

3．培养基：300 ml三角瓶中分装100ml LB培养基，300 ml 三角瓶中分装150 ml LB固体培养基，15×150mm试管分装3.5 ml 0.7%琼脂糖。

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4．灭菌物品：20%麦芽糖，1mol/L MgSO4，10 mmol/L MgSO4，18×180mm试管分装9 ml和20 ml噬菌体缓冲液（20 mmol/L Tris pH 7.4，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgSO4），100ml离心管，100μl枪头，微离心管，培养皿。 5．仪器：取样器，恒温水浴锅，恒温培养箱，台式离心机。

方法

1．制底层平板：将融化并冷却至45℃左右的LB培养基倒入无菌培养皿，每皿约10-12 ml，共9皿， 水平放置，凝固后，作好稀释度标记备用；

2．制备噬菌体稀释液：取20μL噬菌体原液于19.98 ml缓冲液中得到1000倍（10）稀释液。再取1 ml 10－3稀释液于9 ml缓冲液中得到10－4稀释液，依次类推直至10－7稀释液，并在试管上作好相应标记备用；

3．制备受体菌细胞：将活化的大肠杆菌接种于50ml牛肉膏蛋白胨培养液（内含0.5ml 20%麦芽糖和0.5ml 1mol/L MgSO4）中，经过夜培养后，离心收集菌体细胞，然后悬浮于20 ml 10mmol/L MgSO4.7H2O中，备用； 4．吸附：用取样器分别取100μl 10、10、10

－5

－6

－7

－3

噬菌体稀释液和100μl受体菌细胞液，

充分混和后置于37℃恒温箱中保温25分钟，并在微离心管上作好相应标记； 5．制上层平板：用取样器分别取出全部混合液加入到冷却至45℃左右的0.7%琼脂糖中，迅速混匀后，倒在有相应标记的底层平板上，边倒边在台面上摇匀，使上层培养基迅速铺满整个平皿；

6．培养：37℃倒置培养15-18小时后，检查结果。

结果

记录平板上出现的噬菌斑数填于下表，并计算噬菌体原液的效价。

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表12-1 噬菌体的效价测定

噬菌体稀释度 噬菌斑数（个）/皿 平均数 1 10－5 2 3 1 10－6 2 3 1 10－7 2 3 问题

1．噬菌斑形成单位和菌落形成单位有何不同？ 2．测定噬菌体效价的准确性应注意哪些操作？

3．噬菌体与受体菌混合后保温时间越长其吸附效率越高的说法对吗？为什么？

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实验十三 微生物对大分子化合物的水解

目的

通过实验证明不同的微生物对复杂的有机大分子物质具有不同的水解能力，从而证明 了的微生物具有不同的酶系统，他们分别在自然界物质转化中发挥着自己的作用。

原理

不同的微生物因具有不同的代谢酶系而表现出不同的代谢类型。即，当它们作用于相同底物时可产生不同的的终产物。这些可用来作为微生物鉴定和分类的理论依据。

很多微生物不能直接利用大分子物质，如淀粉、蛋白质和脂肪。但可通过向细胞外分泌胞外酶，将这些物质水解成小分子物质后，才能吸收利用。水解过程可通过底物的变化来证明。本实验通过微生物对含碳水化合物（如淀粉），含氮化合物（蛋白质）和含磷的有机化合物的水解，证明微生物对于这些大分子有机化合物的水解作用。淀粉的水解是由于微生物分泌淀粉酶作用的结果，可用碘液来检测；微生物产生并分泌的磷酸酯酶，可水解卵磷脂为脂肪和甘油；蛋白质中的含硫氨基酸（如，胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等）被微生物分解产生硫化氢，硫化氢遇到培养基中的铁盐或铅盐，就形成黑色的硫化铁或硫化铅沉淀。

材料

1．菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）

2．培养基：淀粉培养基，LB培养基，产硫化氢穿刺培养基 3．其它：无菌培养皿，接种用具。

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方法

1．淀粉水解试验：

（1）制备平板：将冷却至45℃左右的淀粉培养基倒入无菌培养皿中，每皿约15ml，共3

皿。凝固后在平板背后画线，将其分成两部分，分别标记枯草芽孢杆菌（B）和大肠杆菌（E）；

（2）接种：在平板相应的位置上分别点接枯草芽孢杆菌和大肠杆菌培养：37℃倒置培养

2~3天；

（3）观察结果：打开皿盖，加入卢哥氏碘液，使碘液均匀铺满整个平板，观察是否出现透

明圈。菌落周围的透明圈越大，说明该菌水解淀粉的能力越强。

2．含磷有机化合物（卵磷脂）的水解

（1）制备平板：将鸡蛋用酒精棉球擦净，剥离一小块外壳，流出部分蛋清，用无菌注射器

抽取鸡蛋黄3~5ml，于5~10ml 生理盐水混合，充分混匀，取3~5ml蛋黄液与融化好的100ml细菌培养基（45℃左右，）混合均匀，倒平板， 凝固后备用；

（2）接种：在平板相应的位置上分别点接金黄色葡萄球菌和巨大芽孢杆菌，37℃倒置培养

2~3天；

（3）观察结果：观察平板接种周围是否出现透明圈（卵磷脂被水解为脂肪），比较透明圈

的大小，判断哪种微生物分解有机磷化合物的能力强。

3．硫化氢产生实验

（1）取硫化氢产生试管半固体柱状培养基，穿刺接种（图13-1）普通变形杆菌和枯草芽

孢杆菌，26℃~28℃培养2~3天。观察试管是否变黑（FeS ↓），判断哪种微生物分解含硫氨基酸的能力强。以半胱氨酸的分解为例：

CH2SHCNH2COOH + H2O → CH3COCOOH + H2S ↑ + NH3 ↑

H2S + Fe (CH3COO)2 → FeS ↓ + 2CH3COOH

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结果

将实验结果填入下表，并分析各种微生物的产酶特点。

表13-1 大分子物质的水解试验结果

菌名 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 普通变形杆菌

淀粉水解

卵磷脂水解

硫化氢产生

图13-1 穿刺接种

a. 垂直接种 b. 水平接种

问题

1．本实验是否能证明微生物中存在的这三种酶均为胞外酶，为什么？ 2．你的实验有无污染？试分析如何造成的，怎样避免？

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实验十四 微生物对糖的利用

目的

了解并掌握微生物对糖发酵的原理。

原理

许多微生物都能利用糖作为碳源和能源。但它们在分解糖的能力上存在很大差异，有的能产酸产气；有的只产酸不产气；有的则既不产酸也不产气。这种特性对微生物鉴定非常重要，尤其是肠道细菌。产酸可由指示剂颜色变化来表明，而产气则可由杜兰管来收集。本实验选用酚红指示剂，其有效pH值范围是6.8-8.4，中性时呈粉红色，酸性为黄色，碱性为红色。

材料

1．菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

2．培养基：5ml酚红蔗糖肉汁培养液、5ml酚红葡萄糖肉汁培养液、5ml酚红乳糖肉汁培养液分别装于含杜兰管的15×150mm试管中，每种糖10支，总共30支。 3．其它：试管装10ml无菌水，1ml无菌吸管，接种用具。

方法

1．标记：在各试管上标明糖的种类、菌种名称，每种糖留一支作为对照不接种，注明“CK”； 2．制菌悬液：向3种试验菌斜面内分别加入10ml无菌水，用接种环刮下菌苔，充分混匀，备用；

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3．接种：用1ml无菌吸管取0.5ml菌悬液分别接入3种糖培养液中，每种糖接3支； 4．培养：细菌置37℃、酵母置28℃恒温培养24小时后检查结果。

结果

将实验结果记录于下表。“+ +”表示产酸产气；“+ －”表示产酸不产气；“－ －”表示不产酸不产气。若产酸则需描述培养液颜色的变化。

表14-1 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌对糖的利用 菌名

酚红蔗糖肉汁培养液 酚红葡萄糖肉汁培养液 酚红乳糖肉汁培养液

大肠杆菌

枯草芽孢杆菌

金黄色葡萄球菌

问题

1．在你的实验中，培养液的颜色是如何变化的？说明了什么？

2．若接种培养后，含有指示剂的糖培养液颜色没有发生变化，如何解释此现象？

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实验十五 营养元素对微生物生长的影响

目的

通过本实验使学生了解营养元素对微生物生长发育的影响。

原理

微生物的生长发育需要一定的营养物质和环境条件，只有全面满足以上要求时，微生物才能进行正常的生命活动。影响微生物生长、繁殖的主要营养元素主要包括碳、氮、磷、硫等，个别微生物还需要某些维生素和微量元素。本实验通过将几种常见微生物接种于缺乏不同营养元素的培养基中，观察他们的生长情况，以便确知几种营养元素对微生物生长的作用。

材料

1．菌种：黑曲霉（Aspergillus niger）

枯草芽孢杆菌（Bucillus subtilis）

2．试剂：20% 蔗糖溶液； 1.5% 硝酸铵液；0.5% KH2PO4；混合液（1.2% MgSO4；0.05% NaCl； 0.005% FeSO4 等量混合 ）；蒸馏水；以上试剂灭菌备用； 3．器皿：100 ml无菌空三角瓶；无菌吸管（1ml, 5ml, 10ml）；恒温培养箱。

方法

1．每组取4个无菌三角瓶，分别写好标记，按下表分别加入各种营养成分；

2．按无菌操作要求，接入黑曲霉或枯草芽孢杆菌，摇匀，置28℃温箱培养一周后观察结果。根据菌膜厚薄，孢子生长情况来判断菌丝生长发育的好坏，分析实验结果。

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表15-1 不同营养元素对微生物生长的影响

培养基成分

蔗糖 NH4NO3 KH2PO4 混合液 蒸馏水

完全 6ml 3ml 1ml 1ml 4ml

缺碳 0 3ml 1ml 1ml 10ml

缺氮 6ml 0 1ml 1ml 7ml

缺磷 6ml 3ml 0 1ml 5ml

结果：

将实验结果填入下表，并分析。 生长情况 完全 缺碳 缺氮 缺磷 注：生长情况可以用 “+”表示

问题

1．从本实验的结果可得出什么结论？

2．如何操作才能保证配置培养基的过程不被污染？

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实验十六 温度对微生物生长的影响

目的

了解温度对微生物生长的影响，并学习确定微生物生长最适温度的方法。

原理

微生物的生长需要一定的外界环境条件。条件适宜时，有利于微生物的正常生长和繁殖；而当外界条件不利时，则不利于微生物生长，甚至产生诱变，导致死亡。不同的环境因素对不同微生物的影响不同；同一因素因浓度不同对同一微生物生长的影响亦不相同。

本实验即探讨培养温度对微生物生长的影响。温度是影响微生物生长的重要因素之一。随着温度上升，一方面微生物细胞代谢和生长速率加快；另一方面机体内的重要成分蛋白质、酶蛋白、核酸等则因变性而遭破坏。因此，当微生物处于最适生长温度时，有刺激生长的作用；而不适宜的温度则可导致形态和代谢失调或使微生物蛋白质凝固变性并最终引发死亡。

能使微生物迅速生长繁殖的温度就是其最适生长温度。不同的微生物最适生长温度不同。如低温型微生物最适生长温度在15-20℃范围内，主要分布在地球两极，短时受热或室温条件即可杀伤此种微生物；中温型微生物的最适生长温度在20~40℃之间，主要是土壤微生物和植物病原微生物；高温型微生物最适生长温度在45-60℃范围内，分布局限在温泉、火山口及堆肥堆、发酵饲料等腐烂有机质中。本实验限定了其他试验条件，只改变培养温度，通过测定微生物的生长速度来确定其最适生长温度。

材料

1．菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）

青霉（Penicillium sp.）

2．培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，马铃薯葡萄糖培养基

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/fd1p.html