基因工程涉及的主要技术

基因工程涉及的主要技术

遗传专业 姓名：张红 学号1310170039 导师：张斌

基因工程基因工程(Genetic engineering)原称遗 传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多 种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接 重组，然后转入另一种生物体(受体)内，使之 按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。

基因工程的操作流程

限制酶的切割与连接

分子杂交及DNA测序

1、目的 基因的 获取

2、基 因表达 载体的 构建

3、将目 的基因 导入受 体细胞

4、目的 基因的 检测与 鉴定

①DNA和RNA的提取和纯化 ②PCR扩增 ③构建基因文库，从基因文 库中“钓”取

农杆菌转化法等

基因工程主要技术1 2DNA和RNA的提取和纯化

凝胶电泳

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基因扩增技术-PCR反应

分子杂交

DNA序列测序

一、DNA和RNA的提取和纯化 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。 一般程序 1、供体的核酸分离 供体细胞培养 收集(菌体)细胞 细胞破碎 分离总DNA 分离细胞器 分离总RNA

分离细胞器DNA

RNA poly(A)RNA 特异性RNAcDNA(组建cDNA文库)

染色体DNA(组建基因组文库)

DNA提取的几种方法(1)基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它 (2) 非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法

基因组DNA-CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)

CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十 六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂，可溶解细 胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中(>0.7mol/L NaCl)是可溶的， 通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入 乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在 将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不 要低于15℃。

CTAB法流程图植物材料 裂解液 酒精沉淀

液氮研磨

抽提

离心洗涤

DNA溶液

细胞裂解

上层溶液

干燥溶解

质粒DNA-碱裂解法 碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于1979年发 表，基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异 而达到分离目的。 在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键 断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢 键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会 完全分离。 当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时 ，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中 ，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。 通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而

被除去。

对数期菌体

上清液

沉淀

溶液I充分重悬

抽提

干燥溶解

溶液II裂解

酒精沉淀

质粒DNA溶液

溶液III中和

离心洗涤

碱裂解法流程图

蛋白质的去除：酚/氯仿抽提 使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等) 高盐洗涤 蛋白酶处理

多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的 5M NaCl,高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以与 多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500μL DNA液中加入 200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ,冰浴20min。

多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏 血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇),它 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 盐离子的去除： 70%的乙醇洗涤

总RNA的提取根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法： 1)热苯酚抽提法

2)胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍3)LiCl/尿素法 其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的 组织(胰脏)中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性 ，制备的RNA有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎 与蛋白质变性是同步进行的。

二、凝胶电泳

常见的凝胶电泳电泳主要类型 琼脂糖凝胶电泳 分离根据 电荷量、相对分子 质量和构型 相对分子质量、电 荷 在交流电场中做出 反应的时间 等电点 适用范围 核酸

聚丙烯酰胺凝胶电 泳 脉冲电场凝胶电泳 等电点聚焦电泳

核酸和蛋白质

分离长至5Mb的 DNA分子 蛋白质

琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳的原理： 分离原理-在电场的作用下，DNA分子在琼脂糖凝胶中移动时 ，有电荷效应和分子筛效应。 检测原理-溴化乙锭(EB)在紫外光照射下能发射荧光，当用 EB对DNA样品染色时，加入的EB就插入DNA分子中，荧光强度 与DNA含量成正比。 琼脂糖凝胶电泳分辨大小在 0.1-60kb间的DNA片段；而 要分辨较小分子质量的DNA 片段，要用聚丙烯酰胺凝胶， 它的分辨率在0.001-1kb之 间。

聚丙酰胺凝胶电泳

三、基因扩增技术---PCR反应

1. PCR的发明 (1) 1971年Khorana提出体外人工复制DNA的 设想。当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术 都没有解决，设想未能实现。

(2)1985年Cetus公司的科学家K.B. Mullis发明了PCR,使这一设想变成现实。 Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。

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