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CHIP PROTOCOL（基于millipore EZ-CHIP catalog#17-371）：

实验原理：

在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

实验步骤： 第一天：

【实验材料准备】：

1000ul、100ul、200ul、20ul移液器，大、中、小号tip，1.5ml EP管，200ul PCR管。

【实验仪器准备】：

台式低温离心机，超声仪，电泳设备一套，旋转混匀仪，层析柜。 【实验试剂准备】：

SDS lysis buffer复温，使其充分溶解，避免沉淀；protease inhibitor cocktail室温下充分解冻；PBS预冷（若使用试剂盒提供10xPBS，使用前还需用去离子水稀释成1xPBS工作液）。

（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎*。

1、收集细胞（1-2x10^7），加入37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（0.7%）。 2、室温孵育10min（精确计时）。

3、及时终止交联：加10x甘氨酸终浓度为1x。混匀后，在室温下放置5min。 4、沉淀细胞（700g 4℃ 2-5min），用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、弃上清（细胞沉淀可以暂时冻存于-80℃备用）。

6. 准备裂解液（1ml SDS lysis buffer+5ul protease inhibitor cocktail）；按照细胞量（1x10^7 hela细胞对应1ml SDS lysis buffer）加入SDS Lysis Buffer，重悬细胞。分装成300-400ul1管（裂解产物可以-80℃冻存备用）。

7、超声破碎（根据具体情况调整）：

普通超声仪： 3档 冲击15s 冰上放置45s 共5次

Bioruptor超声神器： 中档 冲击15s 停顿45s ≧14次（更均一更集中）

8、琼脂糖凝胶电泳鉴定：取1x10^5个细胞，加入CHIP dilution buffer至终体积50ul，进行解交联后电泳

Option1—a. 加入RNase A（10mg/ml）1ul，37℃孵育30分钟。

b. 加入蛋白酶K 1ul，62℃孵育2小时。

c. 取上清跑胶（2%琼脂糖凝胶 电压130V 时间20min），smear条带集

中在200-1000bp即可，500左右为佳。

Option2—a. 加入蛋白酶K 1ul，62℃孵育2小时。

b. 每50ul样本加入0.25ml结合试剂A（5倍体积），充分混匀。 c. 将上述混合液转移至吸附柱中，吸附柱放在收集管内。

d. 10000~15000g离心30秒，去下清。

e．向吸附柱内加入洗涤液B 500ul，10000~15000g离心30s，去下清。 f. 空离30s，10000~15000g。

g. 将吸附柱转移至新的EP管，向吸附柱中心滴加50ul洗脱液C，10000~15000g离心30s，洗脱液即为纯化回收的DNA。

h. 取上清跑胶（2%琼脂糖凝胶 电压130V 时间20min），smear条带集中在200-1000bp即可，500左右为佳。

9、离心去除不溶物质（10000~15000g 4℃ 10min），收集上清，分装至100ul 1管，-80℃可保存2个月。

【实验补充及注意事项】：

1、不是所有CHIP都需甲醛固定。做甲醛固定的为X-ChIP，而不需要固定的为N-ChIP。native ChIP主要用于组蛋白修饰、核小体定位的研究,由于组蛋白与DNA之间的作用力较强，因此N-CHIP不需要采用甲醛固定，而是让DNA结合蛋白与DNA之间保持一种自然状态，采用微球菌核酸酶对染色质进行消化，比如： Histone H3 and Histone H4 都不需要交联反应, 因为它们本身来说和DNA结合的非常紧密. 组蛋白H2A和H2B并不是紧密联接,但是在native ChIP中依然可以不需要交联反应.X-CHIP适用于结合力较弱的DNA-蛋白质相互作用的研究。

2、当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。例如细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。甲醛的交联反应是完全可逆的，交联的进程可被加入的甘氨酸终止。

3、交联时间需要预实验来确定。交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失，另外基因组上结合了太多的蛋白，也会增加背景；交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。

4、超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。使用普通超声仪时超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。

5、有研究建议解交联后琼脂糖凝胶电泳鉴定，具体步骤如下：取5ul超声破碎后产物，加入5M NaCl（终浓度为0.2M NaCl），65℃处理2h解交联，电泳检测超声效果。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp－1000bp（以3个核小体左右大小为宜，大约500bp左右）。

普通超声仪效果：

Bioruptor超声效果：

（二）、预清洁及抗体孵育。

10、准备足够Dilution buffer（900ul dilution buffer+4.5ul protease inhibitor cocktail）。 11、每100ul的超声破碎产物中（冰上解冻），加入900ulChIPDilutionBuffer。 再各加入60ulProteinGAgarose/SalmonSpermDNA（预清洁），4℃旋转混匀1h*。 12、1h后，在4℃静置2min沉淀，4℃ 3000-5000g离心1min。 13、取上清，每个样本留取10ul做为input，4℃保存备用*。

14、收集剩余约1ml上清至新EP管，加入IP抗体（具体加入抗体量具体调整）*。 阳性对照：加入1ug anti-RNA polymerase抗体 阴性对照：加入1 ug目的抗体来源种属的IgG

实验组：加入目的抗体（1-10ug，可根据抗体说明书决定用量，一般3ug左右） 15、4℃旋转混匀过夜（12-16h）。 【实验补充及注意事项】

1、吸取琼脂糖珠子的中号tip需减头，避免机械力破坏珠子，且珠子需充分混匀。 2、鲑鱼精子DNA包被琼脂糖珠子，因为鲑鱼精子用于降低降低染色质DNA与琼脂糖珠子的非特异性结合。Proterin A/G可以与抗体Fc段结合。蛋白质A结合到IgG的Fc部分。蛋白质G选择性结合到IgG的Fc部分，但也能结合到Fab区域，因此可用于纯化IgG1的Fab片段。

3、input是用来检查PCR系统是否work。

4、抗原抗体之间的结合是通过抗体特异性的识别抗原表位并结合的，有的抗体识别的抗原表位比较小，不容易暴露，在ChIP实验中容易被DNA包裹，从而使抗体无法结合，因此用来做ChIP的抗体一般是需要经过chip实验验证的，必须是IP级别的抗体。

5、单抗与多抗的选择：单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。

第二天：

【实验材料准备】：

1000ul、200ul、20ul移液器，大、中、小号tip，1.5ml EP管。 【实验仪器准备】：

台式低温离心机，旋转混匀仪，层析柜，水浴锅（调节水浴锅温度到65℃备用）。 【实验试剂准备】：

室温充分溶解1M NaHCO3。 （一）、免疫复合物的沉淀及清洗。

16、孵育过夜后，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4℃旋转孵育1h。

17、4℃静置10min后，4℃ 3000~5000g离心1min。除去上清。

18、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入1ml洗涤液，在4℃旋转孵育3-5min，4℃静置2min沉淀，3000-5000g离心1min，除去上清。

洗涤溶液*：a.low salt wash buffer-1次

b.highsalt wash buffer-1次 c.LiCl wash buffer-1次 d.TE buffer-2次

19、洗脱：洗脱液的配方：10ul20%SDS，20ul1MNaHCO3，170ulddH2O，共200ul。 Input管加入200ul洗脱buffer，室温下备用；

IP管加入100ul洗脱液，轻柔弹匀，室温孵育15min，离心（4℃ 3000-5000g 1min）后，收集上清至新EP管。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管200ul。

20、解交联*：每管中加入8ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。

混匀，65℃解交联，时间4-5h或者过夜。（解交联后样本可冻存在-20℃备用） 【实验补充及注意事项】：

1、头四次洗涤不要求完全弃上清，避免反复及不必要的样本丢失，最后一次要求尽量去除干净上清。

2、虽然说明书上说4小时已经足够，但是建议解交联过夜。因为在那样环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。注意在EP管口封上封口膜（避免样本蒸干）。

第三天：

【实验材料准备】：

1000ul、100ul、200ul、20ul移液器，大、中、小号tip，1.5ml EP管。

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