昆虫病原体的采集、整理和症状识别

实验一、昆虫病原体的采集、整理和症状识别

一、目的要求：

昆虫病原体的采集，整理是研究昆虫病理和利用微生物进行害虫防治的第一步。识别症状是诊断学的主要内容。本实验要求对昆虫疾病有一个较直观的了解，从而为今后工作打下基础。

二、实验内容：

1． 病体材料的收集

因病死亡的昆虫，可发现于植物的枝叶、茎内、花苞。果实中地表土下等，样本多数脆弱。因此，采集时应以单个样本连同基物的一部份或全部置于小瓶中，并加棉塞。

已收集到的病、死虫体，应迅速处理，进行检查，鉴定和分离病原，并没有进行寄主病情的描述，进行编号和记载，也要考虑到病理组织学的研究和回接试验所用。因此，要有一定的标本数量。同时，有必要对采到的材料进行暂时保存。冷藏可进一步阻止样本进一步腐解，可将病虫死体置于冰箱保存。 2． 样本的症状识别：

（1） 细菌病的一般特征：感病昆虫活动力减退，食欲减退，食量大减，口腔、

肛门常有吐泻排泻物，多数因败血症而死亡。死虫躺卧在植物或其他物质表面，或侧挂于枝叶。体色多加深至黑色或红色。内部组织崩溃粘液态，有时发臭。

（2） 真菌病的一般特征：死虫笔直僵硬，体表多覆盖有菌丝或孢子，呈现白色、

黄色、红色、褐色或绿色、黑色等。体脆，受压易碎裂。

（3） 病毒病的一般特征：类似于细菌，但无上吐下泻现象。死虫常倒挂或平卧

于植物上。虫体柔软，表皮一触即破。内部组织液化。

3． 观察下列标本：

（1） 细菌病：菜青虫、小菜蛾、柑桔凤蝶。 （2） 真菌病：虫霉：桃蚜、蝉、蝇。

冬虫夏草

白僵：松毛、象虫、稻纵卷时螟、瓢虫 绿僵：菜青虫

菜氏蛾霉：柑桔粉虱 轮枝：蚜虫 青霉：荔枝

拟青霉：柑桔卷叶蛾

（3） 病毒病：NPV：8305、棉铃虫、松毛虫。舞毒蛾 GV：菜青虫、小菜蛾、东方粉蛾 （4） 线虫：DD—136

实验二、昆虫病原细菌、真菌的分离及病毒的提纯

三、目的要求：

为了获得昆虫病原微生物，为鉴定、分类等到的研究和生产应用，首先就必需对罹病昆虫进行分离筛选，对它们的杀虫能力和其他特性进行比较鉴定。最后选出毒力高、性能优良的品系供防治害虫用。 四、实验材料：

解剖皿 75%酒精 剪刀 0-1%升汞 镊子 无菌水 接种环 磷酸缓冲液（PBS） 培养皿 天平 离心机 滤纸

五、实验内容：

1． 病原细菌的分离：把罹病昆虫放入75%酒精中浸泡0.5分钟然后放在0.1%升汞

中消毒0.5～１分钟，再以灭菌洗３次。表面消毒后放入解剖皿，解剖皿的表面石蜡须以75％酒精洗擦消毒，并掠过火焰。虫体从背面或腹面进行纵向解剖。所有器械事先均须消毒。注意不能使肠壁破裂。血液可体液取出，用无菌水稀释，每培养皿装入2ml左右无菌水，共用３个培养皿，从第１皿中用接种环移入３环至第２皿，

。。

再从第２皿移入３环至第３皿，最后倒入冷却至40-50C的细菌培养基，放入３０C温箱培养。一天后进行菌落观察，并用划线阖进行纯化。纯化后的细菌转入斜面培养并置于冰箱保存。

2． 病原真菌的分离：被真菌侵染的虫体，可以用灭菌的镊子，或接种针，直接从

体表挑取菌丝或孢子而移接于适宜的真菌培养革上培养。应同时进行体表和内部真

。

菌的分离，检验是否为同一菌种。在25C左右培养。由于真菌一般比细菌生长慢，有时为了控制细菌污染，可在培养基中加入少量的抗菌素。

3． 昆虫病毒的提纯：病毒、立克次氏体，原生动物和多数线虫不像真菌和细菌那

样奶在人工培养基上培养。针对昆虫病毒，主要是进行提纯，以供鉴定，分类等研究之用。

（1） 低速差异离心法：将病虫称重后捣碎，以1:40比例，即1克虫体加40ml

磷酸缓冲液（PBS），过滤去渣，滤液以500转/分离心15分钟，除去组织碎片杂质（沉渣），上清液再以4000转/分离心2小时，弃去上清液，取沉淀。如此可反复几次。用滤纸吸干再冰冻干燥。

（2） 丙酮一乳糖共沉法：怪病虫称重后捣碎，以1:40PBS稀释，尼龙纱过滤，

滤液经1500~2000转/分离心2小时，弃上清液，按1:10加5%乳糖溶液，充分搅拌后，缓缓加入4倍量丙酮，边加边搅拌30分钟，静置10分钟，3500转/分离心20分钟。将沉淀物缓缓加入适量丙酮，边加边搅拌30分钟，再离心，如此重复3次即可得到灰白色粉状病毒，经冷却干燥，称重，于冰箱中保存。

此外，还有蔗糖梯度分离法和分子筛胶层析法。

实验三、昆虫病原微生物——细菌染色技术及形态观察

一、目的要求：

昆虫病原微生物的鉴定是昆虫病理学研究的重要范畴，是微生物防治害虫中不可疏忽的步骤。对昆虫传染病的认识和致病原因的确定均取决于对病原微生物的正确鉴定，而且直接关系到病原体的生产、剂型和使用。

本实验要求通过显微镜检查和细菌学上的几个鉴别染色法来学习掌握鉴定细菌的

常规方法，达到提高识别细菌形态的能力，和掌握鉴定细菌的技能。 二、实验仪器：

玻片、酒精灯、接种环、香柏油、擦镜纸、二甲苯、显微镜、火柴、洗液瓶、镊子

供鉴定菌株：8010、7216、HD-1、140、009、021、E-3、016、023、087、010、096、012、013、B-Hm18、8311。 三、实验内容：

1． 格兰氏染色：

溶液A：溶解4克结晶紫（包含90%）于40ml的95%乙醇中。 溶液B：溶解1.6 克草酸铵于160ml蒸馏水中。 混合A、B液，用前混合液要放置48小时。

路哥氏液：先溶解2克碘化钾于5ml的蒸馏水内。后加碘1克使溶解，再加295ml蒸馏水。

复染剂：加2.5%的藏红乙醇（95%）溶液20ml于200ml的蒸馏水中。

步骤：涂片火焰干燥，后用草酸铵结晶紫染1分钟，水冲洗5秒，然后用路哥氏碘液冲洗1分钟，水洗5秒，湿片用正丙醇换浸3次，每次1分钟，水冲洗5秒。也可用95%乙醇处理0.5分钟1次，以代替正丙醇。藏红复染液冲洗1分钟，最后水冲洗1分钟，凉干镜检。

结果格兰氏阳性菌染成紫色，格兰氏阴性菌染成红色。注意很多细菌对格兰氏反应常有京华，特别是较老的菌种。最好是用培养8~16小时的菌种，一般不超过24小时。此实验的染料配方很多，但成功与否，主要决定于经验。应同时在同一玻片上设有阴阳对照。

经典的染色法是丹麦，医生草革兰氏所发明，他在1884年报告了这个方法是作为在组织切片中使细菌着色的步骤。该法已沿用了100年。最近，美国加州大学和贵州农学院植保系都分别找到了一种极为简便，结果准确可靠的方法。该法是在干净的载玻片上滴上一滴3%的NaOH或KOH,用火柴杆或牙签挑取PDA平板上培养24~48小时的待测干菌干滴液里，迅速用火柴棍将菌与滴液调匀，边调边将火柴棍用上抬起。凡G-在液滴中均变笛，并在火柴棍离开玻片时形成粘稠丝。而G-无论用多大菌量与1滴NaOH溶液混合均不增加粘性，更不会形成粘稠丝。该方法对老菌株和新菌株均有效，但使用老菌株时量要用得多一点。值得注意的是NaOH+相当于G++，NaOH-相当于G+。

2、 芽孢染色：

此法适用于区分细菌的芽孢和营养细胞。涂片自然干燥，火焰固定后，以5%孔雀绿水液浸染并蒸热10分钟，蒸时可将玻片置于酒精灯火焰上徐徐加热至染色剂溶液开始冒气但不煮沸腾，加热时可随时加注数滴染色剂于载玻片上，以免染剂蒸干，后来水冲洗30秒，用番红复染15秒水冲洗30秒。凉干镜检，结果芽孢染成绿色，营养细胞为红色。

3、 晶体染色：涂片火焰干燥，用苯酚品红染1分钟，水洗，凉干镜检，结果晶体染成

紫色，芽孢为透明椭圆形，仅见具有轮廓的折光体。 观察苏云金杆菌不同变种的晶体形状大小。

4、 鞭毛染色：

染液配方很多，有赖夫生染色法、银盐染色法，西萨——基尔染色法等。一般以西萨——基尔（Cesares-Gill）染法效果最佳。

媒染剂：单宁10克 Alcl3 6H2o 1.8克 Zncl210克 碱性品红花 1.5克 酒精（40%）40ml

研钵中盛酒精10ml,加上以上各种成分。充分研磨混合后，再加入多余的酒精，使用前用蒸馏水稀释2倍。染色时过滤，滤液直接滴在涂片上。

染液：碱性品红花 0.3克 苯酚 5克

酒精（95%） 10ml 蒸馏水 95ml 溶液Ⅰ和溶液Ⅱ分别配制后混合。

步骤：斜面培养10~12小时的苏云金杆菌试管中加入无菌水，半个小时后，用接种环在洁净玻片上点上9环，自然凉干，用媒染剂染5~7分钟，轻轻用水冲洗。苯酚品红染色5分钟后水洗，凉干待检。

注意：鞭毛染色时涂片不能用火焰固定，否则受热后鞭毛蛋白变性，鞭毛收缩，无法看到。

实验四、昆虫病原真菌的染色及形态观察

一、目的要求：

昆虫病原微生物——真菌病害的鉴定主要是根据症状和病原真菌的形态，因此要确定其是否是致病真菌，其鉴定应以病原真菌的形态为依据。鉴定真菌的方法主要是显微镜检查。

本实验学习鉴定真菌的常规方法，提高识别昆虫病原真菌的能力。要求观察菌丝体和其他营养繁殖体的形态和结构，孢子形态和着生方式，子实体的形态结构和产生的部位。 二、实验器材：

解剖针、棉兰、玻片、盖玻片、乳酚油、显微镜、刀片。 三、方法和步骤：

标本或培养基上的菌丝体或子实体，一般是直接用针挑取少许，放在加有一滴浮载剂的载玻片上，加盖玻片在显微镜下检视。对一些真菌如坚实的子实体则需采用徒手切片检视。

浮载剂：水、乳酚油。

染料：乳酚油中可加适当的染料染色，最常用的染料是苯铵兰（棉兰）用量是0.05~0.1%. 四、镜检标本：

1． 虫霉

01、02、03、04、05、8101、8111、8112、叶蝉虫霉、稻飞 （豆芽）（飞虱）（飞虱） 虱虫霉（福州），飞虱虫霉（沙县）、蝗霉、（飞虱）蝇霉。

观察虫霉菌的分生孢子，次生分生孢子，接合孢子，菌丝段。 2． 冬虫夏草

观察子座、子囊壳、子囊、子囊孢子。 3． 白僵菌

观察菌丝，分生孢子形态。 4． 绿僵菌

观察菌丝，分生孢子形态。 5． 多毛菌

观察菌丝，分生孢子梗在菌丝上的生长特点，分生孢子形态。 6． 菜氏蛾霉

观察菌丝，分生孢子梗、分生孢形态。 7． 赤座霉

观察子座颜色，分生孢子器。分生孢子梗。分生孢子形态。 8． 红霉菌

观察分生孢子形态、分生孢子梗束颜色。 9． 轮枝菌

观察分生孢子梗、分生孢子形态。 10. 拟青霉

观察分生孢子梗、分生孢子形态。

实验五、昆虫病毒包涵体的观察及其他染色法

一、目的要求：

昆虫的病原病毒不能采用一般而论的分离培养培养方法，也不能在光学显微镜下观察其病毒粒子的形态，但可以通过染色法后用显微镜观察其病毒的包涵体形态加以识别。

多数昆虫病毒具有包涵体。这就给我们研究、鉴定、利用超显微形态的病毒提供了极大的方便。本实验就是通过染色法识别几种病毒包涵体的形态，学习掌握初步鉴定病毒。 二、实验材料：

1． 滤纸 2． 显微镜 3． 量筒 4． 研钵 5． 水浴锅 6． 酒精灯 7． 显微镜 8． 镊子

9． 载玻片、盖玻片 10．滴管 三、实验内容：

1． NPV染色：

乙醇、福尔马林固定液：70%乙醇90ml加入40%福尔马林10ml。 5%伊红染液：伊红5克、蒸馏水100ml。（或用50%乙醇配制的1%孔雀染液也可）。 步骤：涂片自然干燥，用上述固定液固定液固定10~20分钟、滤纸吸干固定液，再加1%NaOH溶液1分钟，水洗去碱液，以5%伊红染色5~20分钟，水洗，滤纸吸干，油镜观察。多角体染成粉红色。若用1%孔雀绿代替5%伊红，则多角体染为鲜绿色。

注意：1%NaOH应临用前配制，不要放置太久。 2． CPV染色：

（1） 染液：吉姆萨1克，中性甘油30ml，甲醇100ml。先将染色粉研碎，加少

量甲醇充分研磨使溶解，再加入中性甘油30ml，最后加入全部甲醇，混合后置于60度水浴中1小时，冷却后过滤，即为原液。染色时取一份原液加四份甲醇混匀使用。

步骤：涂片火焰干燥，用上述染液1分钟，然后加等量蒸馏水冲洗均匀，继续染色30分钟。水洗、吸干、油镜检查，质形多角体被染为紫色。

用Giemsa染NPV时不着色，因此常用它来进行CPV、NPV的区别染色。

（2） 染液：萘酚兰黑0.1克蒸馏水20ml，100%甲醇50ml、冰醋酸30ml。 3． GV染色：

（1） 染液：氨基黑0.1克，溶于50ml蒸馏水中，再加入98%甲醇40ml，冰醋

酸10ml。

方法：涂片自然干燥，加1滴1%苦味酸（1克苦味酸溶于100ml蒸馏水

中），再加氨基黑染色液1滴，轻轻混合，并微加热，待有水蒸气冒出时，停止加热，待凉后洗去染色液，吸干涂片，油镜检查，颗粒体呈兰黑色。 （2） 染液：

Ⅰ 0.1g偶胭脂红G、溶于100ml蒸镏水中，煮沸5min，冷却后加入 2ml冰醋酸，用前过滤。

Ⅱ 磷酸0.1g，快绿0.2g，苯胺兰0.1g，蒸镏水100ml，G字橘黄0.5g 4、苏丹Ⅲ染色：用于区别多角体与脂肪球

染色剂为苏丹Ⅲ的饱和水溶液，涂片经染色10-15min，自来水冲洗5-10sec，干之，而脂肪球染成红色，多角体未着色。 5、Zielh石炭酸复红染色

A 液：碱性复红 1g 95%乙醇10ml B 液：石炭酸5g 蒸镏水95ml

方法：混合二液，涂片用甲醛乙醇固定10min，后用50%乙酸水溶液处理10min，流水冲洗，染色5 min，结果细菌、真菌等为整体着色，而多角体颗粒体边角着色深红色，中间不着色，轮廓清晰。 6、病毒包含体的碱解：

制作研究材料的湿片，在盖片边缘加1滴NaOH，使碱液流向较干处，在400倍显微镜下观察。当碱液流过时，大多数病毒包含体将肿大而溶解，颗粒体病毒的荚膜的肿胀不易看清，而多角体病毒包含体看得十分清楚。

实验六、苏云金杆菌的部分生化试验鉴定

一、目的要求：

应用生物化学技术对昆虫病原细菌进行鉴定，乃是一种十分简便快速的方法，鉴定苏云金杆菌的生化指标是：V、P反应，卵磷脂酶，蛋白水解，吐温酶，水杨素，七叶灵、蔗糖、甘露糖、表膜、酶、淀粉、几丁质酶、精氨酸脱羟酶等。本实验是通过简单的生化测定来了解苏云金杆菌的生化鉴定技术。 二、实验材料：

1、 天平 2、电炉 3、药勺4、量筒5、烧杯6、pH试纸7、高压锅（手提式）8、接种环 三、实验内容：

1、各种糖、 糖 利用：

蛋白胨 1% 琼脂 2%

蔗糖（甘露糖） 1%（水杨素为0.5%） 1%酸性复红水溶液 0.5%

蛋白胨加热溶于水中，加入酸性复红水溶液。分别加入一种糖加热溶解，以不加糖的蛋白胨作对照。分装试管，调pH至7.58磅灭菌30分钟。

接种后于30℃恒温培养检查产酸情况，若培养基变红者为正反应。 2、 七叶灵利用：

牛肉膏 1% 七叶灵 0.5% 琼脂 2%

另配5%三氯化铁水溶液单独灭菌。培养基溶后，先将三氯化铁每皿滴入2滴，后倒平板混匀。凝固后电接菌种，30 ℃培养3-5天。菌苔周围出现深褐色区为阳性反应。 3、 淀粉水解试验：

牛肉膏 5克 NaCl 5克 可熔性淀粉 5克 琼脂 10克 蒸馏水 1000毫升

将试验菌点种于平板上，徒长出菌落后，收Lugoc氏碘液倾注于平板表面，菌落四周有透明圈者为阳性放应。 4、V、P反应：

蛋白胨5克 葡萄糖5克 NaCl 5克 蒸馏水 1000毫升

分装试管 8磅30分钟灭菌

接菌后于37 ℃培养24小时，每管加入4%KOH溶液10-20滴，再加等量的5%的一萘酚乙醇水溶液后，用力振荡。然后置37 ℃下保温0.5小时。培养物出现红色即为V、P正反应，并设未接种的试管为对照。 4、 卵磷脂酶试验

蛋白胨1% 酵母膏 0.3% NaCl 0.5% 琼脂 2% 卵黄2-3% pH 7-7.2

用75%酒精将新鲜鸡蛋进行表面消毒，并用经火焰灭菌的镊子将蛋两端各打一个孔，

。

倾去蛋清，然后用无菌5ml吸管取出卵黄，加至触化后冷却至50C左右的培养基中，使卵黄含量为培养基总体积的2~3%。混匀后倒平板，点接菌种24小时后观察，菌液边缘出现混浊圈者表示卵鳞酯酶为阳性。

6．菌膜形成试验：

。

肉汤试管接种，30C静止培养24小时后观察菌膜形成情况及摇动后膜破粹情况。

实验七 苏云金杆菌的血清学鉴定

一、目的：

1、 学习抗原及抗体的制备方法

2、 学习试管凝集反应的方法及效价的测定

3、 学会分析不同抗原（o抗原、H抗原）的方法 二、实验原理

将生物细胞或它们的磨碎物。提取物等注射到热血动物体内，动物血液中可以产生与注射物起作用的物质——抗体。能诱发抗体产生的注射物称为抗原。含有抗体的血清称为免疫血清或抗血清。抗原和抗体之间会发生各种血清学反应，如凝集反应，沉淀反应等，它既专化又敏感，可用于鉴定和研究细菌等生物的亲缘关系。 三、实验器材及药品

1 U形管，试管 2 半固体培养基、肉汤培养基 3 接种环 4 高压锅 5 摇床 6 显微镜 7 离心机 8 0.25%甲醛生理盐水等 四、实验内容

1、 制备H-抗原

（1）制备半固体培养基：成份：牛肉膏1%，蛋白胨1%，琼脂0.4%，把半固体培养基装入装有U形玻璃管的试管中，15磅灭菌30min。

（2） 活化菌种：将菌种接在盛有半固体培养基的U形管一端，一天后发现菌

株运动到另一端后迅速取出，转接于第二支U形管中，如此3-5次。

（3） 摇床培养：从最后一次活化管中取运动性最强的菌株接入500nl成有肉汤

培养基的摇瓶内，每瓶含100ml培养基，其成份为：牛肉膏1%，蛋白胨1%，水100ml。每瓶接上一接种环，稍弄散，避免集中，放入30度摇床振荡培养9-10小时。

（4） 无菌检查及离心：取出培养液，涂片，用苯酚品红染色，显微镜油镜检查，

若无其他杂菌时，装入离心管3000转/分离心15-20分钟。倒去生理盐水，收集沉淀悬浮于0.25%甲醛生理盐水中。每塑料管用10ml甲醛生理盐水洗下装入试管，置冰箱待用。

（5） 制备抗体：实验室中制备抗血清都用家免，大量生产则用马等。 i. 动物的准备：免疫注射采用体重2-3公斤的健康雄免。把免子固定在特

制的木盆内，只留头部在外，将双耳边缘附近的毛用刀片剃去，用75%酒精消毒，再用少量二甲苯试去耳翼使静脉充血，取血少量，测定注射前的正常血清能否与测定的细菌发生凝集反应。如不进行了凝集反应，则可用来作免疫注射。 ii. 免疫注射：抗原尝试采用麦氏比色管第7管，采用5号针头注射。注射

方案如下：第1天0.5ml，第3天1ml，第5天1.5ml，第2天ml，第9天2.5ml。再过6天后进行试血，当效价达2000左右时，即可大量采血。若效价太低，可继续补充注射。

iii. 兔子放血：先把兔子固定在小动物解剖台上，剪去颈部毛和颈部皮肤，

直至现出食管为止。仔细在食管两侧稍靠下部找也左右两根颈动脉，用线绑住附近头端，再用止血钳钳住，在细线与止血钳间用剪刀剪断，再在两钳音剪断，动脉血就喷出，可用三角瓶接收。若要采用心脏取血法，则用9号注射针头对准家免以及跳动最激烈之筋骨刺入，进行抽血。

iv. 抗血清处理：室温下使血液凝固，分出血清，并进行了离心后再加1/10000

硫柳汞置冰箱保存。最好把血清盛放在安培瓶中封口，贴上标签，置冰箱保存。

3． 效价测定：用一种抗原与一种抗血清反应

（1） 取14根小试管在试管架上成一排

（2） 用移液管加入生理盐水，第一管0.9ml，其余0.5ml。 （3） 用移液管吸0.1ml抗血清于第一管，使之成1ml，再用另一支移液管从第一

管吸0.5ml至第二管，一直类推至第13管。再从第13管吸也0.5ml去掉，第14管作为对照。

实验八 昆虫病原体的致病力测定

一、实验要求

引入或分离到的昆虫病原微生物，各菌（毒）株对目标害虫的致病力不同。应用效果也不同。如，苏云金杆菌对昆虫毒力，不仅与它产生的毒素有关，同时与细菌的致病机制以及寄主昆虫的特异性有密切关系。测定不同变种或同一变种不同菌株对昆虫毒力的表现，对于高毒力或其他特异性菌株的选育，以及工业生产中生产菌株的选育等均有重要的实践意义。

本实验要求测定比较8010，HD-1，7216，140等变种对菜青虫的毒力以及几种来源不同的颗粒体病毒对白粉蝶毒力，以便筛选也毒力较强的苏云金杆菌菌株和颗粒体病毒株。 二、实验材料

喷雾器，天平，供试各菌株及毒株，养虫笼，标签，菜粉蝶，大培养皿，浆糊，菜叶，镊子，血球计数器，量筒，研，打孔器，接种环等。 三、实验内容

1、 苏云金杆菌的毒力测定：

（1） 菌液浓度的配制：取培养好的菌株加蒸镏水10cc后，用接种环将苔乔下振

荡制成悬浮液，用血球计数板计算孢子含量，后分别用水稀释成4种浓度：2亿/毫升，亿/毫升，0.5亿/毫升，0.1亿/毫升。

（2） 处理：用打孔器将新鲜菜叶打成大小一样的圆叶片，按胃毒方法采用叶片

浸菌液法进行。顺序是先对照（清水），再由低浓度到高浓度处理叶片，每种浓度为一处理，每处理重复3次，每处理试虫30头，分别置于养虫小尼龙罩中，测定。24小时后饲养足够处理后的新鲜叶片。

（3） 观察记载：于处理后12，24，48，60，72小时分别观察记载幼虫对不同菌

的反应及死亡情况和气象资料。计算各处理的死亡率及更正死亡率。其公式如下：

死亡率（%）=死亡虫数/每一浓度处理试虫总数*100

更正死亡率（%）=（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）*100 2、 菜粉蝶颗粒体病毒的毒力测定

（1） 颗粒体病毒浓度的配制：取感染颗粒体病毒虫尸一只，加蒸镏水10ml.置于

研钵中磨成糊状，后按加水稀释成1:2斤、1:3斤、1:4斤水量制成悬浮液。

（2） 处理：将新鲜菜叶剪成长条，分别浸于上述不同浓度的悬液中，取出凉干，

后置于养虫笼中。本实验也设清水对照，顺序是先对照（清水），再由低浓度至高浓度处理叶片，每浓度为一处理，每处理重复3次，每处理30头，分别置于养虫笼中。48小时后换新鲜菜叶。

（3） 记载：于处理后12、24、48、60、72直至5天分别观察幼虫的反应及死亡

情况，计算各处理死亡率及更正死亡率，也记载处理期间的气象(温、湿)等情况。

自已设计一张观察记载表。

实验九 不同生物农药对小菜蛾的毒力测定

一、实验目的

根据我省小菜蛾的发生为害特点及建设无公害蔬菜基地的生产要求,以我省市面上常见的几种生物农药,对小菜蛾进行了室内毒力测定,旨在从中筛选杀虫速度快、防效高的微生物农药,以供生产实践所急需，为我省的无公害蔬菜基地的建设提供指导。 二、材料与方法 1 供试虫源

从福州新店、闽侯上街蔬菜产区采集田间小菜蛾, 经室内隔代饲养，取其中健康3龄初小菜蛾幼虫。 2 供试药品

① 农林丰（苏云金杆菌高含量16000IU/mg）可湿性粉剂；

② 蔬菜清（维*苏 100亿活芽孢/g Bt*0.1％阿维菌素）可湿性粉剂； ③ 51%杀苏可湿性粉剂（杀虫单和苏云金杆菌混合物）； ④ 2.5%菜喜悬浮剂（通用名：多杀霉素Spinosad），

⑤ 强敌－311可湿性粉剂（维*苏 100亿活芽孢/g Bt*500μg/g阿维菌素）； ⑥ 0.5%坤得(阿维菌素)乳油； ⑦ 坤得(阿维菌素)乳油； ⑧ 苏泰（8000 IU/ml Bt悬浮剂）； ⑨ 天泰(天霸—BtA)可湿性粉剂。

以上①~③样品为福建浦城绿安生化农药有限公司产品；④美国陶氏益农公司；⑤上海威敌生化（南昌）有限公司；⑥~⑨样品均由福建泰禾生化科技股份有限公司提供。 3 小菜蛾天然饲料(菜苗)的培植

甘蓝型油菜籽由省种子批发市场购得，蛭石d=2～3mm，购于武汉玻璃钢制品厂。将油菜籽常温下在水中浸泡6～10h，在42cm×32cm×35cm的搪瓷盘中铺3cm（约盘高2/3）的蛭石，浇水400～500ml（以浇透后倾斜30°盆的边沿有积水为限，如积水较多需倒出），将用多菌灵处理过的油菜籽10～15g（视种子发芽情况而定）均匀撒于蛭石表层，然后再盖一薄层蛭石，在26±1℃空调室培养。在气温适宜，天气晴朗时，可利用太阳光，每天室外日照5～7h（或在室内光照强度为5000～6000Lx的日光灯下光照14~16h），5～6d子叶完全展开后用于饲养。

4 小菜蛾的室内人工饲养

参照中华人民共和国农业行业标准(苏云金芽孢杆菌制剂NY/T293—95)进行。幼虫的接

入方法：将收集卵的成虫饲养笼置于油菜幼苗上，在相对湿度为65～75％，温度为26±1℃的养虫室内饲养，光照强度1000～4000Lx，光照时间为每天14～16h。初孵幼虫从笼底小孔爬出，吐丝下坠，落到油菜子叶上，取食叶片。

幼虫接入量的控制：为了保证虫龄和虫体大小基本一致，接入幼虫应该适量。在卵孵化高峰期，同一产卵笼应在早上8：00和晚上8：00分别转入在新鲜幼苗上，使每盘幼虫的开始取食时间相差12h，这样可将感染时间控制在上午8：00和下午4：00：在这种条件下，幼虫生长72～84h，以2龄幼虫为主，幼虫生长120～132h（即5～6.5d）后即可使幼苗上的幼虫以3龄为主。

应严格要求饲养生理状态一致的健壮幼虫作为质量检测的供试虫。

蛹的收集：用小镊子从叶片或茎上取下成熟的蛹茧放入成虫饲养笼使其羽化。每笼放入约250～300粒健康的蛹茧。成虫饲养笼由24cm×15cm×11cm铝金属骨架组成，四周围有透明塑料薄膜，由四只撑脚支起，每盘2笼。使用前，将笼底塑料薄膜刺满直径1.5mm左右的小孔（可用酒精灯烧过发红的昆虫针烫刺）。

成虫的饲养和产卵：将饱含10％葡萄糖溶液（或蜂蜜溶液）的脱脂棉球放入成虫饲养笼中，供成虫取食，每天更换一次。蛹羽化后，成虫当天即交配产卵。第4～5d开始孵化，第6～8d为卵孵化高峰期。 5 毒力测定

采用张宗炳的叶片浸渍饲喂法。于26～30℃室温下，将同批次孵化出约3龄初的幼虫经过饥饿24h后抖入直径20cm的标本缸中，静置3~5min后选取爬上缸缘的健康幼虫作供试虫。

将新鲜的未喷药的包菜叶洗净，晾干备用。准确吸取（或称取）一定量的药品，加入清水定容稀释到指定倍数（为产品外包装的上标注的推荐倍数）。前面准备好的包菜叶在药液浸泡5min。取出自然晾干后，置于培养皿中，用毛笔轻轻地接入经过饥饿24h的3龄初期的健康小菜蛾幼虫。将它们放于25℃、光照300Lx的恒温培养箱内。经24、48h后，分别检查各处理幼虫死亡情况（用毛笔轻触虫体，无任何反应者为死亡）。统计其死亡率和测定药效。 6 统计方法

当对照无死亡时，死亡率=死亡虫数/供试虫数×100%；当对照死亡率在10%以下时，校正死亡率=（处理死亡－对照死亡率）/（1－对照死亡率）×100%；当对照死亡率超过10%，则此次生测结果无效。利用生物统计F检验，并采用LSD最小显著性差异法及Duncan多重比较。

实验十 苏云金芽孢杆菌摇瓶培养基最优化研究

一、实验目的：

通过不同的试验设计方法，对具较高杀虫毒力的苏云金芽孢杆菌WB7菌株进行摇瓶培养基最优化的研究 二、材料与方法 1 实验室培养基筛选 1.1 供试菌株

苏云金杆菌WB7菌株 1.2 培养基

初筛培养基配方组分如下：

BP（%）：蛋白胨0.5，牛肉膏0.3，NaCl 0.5，pH 7.2。

TP（%）：胰蛋白胨2.0，葡萄糖0.2，Na2HPO4 0.25，NaCl 0.5，pH 7.0。

PM（%）：蛋白胨1.0，葡萄糖0.5，酵母膏0.2，KH2PO4 0.1，FeSO427H2O 0.002，ZnSO427H2O 0.002， MnSO427H2O 0.002，MgSO427H2O 0.03，pH 7.0。

T-3（%）：胰蛋白胨0.2，葡萄糖0.3，酵母膏0.15，MnSO427H2O 0.002，MgSO427H2O 0.002，Na2HPO4 0.14，NaH2PO42H2O 0.12，pH 6.8。

LB培养基（%）：牛肉膏1.0，胰蛋白胨1.0，NaCl 0.2，pH 7.2。

平板计数培养基（%）：牛肉膏1.0，蛋白胨1.0，NaCl 0.2，琼脂2.0，pH7.2。 1.3 摇瓶培养与计数

将活化菌种接种到新鲜的LB培养基中过夜，再按1%接种量转接于各供试培养基，摇床振荡培养至30%芽孢脱落。培养条件：250ml三角瓶每瓶装量25ml培养基，灭菌前pH7.2，30℃下180 r/min。

培养后菌液在无菌条件下10倍稀释至10-7、10-8、10-9，并将此3个稀释度在无菌条件下，吸取1ml于无菌平板中，每稀释度重复3个平板。将灭菌后冷至不烫手的平板计数培养基倒入平板中（8-10ml），迅速旋转平板，混匀后使培养基铺满整个平板，凝固后倒置平板于30℃培养18小时后取出。统计菌落数，选择稀释梯度中重复性最强者为试验结果。 1.4 溶解性葡萄糖培养基筛选

用BP、TP、PM、T-3四种初筛培养基进行摇瓶培养，稀释平板计数后，筛选出对WB7

生长较有利的培养基组合，并以此为基础培养基，采用L27 ( 313 )正交表来安排试验。正交试验的因子与水平见表1。 1.5 碳、氮、磷的影响

将葡萄糖作为碳源，蛋白胨、酵母膏作为氮源，KH2PO4为磷源，应用三因子二次正交旋转组合设计安排试验。各因子的水平编码见表2，组合处理共20个，其中mc=8，mr=6，m0=6。

表1 L27 ( 313 ) 正交试验因素水平表（%）

水平 1 2 3

葡萄糖 0.5 1.0 1.5

蛋白胨 1.0 2.5 1.5

酵母膏 0.4 0.2 0.6

0.1 0 0.2 KH2PO4

FeSO427H2O 0.002 0 0.005

ZnSO427H2O 0.002 0.005 0

MnSO427H2O 0.002 0 0.005

MgSO427H2O

0.03 0 0.06

表2 自变量水平编码

Table 2 Coding of independent variable level

编码值 -1.682 -1 0 1 1.682 △xj

2 工业培养基筛选 2.1 原料

玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉、蛋白胨、鱼粉、CaCO3、KH2PO4、MgSO427H2O（其中黄豆饼粉过100目筛，酵母粉、蛋白胨、鱼粉均过80目筛）。 2.2 采用均匀设计

参照前人经验，取优化所用培养基的各组分的浓度大致范围为：A（玉米淀粉）1.5-6%；B（黄豆饼粉）1-5%；C（蛋白胨）0-0.4%；D（酵母粉）0-2.5%；E（鱼粉）0-2.5%。

将A、B、C、D、E等分后加以调整，形成因素水平表（表3）。为了避免高档水平相遇，调整B、D的水平顺序，将原来的10水平重新定义为1水平，逆时针旋转得到新定的水平序号，根据新的水平，选用均匀设计表U10（108）及其使用表（表4）来安排试验。

表3 均匀试验因素水平表（%）

Table 3 Uniform experimental factor levels（%）

因素 A玉米淀粉 B黄豆饼粉 C蛋白胨 D酵母粉 E鱼粉

1 1.5 1 0 0 0

2 2 1.5 0.05 0.3 0.3

3 2.5 2 0.1 0.6 0.6

4 3 2.5 0.15 0.9 0.9

5 3.5 3 0.2 1.2 1.2

6 4 3.5 0.25 1.5 1.5

7 4.5 4 0.3 1.8 1.8

8 5 4.5 0.35 2.1 2.1

9 5.5 5 0.4 2.4 2.4

10 6 5.5 0.45 2.7 2.7

碳源x1（%） 葡萄糖 0.159 0.5 1 1.5 1.841 0.5

氮源x2（%） 蛋白胨+酵母膏

0.254 0.8 1.6 2.4 2.946 0.8

磷源x3（%） KH2PO4 0.032 0.1 0.2 0.3 0.368 0.1

表4 均匀设计表U10（108）及其使用表

（a）U10（108）

试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2 2 4 6 8 10 1 3 5 7 9

3 3 6 9 1 4 7 10 2 5 8

4 4 8 1 5 9 2 6 10 3 7

5 5 10 4 9 3 8 2 7 1 6

6 7 3 10 6 2 9 5 1 8 4

7 9 7 5 3 1 10 8 6 4 2

8 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

（b）U10（108）使用表

因素数 2 3 4 5 6

2.3 采用正交设计

参考均匀设计的结果，采用L27 ( 313 )正交表来安排试验。因子与水平的确定见表5。

表5 L27 ( 313 ) 正交试验因素水平表（%）

水平 1 2 3

玉米淀粉 1.5 2.5 3.5

黄豆饼粉 4.5 1.5 3.0

蛋白胨 0.2 0.4 0

酵母粉 0 1 2

鱼粉 2 0 1

KH2PO4 0.2 0.8 0

MgSO427H2O

0 0.02 0.08

CaCO3 0.1 0.5 0

列号

1 6 1 5 6 1 3 4 5 1 3 4 5 7 1 2 3 5 6 8

均匀度指数 0.1125 0.1681 0.2236 0.2414 0.2994

2.4 摇瓶试验

按照试验设计方案，分别配制不同培养基，250ml三角瓶每瓶装量25ml，灭菌前pH7.5。将活化菌种接种到新鲜的LB培养基中过夜，再按1%接种量转接到不同的培养基中，30℃下180 r/min摇床振荡培养，定时取样涂片染色观察菌体长势及芽孢晶体形成情况，30%芽孢脱落后终止培养。 2.5 计数

将发酵液在无菌条件下10倍稀释至10-7、10-8、10-9，并将此3个稀释度在无菌条件下，吸取1ml于无菌平板中，每稀释度重复3个平板。将灭菌后冷至不烫手的平板计数培养基倒入平板中（8-10ml），迅速旋转平板，混匀后使培养基铺满整个平板，凝固后倒置平板于30℃培养18小时后取出。统计菌落数，选择稀释梯度中重复性最强者为试验结果。

实验十一 土壤分离Bt菌株

1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1培养基

液体LB培养基：蛋白胨10 g / L，酵母粉5 g / L，NaCl 10 g / L，pH 7.0-7.2； 固体LB培养基：在液体LB培养基中加入琼脂20 g / L ；

1/2 LB培养基：蛋白胨5 g / L，酵母粉2.5 g / L，NaCl 5 g / L，pH 7.0-7.2，琼脂20 g / L。 1.1.2药剂

2 M NaAc；

100 mg / ml青霉素钠盐；

复红染色剂（100 ml）：碱性品红0.1 g 溶于10 ml酒精（95 %），再加90 ml苯酚(3 %水溶液)。 1.1.3 对照菌株

以大肠杆菌（Escherichia coli）、蜡质芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus cereus）和B. thuringiensis HD-1标准菌株为对照，进行分离培养基和分离方法的选择。大肠杆菌JM109 菌株、枯草芽孢杆菌T-HW3菌株HD-1 菌株为本实验室保存，蜡质芽孢杆菌为福建农林大学胡方平教授赠送。

1.1.4 分离材料

从武夷山自然保护区、泰宁状元岩、三明麒麟山、永安桃源洞、福州森林公园、鼓山、长乐、永泰、闽清等福建省内各地区采集25种植物的叶片样本127份进行Bt的分离。 1.2 试验方法

将采回的叶面研磨，取0.1g装入容量为250 ml三角瓶中，三角瓶装有10 ml LB液体培养基及不同配比的抗生素和醋酸钠，于28～30 ℃，250 r/min条件下摇瓶4 h，取200 μl悬浮液80 ℃水浴3 min，立即冰浴，解冻冰浴的样本，涡旋1 min，悬浮液在4100 g离心15 min，沉淀溶于1 ml无菌水，在10,000 g离心5 min，沉淀溶于200 μl无菌水，稀释培养72 h后, 观察具有Bt形态特征，

如白色糙面，边缘整齐或不整齐，圆盘状直径可达1 cm的菌落。挑取这些细菌于LB平板上划单菌落培养24 h，-4 ℃保存。 1.2.4 镜检 1.2.4.1 培养

挑取需检测的单菌落用1/2 LB培养基培养3 d。 1.2.4.2 染色

在干净的玻片中央滴一滴蒸馏水，用接菌环从单菌落上挑取适量菌体涂于蒸馏水中，玻片于酒精灯上来回过热两次，使菌固定，待玻片充分风干后，加复红染色剂染色30 s，用水缓慢冲去染色剂，凉干后油镜下检测是否存在形芽孢和伴孢晶体，通常Bt芽孢为透明椭圆形状，伴孢晶体紫色，呈圆形，椭圆形，菱形，双锥形，不规则等形状。有以上特征的菌株可初步鉴定为Bt分离株，保存备用。

[6]

实验十二 苏云金芽孢杆菌抑制真菌菌株的初筛

1材料与方法 1.1 菌株

实验所用的Bt菌株为本实验室分离和保存，病原真菌（香蕉枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、小白菜炭疽病菌、烟草疫霉病菌、辣椒疫霉病菌、水稻纹枯病菌和包菜菌核病菌）由本学院何红老师提供。 1.2 培养基组成及配制 1.2.1 LB培养基

LB培养基组成为胰蛋白胨10g/L 、酵母浸膏5g/L和氯化钠10g/L （pH7.0）。配制时将上述各物质加入盛有980ml蒸馏水的烧杯中，加热使之完全溶解，用1N NaOH调节pH值至7.0，然后定容至总体积为1L，分装后高压灭菌备用。LB固体培养基中另加入10-12g/L琼脂。Bt的保存和培养采用LB固体和液体培养基。

1.2.2 PDA 培养基

PDA 固体培养基组成为马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂13g/L（pH值7.0）。配制时将称好的马铃薯切成小块，煮烂后用纱布滤去渣质，在滤液中加入上述各物质并加热溶解，用1N NaOH调节pH值至7.0，然后定容至总体积1L，分装后高压灭菌，供病原真菌保存和培养用。抑菌实验所用培养基为PDA固体培养基中加入蛋白胨10g/L。 1.3 Bt外分泌蛋白粗提取

挑取一环经活化后的Bt菌苔，接入盛有LB液体培养基的烧瓶中，置28℃、200rpm条件下振荡培养48h，4℃、10000rpm离心20min，取上清液，缓慢加入固体(NH4)2SO4至100%饱和度，4℃静置沉淀过夜，4℃、10000rpm离心30min，弃上清液，沉淀用少量无菌去离子水溶解，置透析袋中4℃透析后即得蛋白粗提取液。透析过程中每隔3h更换一次无菌去离子水。 1.4 Bt抑菌培养基筛选

挑取一环经活化后的Bt菌苔，接入盛有LB液体培养基的烧瓶中，置28℃、200rpm条件下振荡培养过夜，按1%的接菌量分别转接到以下培养基中，28℃、200rpm振荡培养48h，4℃、10000rpm离心20min，上清液用于抑菌测定。 A：蛋白胨 10g/L,葡萄糖 5g/L,酵母膏 2g/L,KH2PO4 1g/L,FeSO427H2O 0.02g/L,

ZnSO427H2O 0.02g/L, MnSO427H2O 0.02g/L, MgSO427H2O 0.3g/L (pH7.0) B：蛋白胨 20g/L,蔗糖 2g/L,NaCl 5g/L,Na2HPO4 2.5g/L (pH7.0)

C：蛋白胨5g/L,蔗糖 3g/L,酵母膏 1.5g/L,NaH2PO4 1.2g/L,Na2HPO4 1.5g/L,

MnSO427H2O 0.02g/L,MgSO427H2O 0.02g/L (pH7.0)

D：牛肉膏 5g/L,蛋白胨 10g/L,酵母膏 5g/L,葡萄糖 5g/L,NaCl 5g/L (pH7.0) E：牛肉膏 3g/L,蛋白胨 5g/L, NaCl 5g/L (pH7.0) 1.5 Bt的抑菌测定---抑菌圈法 1.5.1 抑菌菌株初筛

在含有蛋白胨的PDA固体培养基平皿的中央部位，接入通过打孔器制成的病原真菌菌块，然后于菌块的左右和上下部位分别对称地点接上2个Bt菌苔，将接好菌的平皿置28℃的生化培养箱中培养7d，筛选出具有抑菌作用的Bt。 1.5.2 抑菌效果测定

在含有蛋白胨的PDA固体培养基平皿的中央部位，接入通过打孔器制成的Bt菌块或在空孔中加入上清液和蛋白粗提液，然后于其左右和上下部位对称地接上打孔器制成病原真菌菌块，处理好的平皿置28℃的生化培养箱中培养7d，测量抑菌圈直径大小。上清液和蛋白粗提液每隔1d添加一次，每次100ul，连续加3d。每个处理重复3次。

实验十三 质粒DNA的提取

[实验目的]

通过本实验掌握碱裂解法提取质粒。

[实验原理]

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

[仪器、材料与试剂]

（一） 仪器

1、 恒温培养箱 2、 恒温摇床 3、 台式离心机 4、 高压灭菌锅

（二） 材料

1.葡萄糖

2.三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3.乙二胺四乙酸（EDTA） 4.氢氧化钠

5.十二烷基硫酸钠（SDS） 6.乙酸钾 7.冰乙酸 8.乙醇

9.盐酸（HCl） 10.Bt菌株

11.吸头、小指管

（三） 试剂

1、 溶液I

50mmol/L 葡萄糖

5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl 10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0） 2、 溶液II

0.4mol/L NaOH , 2% SDS ,用前等体积混合 3、 溶液III

5mol/L乙酸钾 60mL

冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL 4、 TE缓冲液

10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA(pH8.0)

5、 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

[实验步骤]

（一） 提取质粒

1、 将Bt菌株接种于LB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。 2、 取1ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min离心30sec。 3、 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4、 将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。 5、 加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf

管放在冰上。

6、 加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。 7、 12000r/min，离心5min，将上清夜转至另一Eppendorf管中。

8、 向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5~10min。12000r/min离心5min。

倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

9、 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，真空抽干或空气

中干燥。

10、50μL TE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。

[实验安排]

本实验一天内可做完。实验结果可结合下一个实验一起观察。

实验十四 琼脂糖凝胶电泳检测DNA

[实验目的]

通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法。

[实验原理]

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular DNA,简称CCCDNA），开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂（open circular DNA ,简称OCDNA），线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linear DNA, 简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

[仪器、材料与试剂]

（一）仪器

1、 琼脂糖凝胶电泳系统 2、 凝胶成像系统

（二） 材料

1、 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 2、 硼酸

3、 乙二胺四乙酸（EDTA） 4、 溴酚蓝 5、 蔗糖 6、 琼脂糖 7、 溴化乙锭 8、 DNA marker 9、 检测样品

（三）试剂

1、 53TBE（5倍体积的TBE贮存液）

配1000ml 53TBE：

Tris 54g 硼酸 27.5g

0.5mol/l EDTA 20ml（pH 8.0） 2、 凝胶加样缓冲液（63）

溴酚蓝 0.25% 蔗糖 40% 3、 琼脂糖

4、 溴化乙锭溶液（EB） 0.5μg/ml

[实验步骤]

（一） 制备琼脂糖凝胶

按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度/% 线性DNA的有效分离范围/kb

0.3 5~60 0.6 1~20 0.7 0.8~10 0.9 0.5~7 1.2 0.4~6 1.5 0.2~4 2.0 0.1~3

称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml 0.53TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液，按100ml的凝胶加5μl的EB。

（二） 胶板的制备

1、 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，

不能留缝隙）。

2、 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 3、 将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层

均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

4、 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。 5、 加入电泳缓冲液至电泳槽中。

（三） 加样

用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。

（四） 电泳

1、 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。

2、 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。

[实验安排]

可将上一次实验产物作电泳材料。

实验十五 PCR基因扩增

[实验目的]

通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

[实验原理]

多聚酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

1、 变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，

即变性阶段。

2、 退火：使溶液温度降至50~60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火

阶段。

3、 延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导

下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5′→3′方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。

[仪器、材料与试剂]

（一） 仪器

1、 PCR热循环仪

2、 琼脂糖凝胶电泳系统 3、 凝胶成像系统

（二） 材料

1、

2、 3、 4、 5、 6、 7、

DNA模板 4种dNTP

引物1、引物2 Taq酶 琼脂糖

DNA相对分子质量标准物 吸头、小指管

（三）

1、

试剂

103缓冲液 500mmol/l KCl

100mmol/l Tris?HCl(pH8.3 ,室温) 15mmol/l MgCl2 0.1% 明胶 2、 43dNTP

1mmol/l dATP

1mmol/l dCTP 1mmol/l dGTP 1mmol/l dTTP 3、 Taq酶 4、 DNA模板 5、 引物1 6、 引物2

7、 引物溶液浓度

1U/μL 1ng/μL

10pmol/μl

[实验步骤]

1、 在0.5ml Eppendorf管内配制25μL反应体系：

反应物 体积/μL 10×buffer 2.0 dNTP 1.0 引物1 1.0 引物2 1.0 Taq酶 0.5 Template 1 ddH2O 13.5 总体积 20 2、 按下列程序进行扩增： ①、95℃预变性 5min ②、95℃变性 1min ③、55℃退火 2min ④、72℃延伸 3min ⑤、重复步骤②~④30次； ⑥、72℃延伸 10min 3、 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果

配制0.7%琼脂糖凝胶，取10μL扩增产物电泳。保持电流40mA。电泳结束后，紫外灯下观察结果。

[实验安排]

本实验1天内可完成，上午做PCR反应，下午做电泳检测。

实验十六 DNA重组

[实验目的]

通过本实验学会重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。

[实验原理]

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；然后，酶-AMP复合物再结合到具有5′磷酸基和3′羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后，产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12~16℃，连接12~16 h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lac Z′基因。Lac Z′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。Lac Z′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lac Z′基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的β半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lac Z′中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。

[仪器、材料与试剂]

（一） 仪器

1、 恒温摇床 2、 恒温水浴器 3、 恒温培养箱 4、 台式离心机 5、 低温离心机

（二） 材料

1.胰蛋白胨 2.酵母提取物

3.氯化钠（NaCl） 4.氨苄青霉素

5.氯化钙（CaCl2） 6.二甲基甲酰胺 7.Eco RI酶

8.T4 DNA连接酶 9.DH5α 10.λDNA

11.pUC19质粒 12.培养皿 13.接种针 14.玻璃涂棒 15.试管 16.酒精灯

17.镊子、牙签等

（三）试剂

1、 3mol/l KAc（pH5.2）

2、 X-gal：将X-gal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/ml，不需过滤灭菌，分装小包装，避光

贮存于-20℃。

3、 IPTG：取2g IPTG溶于8ml双蒸水中，再用双蒸水补至10ml，用0.22μm滤膜过滤除

菌，每份1ml，贮存于-20℃。

[实验步骤]

（一） （二）

质粒DNA的制备 pUC19质粒由公司直接购买。 制备重组DNA

1、 在灭菌的Eppendorf管中，加入pUC19质粒2μL（2μg/μL），2μL酶切缓冲液，1μL

Eco RI酶，无菌双蒸水15μL，至反应混合物总体积为20μL。离心混匀，37℃反应3 h（酶及缓冲液应放在冰上）。

2、 在另一无菌Eppendorf管中，加λDNA 1.5μg，加入1μL酶切反应液，1μL Eco RI 酶，

无菌双蒸水补到10μL，37℃反应3 h。

3、 反应完毕后，各取2μL酶解液做电泳分析。

4、 分别将余下的酶解液加入1/10体积的3 mol/L KAc（pH 5.2）溶液，再加2倍体积的无

水乙醇，-20℃冰箱，2 h（沉淀 DNA）。12000 r/min 4℃ 离心15 min，弃上清，加70%乙醇洗沉淀物，再离心，去上清，真空干燥后，加5μL TE溶液。

5、 将酶切后的2个DNA片段混合于一管中，加T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接

酶1μL，14℃保温14 h，并做转化实验。

[实验安排]

本实验结合下一个实验进行，E.coli感受态的制备和转化。

本实验约需要2天。

第一天：配试剂，制备质粒DNA，做完DNA重组后，暂放冰箱保存。

第二天：制备感受态细胞，铺琼脂板，细胞转化，倒置平皿37℃培养过夜（12~16 h）。 第三天：早晨观察结果。

实验十七 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

[实验目的]

通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法及技术。

[实验原理]

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。

[仪器、材料与试剂]

（一）

仪器

1、 超净工作台 2、 低温离心机 3、 恒温摇床 4、 恒温箱 5、 恒温水浴器

（二） 材料

1、 氯化钙（CaCl2） 2、 胰蛋白胨 3、 酵母提取液

4、 氯化钠（NaCl） 5、 氨苄青霉素 6、 大肠杆菌DH5α 7、 pUC19质粒 8、 Eppendorf管 9、 吸头、小指管

10、试管、培养皿、锥形瓶等

（三） 试剂

1、 1mol/l CaCl2溶液（高压灭菌） 2、 LB液体培养基

配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：

胰蛋白胨（bacto-typtone） 10g 酵母提取液（bacto-yeast extract） 5g NaCl 10g

摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20 min。 3、 氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存。 4、 LB固体培养基1000ml加15g琼脂。

[实验步骤]

1.从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2mL LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

2.取0.5ml菌液转接到一个含有50ml LB液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养2~3 h。（此时，OD600≤0.4~0.5，细胞数务必<108/ml，此为实验成功的关键）。 3.吸菌液1ml加入Eppendorf 管，10,000rpm离心15sec回收细胞。 4.用冰预冷的0.1mol/l CaCl2 500μL悬浮沉淀。 5.再离心15 sec（10000rpm），回收细胞。

6.再用冰预冷的0.1mol/l CaCl2 60μL重悬沉淀。 7.在-4℃下可保存2周（2~4 d时，转化效率最高）。

此细胞为感受态细胞。 8.同时做两个对照管：

受体菌对照：60μL 感受态细胞 + 2μL 无菌水

质粒对照：60μL 0.1mol/L CaCl2溶液 + 2μL 质粒DNA溶液 9.将管放到42℃循环水浴1~2min。 10.冰浴2min。

11.每管加800μL LB液体培养基，37℃培养1 h（慢摇）。

12.将适当体积（200μL）已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。 13.倒置平皿37℃培养12~16 h，观察细菌生长情况。

[实验安排]

本实验从制备感受态细胞到转化一天可做完，第二天早晨观察结果。

实验十八 不连续SDS-PAGE

一、原理及目的（略） 二、试剂

1、30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。置棕色瓶中，4℃保存。 2、1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液 3、10% SDS溶液

4、10%过硫酸铵：新鲜配制 5、TEMED溶液：4℃保存 6、1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液

7、23样品溶解液：2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液。

8、53Tris-甘氨酸电极缓冲液：每1000ml该溶液中，含15.1g Tris，94g甘氨酸和50ml 10%（W/V）SDS贮存液。

9、固定液：冰乙酸:甲醇:水=1:2:7

10、考马斯亮蓝R染色液：每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物（9:9:2）中，溶解0.25g考马斯亮蓝R，过滤除去未溶物。

11、脱色液：甲醇:水:冰乙酸=9:9:2

注：1、2、5、6、7由教师提供，其余由学生自己配制，其中8可在凝胶凝固的过程中配制，9、10、11在电泳时配制。 三、操作步骤： 1、准备步骤

1）将凝胶板依次用水、SDS、水、无水乙醇、水洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。 2）试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。 3）灭菌枪头、eppendorf管。 2、制备凝胶

1）安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中，以5%琼脂封底。 2）配制10%的分离胶（20ml）：依次将8ml蒸馏水，6.7ml 30%丙烯酰胺贮存液，5ml 1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液，0.2ml 10% SDS溶液，0.2ml 10%过硫酸铵，0.008mlTEMED混合，立即灌胶。

3）迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。小心在胶上覆盖一薄层正丁醇。

4）在分离胶聚合的过程（约40分钟）中，配制5%的积层胶（8ml）：依次混合5.5ml蒸馏水，1.3ml 30%丙烯酰胺贮存液，1.0ml 1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液，0.08ml 10% SDS溶液，0.08ml 10%过硫酸铵，0.008TEMED。TEMED应在灌胶前才加入。

5）分离胶聚合完全后，倒去正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面数次，用滤纸吸干胶面上的残余水。 6）灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。

7）积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯酰胺。

8）在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液。 3、样品的制备

在蛋白溶液中加入等体积的23样品溶解液，使蛋白的终浓度为3-4mg/ml，混合液在沸水浴中加热3分钟，冷却后即可上样。

4、上样

用微量进样器上样，每加入一种样品，应在下槽中洗涤加样器数次，最后在空白加样孔中加入等体积的SDS样品溶解液。 5、电泳

装好冷凝水系统，打开电源，初始电压为100-120V，当染料进入分离胶（这段时间约为20min）后，将电压提高到200-220V，继续电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。 6、后处理

1）固定：从电泳装置上卸下玻璃板，用镊子小心撬开玻璃板，除去积层胶部分，将分离胶移入固定液（固定液的量至少为胶体积的5倍）中固定，直至染料由蓝绿色变为黄色。 2）染色：除去固定液，加入染色液（用量同上），室温染色8小时或60℃染色2小时。 3）脱色：回收染色液，将凝胶浸泡于脱色液中，直至背景脱至无色，其间更换脱色液3-4次。 四、结果

绘制蛋白图谱，并对其进行必要说明。 五、注意事项

N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。

实验十九 酵母RNA的提取与分离

一、原理

酵母细胞置于含有SDS的缓冲液中，加等体积的苯酚水溶液，激烈振荡一段时间，将RNA和蛋白质分开，然后离心分层，RNA溶于上层水溶液中，DNA和蛋白质留在酚层，RNA可用乙醇沉淀出来。 二、试剂和材料 1、干酵母

2、SDS-Tris缓冲液：0.3%SDS，0.01mol/L MgCl2，0.1mol/L Tris，用盐酸调至pH7.2。 3、90%苯酚水溶液 4、20%乙酸钾溶液 5、95%乙醇 三、操作步骤

取5g干酵母，加入10ml SDS-Tris缓冲液，再加入15ml 90%苯酚水溶液，在室温下激烈振荡1小时，然后冷却至0-4℃，以下操作均在0-4℃进行。

上述提取液以4000rpm离心5min，取上层水相，加入1/10体积的20%乙酸钾溶液，再加入2倍体积的95%乙醇。在-16℃放置使RNA沉淀析出。将沉淀以4000rpm离心10min分离，用35%乙醇，95%乙醇和无水乙醇各离心洗涤沉淀一次，然后将其溶于少量1mmol/L NaCl溶液中，4℃保存。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/f7wr.html