蛋白质组学技术在鉴定啤酒浑浊蛋白中的初步研究_贾娟

第38卷第5期2011年09月

文章编号:1002-8110（2011）05-0027-04

酿LIQUOR

酒MAKING

Vol.38.№.5Sep.，2011

蛋白质组学技术在鉴定啤酒浑浊蛋白中的初步研究

贾

娟，王德良

（中国食品发酵工业研究院，北京100027）

摘要:啤酒中包含多种大麦蛋白，制麦和酿造过程中受到化学方式或酶的修饰，影响最终的啤酒浑浊稳定

vulgare

L.)，这些蛋

性。从啤酒中分离出的浑浊活性蛋白主要来自大麦储藏蛋白或大麦醇溶蛋白(Hordeum待进一步确认。

关键词：蛋白质组学；鉴定；啤酒浑浊蛋白中图分类号：TS262.5；TS201.2

文献标识码：B

白有富含脯氨酸，由许多不同分子量的片段组成。尽管对啤酒浑浊的研究时间较长，但是对于其特性方面的有

PreliminaryStudyoftheIdentificationofBeerTurbidityCausingProteins

byProteomicsTechnology

JIAJuan,WANGDe-liang

(ChinaNationalResearchInstituteofFoodandFermentationIndustries,Beijing100027，China)

Abstract:therearevarietiesofbarleyproteinsinbeer,modifiedbychemicalorenzymaticprocessduringmaltingandbrewingwhichaffectthestabilityofbeer.Turbiditycausingproteinsisolatedfrombeeraremainlystorageproteinsorgliadinfrombarley(HordeumvulgareL.).Theseproteinsareprolinerich,composedofmanydifferentmolecularweightfragments.Althoughthehistoryofturbiditystudyiscomparativelylong,thecharacteristicsofturbidityneedtobefurtherconfirmed.Keywords:proteomics;identification;turbiditycausingprotein0前言

蛋白质组学（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特之后蛋白质组学的在征，这个概念最早是在1995年提出的，各研究领域得到广泛应用。

啤酒中含有分子质量为5～100kDa的蛋白质0.5～1g/L。多数蛋白质都与啤酒浑浊的产生和泡沫的维持有关，而这两项指标是消费者评定啤酒质量的重要标准。啤酒清亮、透明是产品得到绝大多数消费者认可的一个重要参数。许多研究通过分析沉淀物质的化学组成得出啤酒中引起浑浊物质的特征是主要由多肽和多酚物质组成，这些多肽来源于大麦胚乳中富含脯氨酸的储存蛋白（也就是大麦醇溶蛋白），多酚物质来源于大麦麦芽和啤酒花。浑浊形成的主要原因是：在冷条件时，蛋白质和多酚物质形成聚合物。这些蛋白质-多酚复合体增大了微粒的表面积，从而产生浑浊，最终可以形成很大

收稿日期：2011-08-03作者简介：贾

娟（1980-），女，河南人，教师，主要从事食品微生物与

发酵工程的研究。

的粒子而沉淀下来。啤酒中能形成蛋白-多酚复合物的蛋白和多酚分别为浑浊活性蛋白和浑浊活性多酚。对蛋白质来说，只有分子中含有脯氨酸的蛋白质才是浑浊敏感蛋白（haze-activeprotein，HAP），而缺乏脯氨酸的蛋白质不具有浑浊活性，而且蛋白质形成浑浊的活性程度与其所含的脯氨酸硅胶能够大量的吸附这种蛋白质，所以又叫硅胶量成正比[1-3]。

洗脱蛋白（SilicaEluentProtein）。本研究对这些蛋白利用蛋白质组学技术进行提取、纯化、电泳、测序，能够提高啤酒浑浊蛋白的理论研究水平。1试验材料与方法

1.1实验所用啤酒主要来自市售啤酒及小试酿造啤酒。1.2

实验主要仪器

高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；高效液相色谱仪（美国Waters公司）；层析柱（北京宾达英创科技有限公司）；一维分离电泳：使用IPG胶条和固定化电解质干胶条(Amer-shamBiosciences,Uppsala,瑞典)

(pH：3~10,非线性,18cm)

IPGphor等电聚焦系统和二维分离使用双向电泳仪进行十二酯烷基磺酸钠凝胶电泳（SDS-PAGE）（凝胶15%（w/v））(Amer-Hewlett-PackardG1000A蛋白质序列分析shamBiosciences)；

仪（美国Hewlett-Packard公司）。

第五期

2方法

2.1啤酒中浑浊蛋白（HAP）的提取

酿酒2011

结果得出硅胶洗脱液主要由约40~50kDa和10~25kDa两组分蛋白质组成，结合SephadexG-75分离曲线可以得出40kDa蛋白组分含量占据硅胶洗脱液的主要部分，结果如图2所示。

蛋白提取物

二维梯度凝胶

白光扫

层析柱纯化

软件分析

纯化检测

挖胶

[4]

取2L清亮啤酒，添加硅胶400mg（200mg/L），搅拌1h，静（10min,4℃），收集硅胶吸附蛋置约30min。10000r/min离心

白沉淀。加250mL5%乙醇洗硅胶沉淀，10000r/min离心（10min,4℃）弃上清液。加200mL5%乙醇洗硅胶沉淀，10000r/min离心（10min,4℃）弃上清液。加30mL2%氨水洗脱硅胶表面吸附蛋白，10000r/min离心（10min,4℃）。收集上清溶液，用冰醋酸将上清液pH调节为7.0。将所得蛋白溶液用大体积50mmol/LPbs溶液过夜透析（3×5L）。硅胶洗脱液先用0.2μm滤膜过滤，再用Millipore5kDa超滤管离心浓缩4℃保存。至微量，

2.2二维梯度凝胶电泳和胶内酶解

使用1M的尿素或1%（v/v）B-巯基乙醇提取的蛋白质。一维分离使用IPG胶条和固定化电解质干胶条(3~10pH,非线性,18cm)。在使用IPGphor等电位聚焦系统32000Vh聚焦前，IPG胶条在含有IPG缓冲液的溶液中水化12h，每1mL该溶液含8M尿素、2%(w/v)CHAPS、0.5%(v/v)IPG缓冲液3~10、溴酚蓝和2.8mg二硫苏糖醇（DTT）。二维分离前，IPG胶条使用SDS平衡缓冲液进行平衡，该缓冲液包含50mMTris-ClpH8.8、6M尿素,30%(v/v)丙三醇、溴酚蓝、2%(w/v)SDS)、DTT和碘乙酰胺。二维分离使用双向电泳仪进行SDS-PAGE（凝胶15%（w/v））。对于胶内酶解，依照Neuhoff等改进的方法（1988）使用0.05%G-250胶状Coomassie着色剂在1%(v/v)的醋酸中进行染色，从凝胶中选择适当的斑点，切胶分离，洗涤，胰蛋白酶分解，洗提。对切离的胶块使用500μL含100mMNH4HCO3的30%(v/v)的乙腈液洗涤脱色2次，每次30min，随后用乙腈提取。蒸发掉残余的乙腈，用胰蛋白酶(250ng/25mL)在含33.33mMNH4HCO3的10%(v/v)的乙腈液中消化蛋白质。在300mL10%(v/v)乙腈或0.1%TFA中从胶块中提取多肽。

2.3质谱样品的制备与鉴定

切割差异蛋白点，用Hewlett-PackardG1000A蛋白质序列分析仪测定。蛋白质序列分析的结果与NationalCentreforBiotechnologyInformation

(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

andSWISSPROT/TrEMBLproteindatabases(http://www.77cn.com.cn/sprot)进行性比对，序列对比采用ClustalWprogramme(European

Molecular

Biology

Laboratory(EMBL)-European

BioinformaticsInstitute(EBI)(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).确定特征蛋白的蛋白组分。

简化的流程见图1：3结果与讨论

3.1浑浊蛋白的纯化鉴定

3.1.1用SephadexG-75对HAP蛋白质进行纯化

对收集的硅胶洗脱液浓缩后进行SDS-PAGE电泳分析，荧光扫描

蛋白质测序

质谱分析

数据分析

图1蛋白质组学技术的简单流程

12345

1,2-硅胶洗脱液；3,4-HAP；5-Marker图2浑浊敏感蛋白的SDS-PAGE电泳

3.2HAP蛋白中氨基酸分析结果

由HPLC法对啤酒原液和HAP中的氨基酸含量的分析发现，HAP中的脯氨酸含量约为44%，明显高于前者，图3为HAP和啤酒原液中氨基酸含量分析。HAP中总蛋白质质量浓

第五期贾娟，等:蛋白质组学技术在鉴定啤酒浑浊蛋白中的初步研究2011

度的对照如表1所示。很多研究者认为HAP中富含脯氨酸[5]，本实验结果也证实了这一点。

表1HAP中18种氨基酸含量

氨基酸精氨酸谷氨酸丝氨酸甘氨酸组氨酸天冬氨酸苯丙氨酸异亮氨酸

含量/mg·L-1

24.3071.6192.8141.2792.4141.01811.9173.483

氨基酸酪氨酸缬氨酸蛋氨酸脯氨酸亮氨酸丙氨酸苏氨酸色氨酸赖氨酸

166.24

含量/mg·L-1

0.1922.9671.48173.7714.247.93517.8842.0623.36

由图4中可以看出，在啤酒浑浊蛋白二维梯度凝胶电泳图中蛋白点主要分布在0～80kDa的蛋白点附近，具体分布而言包括25~50kDa以及10~15kDa两大群。同时在本研究中也发现了啤酒浑浊蛋白与以前文献中推测的理论相似[6-7]，即由高、中、低分子量蛋白构成的啤酒浑浊蛋白。取分子量较1A、1B、1C进行质谱鉴定。小的四种蛋白质，即2A、3.4质谱分析的结果

3.497半胱氨酸

-1

总计/mg·L

图5蛋白质水解肽段的信号结果

图5、表2为1A、1B、1C蛋白质的质谱结果，从从MascotSearch和SWISSPORT数据库中检索的此蛋白质的匹配率为约88.7％。从NCBI的检索结果显示此次实验所纯化的蛋白是大麦的一种醇溶蛋白（H.vulgareL.）的胰蛋白的抑制物BTI-CMe的前驱物。疏水性蛋白或它们的疏水性部分能够抵抗酿造过程中的热变性和酶解作用，最终存在于啤酒中继而参与啤酒浑浊的形成

图3HPLC法分析啤酒HAP氨基酸含量

[8-9]

。2A蛋白质的质谱结果，从Mascot

Search和SWISSPORT数据库中检索的此蛋白质的匹配率为约89.1％。从NCBI的检索结果显示此次实验所纯化的蛋白是大麦的germinE(大麦属)。BTI-CMe和germinE能够抵抗酿造过程中的热变性和酶解作用，最终存在于啤酒中继而参与啤酒浑浊的形成[10]。

目前对于高分子量蛋白要比低分子量蛋白更容易形成浑浊蛋白的原因仍不能明确，但本研究利用质谱来分析啤酒浑根浊蛋白中的蛋白点，以确定啤酒浑浊蛋白主要的组成成分。据蛋白质组学分析（双向电泳和质谱）发现啤酒中浑浊活性蛋白组分包括二个重要的组成部分：BTI-CMe蛋白，germinE蛋白。这一结果表明了这二种蛋白组分在啤酒浑浊形成中起然而由于实验条件的限制，本研究不能将到至关重要的作用。

啤酒浑浊蛋白二维梯度凝胶电泳图中的所有蛋白点切胶，酶解，进行质谱分析。

3.3啤酒浑浊蛋白的二维梯度凝胶电泳分析

图4啤酒浑浊蛋白的二维电泳图(pH=3-

10)

表2多肽序列特征和与数据库的匹配度

编号1A、1B、1C2A

pIa6.5~7.06.5~7.0

MWa1500025000

与SWISSPORT的多肽匹配IAAE_HORVUP01086IAAE_HORVUP01086

匹配度/%b88.789.1

pIc6.856.81

MWc13258.225138.2

4小结

本章应用了蛋白质组学的研究方法，对啤酒浑浊的特征蛋白进行了分析，主要包括BTI-CMe蛋白，germinE蛋白；研究结果表明了这二种蛋白组分在啤酒浑浊形成中起到重要

的作用。

[参考文献]

[1]Siebert,K.J.,Troukhanova,N.V.,Lynn,P.Y.,1996.Natureofpolyphenol-proteininteractions.JournalofAgriculturalFoodChem-

第38卷第5期2011年09月

文章编号:1002-8110（2011）05-0030-04

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酒MAKING

Vol.38.№.5Sep.，2011

新建窖池生产浓香型大曲酒质量的稳定和提高

王振环

（安徽九华山酒业有限公司，安徽池州

247000）

摘要:新建窖池生产浓香型大曲酒保持质量的稳定和提高，关键技术有（1）培养微生物环境。（2）因地制宜培养好优质老窖泥。（3）建窖窖形等设计合理操作方便。（4）把好养窖及生产工艺关。关键词：微生物环境;窖泥;窖池;超浓缩复合己酸菌液;质量;生产工艺TS262.31；TS261.4；TS201.2中图分类号：

文献标识码：B

TheTechniquesofStabilitatingandImprovingQualityofLuzhou-flavor

DaquLiquorinNewPit

WANGZhen-huan

(AnhuiJiuhuashanAlcoholCo.,Ltd.,Chizhou,Anhui,247000，China)

Abstract:ThetechniquesofstabilitatingandimprovingqualityofLuzhou-flavorDaquliquorinnewpit,whichincludethecultivatingthemicroorganisms'environment,cultivatingthehighqualityoldpitmud,designingagoodpitandpayingattentiontomaintenaceofpitandtechnicalprocesses.

Keywords:Microorganisms'environment；Pitmud；Pit；Concentratedcaproicacidbacterialiquid；Quality；Technicalprocesses

近年来随着企业不断发展壮大，安徽九华山酒业有限公司原有的发酵车间原酒生产量已经满足不了市场的需求，2007年起公司准备异地扩规，筹建新的生产厂区。为了确保

收稿日期：2011-06-03

作者简介：王振环（1962-），男，第六届、第七届国家级白酒评委、高级酿酒师，全国白酒标准化委员会兼香型白酒分技术委员会委员，安徽

新建窖池所产原酒质量及风格的稳定，公司技术人员做了大原酒的产量和质量量的工作。2009年新车间建成投产以来，

达到和超过了预定目标。为了总结提高、便于与广大同仁交流，现将我们的做法归纳试述如下，不妥之处还望广大同仁指正。

1网络移植微生物群系，营造酿酒微生物的生态环境

技术中心主任。九华山酒业有限公司总工、

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!istry44,80-85.leyandmaltandtheirrolesinmaltingandbrewing.Journalof[2]Asano,K.,Shinagawa,K.,Hashimoto,N.,1982.Characterizationofhaze-formingproteinsofbeerandtheirrolesinchillhazeforma-tion.JournaloftheAmericanSocietyofBrewingChemists40,147-154.

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