细胞培养

AEP对LPS诱导的Raw264.7细胞炎症模型抗炎实验

一、试剂与仪器 （一）细胞系 RAW264.7。 （二）试剂 胎牛血清

DMEM HyClone，美国 10000 U/mL 青霉素/链霉素Gibco，美国

DMSO Sigma，美国 lipopolsaccharide Sigma，美国 甲基四唑蓝(MTT) Sigma，美国 对氨基苯磺酸 Sigma，美国 N-α-萘乙二胺 Sigma，美国 （三）仪器 超净台 酶标仪

CO2恒温细胞培养箱 显微镜 离心机

（四）供试品配置

LPS 溶液配置：称取 LPS 粉末 5 mg，溶于 1 mL DMSO 中，得 5 mg/mL 母液。用时将母液用培养基稀释至 2 μg/mL（DMSO＜0.1%）。

MTT 溶液配置：称取 MTT 50 mg，溶于 10 mL PBS 中，避光震荡 30 min。0.22μm 滤膜过滤除菌，分装于避光 EP 管中，4℃保存，备用。

Griess试剂配置：A 液：对氨基苯磺酸 0.5 g，溶于稀醋酸（10%）150 mL 中，浓度 1%。B 液：N-α-萘乙二胺 0.1 g 用纯净水 20 mL 溶解，再用醋酸（10%）稀释至 150 mL，浓度 0.1%。临用前分别加入 50 μLA液和 50 μL B 液，避光显色 30 min。

待测化合物：AEP1，AEP2，AEP3，称取化合物固体 5-10 mg，用 DMSO 溶解成 50 mg/mL 母液。用前用培养基稀释至所测浓度。 二、实验方法 （一）细胞培养

RAW264.7细胞用含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM 培养基于 37℃，5% CO2条件下培养。RAW264.7 细胞培养 2-3 天或者长至 70-80%左右时进行传代，弃去培养瓶中旧培养基，加入新鲜培养基，拧紧盖子后轻拍培养瓶底部再用吸管反复吹打，将细胞吹匀后进行传代。 （二）细胞毒性实验

取长至 70%-80%的 RAW264.7 细胞，用滴管吹成单细胞悬液，加入含 10% FBS DMEM 培养基，调整细胞浓度为 1×105cell/mL，接种至 96 孔板中，100 μL/孔，每组 6 个复孔，37℃和 5% CO2培养过夜。除去旧液，除空白组外其他组给予相应浓度的含药培养基，培养 24 小时。实验结束前 4 小时，除去上清，加入 150 μL无血清 DMEM 培养基和 20 μL MTT (5 mg/mL)，37℃和 5% CO2培养 4 小时。4 小时后用注射器轻轻吸去上清，加入 150 μL DMSO，漩涡震荡 15 min，540 nm 下用酶标仪测各孔吸光度（OD）值，重复 3 次。 （三）化合物对 LPS 刺激 RAW264.7 细胞 TNF-α生成的影响

取长至 70%-80%的 RAW264.7 细胞，拍打培养瓶背面，吹成单细胞悬液，加入含 10% FBS DMEM 培养基调整细胞浓度为 5×105cell/mL，接种于 24 孔板中，每孔1 mL，37℃ 5% CO2培养过夜。吸去上清，除空白组外其余加入 1 mL 含 2 μg/mL LPS的 DMEM 培养基，37℃ 5% CO2孵育 2 小时后，空白组和 LPS 模型组加入 1 mLDMEM培养基，其他加入 1 mL 含各浓度药物的 DMEM 培养基。37℃ 5% CO2孵育 24 小时。培养结束后取上清用 PBS 稀释 20 倍，用 ELSA 试剂盒测按说明书操作测上清中 TNF-α含量。 （四）化合物对 LPS 刺激 RAW264.7 细胞 IL-2生成的影响

取长至 70%-80%的 RAW264.7 细胞，拍打培养瓶背面，吹成单细胞悬液，加入含 10% FBS DMEM 培养基调整细胞浓度为 5×105cell/mL，接种于 24 孔板中，每孔1 mL，37℃ 5% CO2培养过夜。吸去上清，除空白组外其余加入 1 mL 含 2 μg/mL LPS的 DMEM 培养基，37℃ 5% CO2孵育 2 小时后，空白组和

LPS 模型组加入 1 mLDMEM培养基，其他加入 1 mL 含各浓度药物的 DMEM 培养基。37℃ 5% CO2孵育 24 小时。培养结束后取上清用 PBS 稀释 20 倍，用 ELSA 试剂盒测按说明书操作测上清中 IL-2含量。 （五）统计分析

实验重复 3 次。实验数据以?x±SD表示。使用 SPSS 18.0 软件对数据进行统计学分析，采用单因素方差分析 (One-Way ANOVA)，组间差异以 LSD-t 法和Dunnett’s t-test法进行比较；与空白组比较，显著性差异分别表示为*p<0.05，**p<0.01。

AEP抗炎机制

一、试剂和仪器 （一）Western blot:

RIPA 组织细胞快速裂解液上海基尔顿生物 BCA 蛋白定量试剂盒Thermo 蛋白预染 MarkerFermentas 丽春红(Ponceau S) 上海基尔顿生物 NC 膜/发光液Millipore 脱脂奶粉BD 分装 Tween-20 吐温-20Amresco X 光胶片柯达 仪器

mini protean 3 cell 电泳仪 电转仪 MK3 酶标仪 水浴锅 抗体

TLR-4 p38 JNK ERK1/2 p-IκB p-p65 p-IKK GAPDH

羊抗兔 HRP 标记二抗碧云天 羊抗鼠 HRP 标记二抗碧云天 （二）RT-PCR:

Trizol

氯仿 HPLC 级 异丙醇 HPLC 级 SYBRGreen PCR 试剂盒 逆转录试剂盒 仪器

旋涡振荡器 电动匀浆机 低温冷冻离心机

ABI-7300Real-time 检测仪 mRNA 引物

Rat COX-2

Primer F 5' CCTGGTCTGATGATGTATGC 3' Primer R 5' GTATGAGTCTGCTGGTTTGG 3' Rat iNOS

Primer F 5' GTCCTACACCACACCAAAC 3' Primer R 5' CTCCAATCTCTGCCTATCC 3' Rat GAPDH

Primer F 5' ATCACTGCCACCCAGAAG 3' Primer R 5' TCCACGACGGACACATTG 3' 二、实验方法 （一）供试品配置

LPS 溶液配置：称取 LPS 粉末 5 mg，溶于 1 mL DMSO 中，得 5 mg/mL 母液，使用时用 DMEM 培养基稀释至 2 μg/mL（DMSO＜0.1%）。

待测化合物：称取化合物固体（LC-36, LC43）5-10 mg，用 DMSO 溶解成 50 mg/mL 母液，用前用 DMEM 培养基稀释至所测浓度。

TBST 缓冲液：称取Tris base 2.42 g，NaCl 8.01 g，溶于 800 mL 去离子水中，用HCl调 pH 至 7.6，去离子水定容至 1000 mL，加入 2 mL 吐温-20 混匀。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/f2ot.html