胶体金免疫层析法检测玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究

胶体金免疫层析法检测

玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究

刘　波　江晓娣　黄慧艳

（）武汉市粮油食品中心检验站　４３００２１

＊

摘　要　采用乙酸乙酯提取法对玉米样品前处理，然后用胶体金免疫层析法检测其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。该法简便快捷，与ＨＰ因此采ＬＣ国家标准法相比检测结果一致，用此法可加强粮食的卫生监管。

关键词　玉米　脱氧雪腐镰刀菌烯醇　胶体金

ＯＮ是最常见的一种污　　脱氧雪腐镰刀菌烯醇Ｄ

染粮食、饲料和食品的霉菌毒素之一，严重影响人和牲畜的健康。它主要是由链孢霉属真菌在缺乏营养

１］

，物质时产生的次级代谢产物［其结构为雪腐镰刀

由于其使用的方便疫层析法是免疫层析法的一种，

快捷性，检测的准确性愈来愈受到人们的重视；该法滴加提取液到检的原理是通过以胶体金为示踪物，

测孔中，抗原抗体反应生成不同深浅的颜色来判定样品中ＤＯＮ的含量。胶体金免疫层析法操作简检测速度快，很适合现场检测，得到了愈来愈多单，的应用。

，菌烯醇（的４－脱氧衍生物，所以命ｎｉｖａｌｅｎｏｌＮＩＶ），名为脱氧雪腐镰刀菌烯醇（４－ｄｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌｅｎｏｌｙ

［２］

。许多粮谷类都可以受到污染，如小麦、大ＤＯＮ）

麦、燕麦和玉米等。ＤＯＮ对粮谷类的污染状况与产温度、湿度、通风和日照等因素有关。这种毒菌株、

真菌大多在低温、潮湿和收割季节，在谷物中慢慢生长，一般在大麦、小麦、玉米、燕麦中含有较高的浓在黑麦、高粱、大米中的浓度较低，对人和动物可度，

１］

。近年研究发现，以产生广泛的毒性效应［脱氧雪

１　材料与方法

１．１　仪器与试剂

胶体金检测Ｗａｔｅｒｓ２６９５高效液相色谱系统，　／），试剂盒（最低检出限为１高速离心机。０００μｋｇｇ

，，液体）乙酸乙酯（分析纯）甲醇ＤＯＮ标准品（（，，分析纯）乙腈（分析纯）蒸馏水。１．２　方法

１．２．１　高效液相色谱法

／参照国家标准《ＧＢＴ２３５０３－２００９食品中脱　氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和层析净化高效

［５］

。液相色谱法》

腐镰刀菌烯醇对人和动物的免疫功能产生明显的影响。根据ＤＯＮ的剂量和暴露时间不同可引起免疫抑制或免疫刺激的作用。目前我国谷物中ＤＯＮ

［３］

／的最高值不得超过１０００μｋｇｇ。

当前国家标准中对ＤＯＮ的检测方法主要有酶联免疫吸附法（和免疫亲和层析净化高ＥＬＩＳＡ法）。酶联免疫吸附法是最常效液相色谱法（ＨＰＬＣ法）用的一种不需额外净化，一次性检测大量样品的方法，这种方法的主要缺点是由于存在所用抗体与致使其检出值偏ＤＯＮ的乙酰化类似物的交叉反应，

４］

。免疫亲和柱净化容易出现假阳性，难以控制［高，

１．２．２　胶体金免疫层析法

１．２．２．１　称取具有代表性的５０ｇ～１００ｇ以上谷

粉碎，过２混匀后称取２．物样品，０目筛，０ｇ试样加入到１５ｍＬ离心管中。再分别加入４．０ｍＬ乙酸乙盖紧盖子后放置于振荡器充分振荡酯和去离子水，

放置于离心机中４５ｍｉｎ，０００ｒｍ，１ｍｉｎ。待液体分ｐ用刻度管量取２．层，０ｍＬ上层清液于８０ｍＬ玻璃烧杯中，用电吹风加热，将上清液吹干。待烧杯冷却

处理的高效液相色谱法（灵敏度高，准确性ＨＰＬＣ）好，得到了广泛的认可，但使用成本昂贵，前处理过程较为繁琐，不利于大规模的推广使用。胶体金免

＊收稿日期：２０１２－０４－２４

通讯地址：武汉市江汉区江汉一路７－９号

至室温后按照表１准确加入稀释液，即为检测液。

表１　稀释液对照表残留限量（ｐｐｂ）２００　５００　７５０　１０００稀释液加量（ｍＬ）

２　

５　

７．５　

１０

１．２．２．２　将未开封的试纸卡和检测样品恢复至室温；再将试纸卡水平放置，用滴管向试卡孔缓慢逐滴加入３滴不含气泡的检测液，过５ｍｉｎ后判断结果，不能超过１０ｍｉｎ。１．２．２．３　结果判断

阴性：Ｃ线显色，Ｔ线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性。

阳性：Ｃ线显色，Ｔ线不显色，或者Ｔ线隐隐约约，判为阳性。

无效：Ｃ线不显色，无论Ｔ线是否显色，该试纸均判为无效。

检测卡的显色效果见图１

。

图１　检测卡的显色图

２　结果与讨论

２．１　前处理条件的优化２．１．１　不同粉碎程度的选择

从混匀的同一份样品中分别称取２．０ｇ未粉碎的糙米样品、存在较大颗粒的粉碎糙米样品、粉碎过２０目筛的糙米样品，按照１．２．２．１和１．２．２．２进行样品的提取和点样分析，

对６份不同玉米样品进行检测，同时用ＨＰＬＣ法进行比对，

检测结果见表２。从表２可以看出，只有粉碎细度达到２０目以上的样品检测结果才和ＨＰＬＣ法的检测结果相一致，而未粉碎的糙米和较大颗粒的粉碎糙米均出现假阴性，因此样品应粉碎至２０目以及更细。

表２　不同粉碎程度样品检测结果样品

样品中ＤＯＮ

样品细度

编号含量（μｇ／ｋｇ）未粉碎

过２０目筛－ＨＰＬＣ法糙米粉碎糙米

粉碎糙米

１　３６６２阳阳阳２　１３４７阴阴阳３　１８５６阴阳阳４　

６２１

阴

阴

阴

２．１．２　不同提取液的选择

分别用甲醇、乙腈和乙酸乙酯作为提取液对样品２以及样品３进行前处理，

试验结果表明乙酸乙酯和乙腈的提取检测效果好于甲醇，相比之下，乙腈的毒性明显要大于乙酸乙酯，因此选择乙酸乙酯作为提取液。

２．１．３　点样后观察时间的限定

将阳性样品的待测液滴加到试卡孔中，并开始计时，分别在３ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ判读结果，结果显示在第３ｍｉｎ，Ｔ带刚刚出现，但并不显著，在第５ｍｉｎ时Ｔ带红色线条明显，在第１０ｍｉｎ、１５ｍｉｎ判读结果时，Ｔ带红色逐渐减弱，因此选定５ｍｉｎ为最佳判读时间，随着时间的延长，判读结果就不准确了。２．２　最低检出限

将ＤＯＮ标准品分别稀释成浓度为２００，４００，８００，１０００，１２００，１６００和２０００μｇ／ｋｇ并滴加到试卡孔中，结果见表３。从结果可以判定，该测试卡的最低检出限为１０００μｇ／ｋｇ

。表３　不同稀释浓度的最低检出限

标准品浓度（μ

ｇ／ｋｇ）２００　４００　８００　１０００　１２００　１６００　２０００Ｔ带

红

红

微红

微红

微红

无

无

２．３　准确性

取８份玉米样品，按照ＨＰＬＣ的国家标准方法进行测定，与按照１．２．２前处理方法进行处理的检测数据进行比较，结果见表４。

表４　胶体金法与ＨＰＬＣ法检测结果对比样品编号

胶体金法ＨＰＬＣ法结果是

否一致１

Ｔ带不显色，阳性３６６２

是２Ｔ带显红色，阴性６２１是３Ｔ带不显色，阳性２１３９是４Ｔ带不显色，阳性１３４７是５Ｔ带不显色，阳性１６７９是６Ｔ带不显色，阳性１００５是７Ｔ带不显色，阳性１８５６是８

Ｔ带显红色，

阴性６６２

是

　结论

从以上试验结果可以看出，胶体金法检测玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的结果与ＨＰＬＣ国标法的结果完全一致，

且操作过程简单，检测结果准确、快速，特别适合基层检验和快速检测，对更好地加强粮食饲料的卫生监管具有重大的意义。

（下转第５３页）

３

共用共享的前提是标准化。由于粮食物流行业的信制订相关标准的条件不成熟。在息技术应用较少，

推进粮食物流信息标准化的过程，常遇到“先有鸡还是先有蛋”的困惑。为此建议推进粮食物流信息标准化采取抓两头带动中间的做法。“两头”其中之一是制订粮食物流信息标准体系。从粮食物流全局和提出标准体系的构成和需要制订的标准发展趋势，

细目，明确各标准的编制内容和各标准间的逻辑关系，以便在某些粮食物流信息技术有一定的应用实践时，及时进入对应标准的制订程序，发挥标准的统一实践指导实践的作用。制订标准体系，也必须有好在国内外信息技术发展很快，有许一定的实践，

多可以借鉴、参考的资料。由于信息技术是一个处新的技术内涵不断涌现，因于快速发展中的新技术，

此粮食物流信息标准体系，应该是开放的动态的体系，随着信息技术的发展和粮食物流实践的丰富，标

准体系要定期不断改修补充充实。推动信息标准化的另一头是抓实践。以业务的需求作为制订标准的需求，以应用信息技术的实践作为制订标准的基础。例如粮食物流业务中，需要使用粮食物流条码标签、电子单证等。为此，先在一定范围内试点使用电子单证、条码标签开展业务。通过使用，弄清这些单条码在使用是否方便，内容是否全面，是否容易证、

实现信息传送和共享。进而通过总结提高，再制订标准。这样制订的标准就更加准确实用。选择信息技术应用实践中，已经熟悉的、涵盖的内容比较单一的技术，制订标准，这些标准积累多了就有条件制订同时也可以提高标准的使内容更加广阔的大标准，

用价值，推动粮食物流信息化的进程。

粮食物流信息化是推动粮食物流发展的、有事半功倍效果的关键技术，积极应用信息技术，将使粮食物流产业实现跨越式发展。

檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭（上接第３７页）

参　考　文　献

鲍蕾，褚庆华．农产品中真菌毒素的检测分析１　张艺兵，

［化学工业出版社，Ｍ］．２００６，１０～１１

２　ＫｒｓｋａＲ，ＢａｕｍａｒｉｎｅｒＳ，ＪｏｓｅｈｓＲ．Ｔｈｅｓｔａｔｅ－ｏｆ　　　　ｇｐ

ａｒｔｉｎｔｈｅａｎａｌｓｉｓｏｆｔｅ－ＡａｎｄＢｔｒｉｃｈｏｔｈｅ－ｔｈｅ　　　　　　　　　－ｙｙｐ［］ｃｅｎｄｍｃｏｔｏｘｉｎｓｉｎｃｅｒｅａｌｓＪ．ＦｒｅｓｅｎｉｕｓＪＡｎａｌＣｈｅｍ，　　　　　　ｙ（）：２００１，３７１２８５～２９９

３　中华人民共和国卫生部．ＧＢ２７６１－２０１１．中华人民共　

和国国家标准－食品安全国家标准食品中真菌毒素限

］量［中国标准出版社，Ｓ．北京：２０１１－１０－２０

王松雪，王海鸥．粮谷中脱氧雪腐镰刀菌烯醇净化４　郭婷，

］（：检测技术研究进展［粮油食品科技，Ｊ．２００９，６）３１～３４

５　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家

／标准化管理委员会．ＧＢＴ２３５０３－２００９．中华人民共　和国国家标准－食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免］疫亲和层析净化高效液相色谱法［北京：中国标准出Ｓ．版社，２００９－０５－０１

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