蛇苔细胞色素c_cytc_的序列分析及功能预测

武汉植物学研究2009,27(4):432~436JournalofWuhanBotanicalResearch

蛇苔细胞色素C(CytC)的序列分析及功能预测

边春象

1,3

,李劲涛,彭正松,阮期平

213*

(1.西华师范大学生命科学学院,四川南充 637002;2.北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京 100124;

3.绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室,四川绵阳 621000)

摘 要:通过核酸序列比对,在蛇苔cDNA文库中获得细胞色素C(CytC)基因序列,并对其编码的蛋白质产物从同源性、氨基酸组成、理化性质、亚细胞位点、结构和功能等进行生物信息学分析和预测。结果表明,该cDNA序列具有完整的开放阅读框(ORF,104~442bp),推测编码蛋白为112个氨基酸,与向日葵、荞麦、玉米等CytC存在着较高的保守性(相似性分别为84%、85%和84%),同属于细胞色素C超家族;蛇苔CytC蛋白的分子量为11998.7Da,不含信号肽,成熟的CytC起始于Ala2,其活性位点为Cys23、Cys26、His27和Met89;对蛋白质的翻译后修饰预测表明Ala2存在乙酰化修饰,Lys81和Lys95分别进行三甲基赖氨酸修饰。这些特点与其他植物CytC保持一致,表明该基因为蛇苔cytc基因,在进化上相对保守。关键词:细胞色素C;蛇苔;序列;功能预测

中图分类号:Q943 文献标识码:A 文章编号:1000-470X(2009)04-0432-05

SequenceAnalysisandFunctionPredicationofCytC

fromConocephalumconicum(L.)Dum.

BIANChun-Xiang,LIJin-Tao,PENGZheng-Song,RUANQ-iPing

1,3

2

1

3*

(1.CollegeofLifeScience,ChinaWestNormalUniversity,Nanchong,Sichuan 637002,China;2.TheCollegeofLifeScienceand

Bio-engineering,BeijingUniversityofTechnology,Beijing 100124,China;3.KeyLaboratoryforMolecularBiologyand

Biopharmaceuticals,MianyangNormalUniversity,Mianyang,Sichuan 621000,China)

Abstract:ThroughnucleotideblastthecytcgenewasgainedfromthecDNAlibraryofConocephalum

conicum,anditsproducewasanalyzedinthefollowingaspects:thehomology,compositionofaminoacids,physico-chemicalcharacters,subcellularlocation,tertiarystructure,functionandsoonbybioinformationaltools.Theresultindicatesthesequencehasacompleteopenreadframe(104-442bp),anditencodes112aminoacidswhichhasahighhomologywithHelianthusannuus,Fagopyrumesculentum,ZeamaysandotherplantsCytCs.TheyallbelongtoCytochromeCsuperfamily.Withmolecularweight11998.7Daandnosignalpeptide,thesequenceofConocephalumconicumCytCstartsAla2andtakesCys23,Cys26,His27andMet89asitsactivesites.WhatismoreAla2isacetylizedandthesitesLys81/Lys95aremodifiedtobetrimethyllysine.AllthesecharacteristicskeepinlinewithotherplantCytCs,whichilluminatesthesequencewegotiscytcgenewhichisconservedinthecourseofevolution.Keywords:CytochromeC(CytC);Conocephalumconicum(L.)Dum.;Sequence;Functionpredication 细胞色素C(cytochromeC,CytC)是存在于细胞线粒体中的一种以血红素为辅基的蛋白质,是唯一能溶于水的细胞色素,它可以交互地与细胞色素还原酶(复合体Ó)的细胞色素C1和细胞色素氧化酶(复合体Ô)接触,起到在复合体Ó和Ô之间传递电子的作用。目前在真核生物和细菌中

[1,2]

都有发现。此外,细胞色素C也是诱导细胞凋亡的重要分子

[3]

到克隆和分析,如拟南芥(Arabidopsisthaliana)、向日葵(Helianthusannuus)

[5]

[4]

、荞麦(Fagopyrum

[6]

esculentum)、番茄(Solanumlycopersicum)和玉

[7]

米(Zeamays)等,但苔类植物CytC的研究在国内外鲜有报道。

四亿多年前,苔类植物从单细胞水生藻类进化而来,它是最早的陆生植物之一,在绿色植物进化方面起关键性作用,因此苔类植物细胞色素C甚至整

。许多植物的cytc基因都已经得

收稿日期:2008-08-25,修回日期:2009-01-15。

作者简介:边春象(1984-),男,硕士研究生,主要研究方向为分子生物学(E-mai:labzyme123@http://www.77cn.com.cn);阮期平(1961-),男,教授, 博士,主要研究方向为分子生物学与生化药学。(for.E-mai:l@.co

第4期 边春象等:蛇苔细胞色素C(CytC)的序列分析及功能预测433

个电子传递途径作用机制应该是陆生植物进化中的雏形。2008年,Stefan等在Science上报道首个苔类植物(Physcomitrellapatens)的基因组序列,从而为苔类植物作为一种模式生物来研究陆生植物的进化提供了有力的支持,并引起了对苔类植物的研究热潮。本文是以蛇苔为材料来研究CytC,采用生物信息学的方法对其推导的氨基酸序列从组成、理化性质、亚细胞定位、翻译后修饰和结构功能等进行预测和分析,进而为研究苔类植物CytC的作用机制乃至整个电子传递途径奠定基础。

[8]

阅读框,编码112个氨基酸(图2)。以起始密码子ATG的A碱基为第一位(标记为+1),在+4位核苷酸为G,在-3位核苷酸为T,符合Kozak序列

[10,11]

(gccRccAUGG),其中R是一种嘌呤(腺嘌呤和鸟嘌呤),研究表明,Kozak序列在翻译的起始起着重要作用。用NucleotideBlast对蛇苔cytc序列进行同源性分析的结果表明,蛇苔CytC的核酸序列与其他植物,如拟南芥(AY114580)、葡萄(Vitisvinifera,EU595418)和向日葵(Helianthusannuus,L77113)的相似性分别为76%、75%和75%。其推导的氨基酸序列用Blastx程序进行同源性比对的结果表明,该氨基酸序列与其他植物的CytC具有很高的同源性,如向日葵(P00070)、荞麦(P00072)、番茄(P00060)和玉米(P00056)的相似性分别为84%、85%、84%和84%。由此可以说明,我们得到的是cytc基因,并可以揭示出不同物种中的cytc基因及其编码的氨基酸序列间具有高度的相似性,

在初级结构上是保守的。

[11]

[12]

1 材料与方法

蛇苔(Conocephalumconicum(L.)Dum.)材料采自四川省北川县小寨子沟自然保护区。总RNA的提取是参考改进过的LiCl方法

[9]

;SMART

TM

cDNALibraryConstruction试剂盒购自美国Clontech公司;DNA序列测定在上海Invitrogen公司完成。

依据DNAStar、ANTHPROT2000以及http://www.ncb.inlm.nih.gov/、http://www.77cn.com.cn/sprot/和http://www.unipro.torg/等网站提供的生物信息学软件在线进行分析。核酸及氨基酸序列的同源性分析和多序列比对是用Blast和ClustaWl2完成;用ORFFinder、ProtParam和ANTHPROT2000对开放阅读框、理化性质和亲水性、疏水性分别进行分析;亚细胞位点和N端信号肽分析是通过EpiLoc和iPSORT软件完成;最后利用TermiNator和Geno3D在线软件对翻译后修饰、三级结构和功能进行预测分析。

2 结果与讨论

2.1 蛇苔CytC的基因序列的获取与多序列比对分析

通过改进的LiCl方法获得了较高质量的RNA,保证该cDNA文库构建的质量(图1)。用NCBI中的SpecializedBlast对测序结果进行分析得到一条长924bp的核酸序列,它包括一个339bp

的开放

图2 推导的蛇苔CytC的开放阅读框和氨基酸序列Fig.2 TheORFsequenceanddeducedaminoacidsof

CytCfromConocephalumconicum(L.)Dum.

2.2 细胞色素C的理化性质

用ORFFinder和ProtParam等在线软件对蛇苔、向日葵、荞麦、番茄和玉米中CytC的理化性质进行分析的结果(表1)表明,各植物CytC的氨基酸序列长度、分子量、理论等电点、带正负电荷氨基酸的数量和稳定系数(都属于稳定蛋白)等基本一致。但在消光系数上蛇苔CytC与其他植物存在着较大的差异,进一步分析发现蛇苔CytC中色氨酸和酪氨酸的含量普遍低于其他植物,推测这有可能

[13]

图1 对蛇苔总RNA提取的琼脂糖凝胶分析Fig11 AgarosegelelectrophoresisanalysisofthetotalRNAfromConocephalumconicum(L.)Dum.leaves

和苔类植物阴湿的生存环境有关,对此我们将作进

一步研究。总的来说,蛇苔CytC与其他植物CytC

434武汉植物学研究 第27卷

2.3 蛇苔CytC氨基酸序列的亲水性/疏水性分析

亲水性/疏水性是氨基酸的重要特性,疏水性氨基酸残基在蛋白质的内部,而亲水性氨基酸残基一般在外部,这对蛋白质的三维结构和蛋白质与蛋白质之间的相互作用起着重要影响

[14]

(apocytochromeC)和成熟的CytC的氨基酸序列完全相同,只是没有血红素,这种无血红素细胞色素C可以通过线粒体外膜蛋白通道自由地扩散穿过线粒

[2]

体外膜。因此CytC作为一个核编码的蛋白质

[18]

。因此,亲水无需N端信号肽便可进入线粒体。

性/疏水性的预测和分析对蛋白质结构的预测与功能分析均可提供参考。采用ANTHPROT2000软件

[12,15]

2.5 蛇苔CytC的翻译后修饰和其三级结构预测

蛋白质的翻译后修饰(PTM)是一个重要的细胞调控机制,它可以改变蛋白质的理化性质、折叠、构造和功能等

[19,20]

对蛇苔CytC的亲水性/疏水性分析的结果

(图3)表明,第104的异亮氨酸(Ile)的疏水性最强(分值为151000),第98位的谷氨酰胺(Gln)和99

位的谷氨酸(Glu)的亲水性最强(分值都为-19.000)。从总体上看,大部分氨基酸(分值为负)属于亲水性氨基酸,因此蛇苔CytC是亲水蛋白。进一步分析拟南芥、向日葵、荞麦、番茄和玉米中CytC的结果均显亲水性。

2.4 蛇苔CytC的亚细胞位点和N端信号肽分析蛋白质在细胞中的定位与其执行的功能密切相

[16]

关。采用EpiLoc程序对蛇苔CytC亚细胞定位进行预测,结果表明,蛇苔cytc基因编码的蛋白质定位于线粒体中(表2),这与其功能相符合。我们

[17]

又进一步用iPSORT对其N端信号肽进行预测的结果显示,无N端信号肽存在。用同样的方法分析拟南芥、荞麦和向日葵时遇到同样的结果。这是因为在细胞溶胶中的CytC称为无血红素细胞色素C

。随着蛋白质组学的不断发展,

对这方面的研究越来越深入,这将会促进对细胞调

[21-23]

控的进一步了解。根据TermiNator对蛇苔CytC的N端修饰进行预测,结果显示:该成熟的蛋白质去除了第一位的甲硫氨酸起始于第二位的丙氨酸,同时丙氨酸进行乙酰化修饰。用Geno3D和SWISSMODEL在线软件对蛇苔CytC三级结构进行分析结果(图4)表明,与其最接近的结构是水稻CytC(PDB编号:1CCR,E值:81000000e-40),该结构包括四个B-折叠、三个A-螺旋和一些转角等,并且在Lys81和Lys95上分别进行了三甲基赖氨酸(TML)修饰。这与已研究清楚的小鼠(PDB编号:[25][26]

2aiu)和牛(PDB编号:2b4z)的CytC三级结构相比较存在着类似的情况,说明蛇苔CytC在高级结构上没有明显变化,从而推测其可能在不同动植物体内起着相同的功能。

[24]

表1 不同植物细胞色素C的理化性质Table1 ThephysicalandchemicalparametersofCytCs

负电荷氨正电荷氨

基酸数目基酸数目消光系数分子量

氨基酸数目理论等电点TotalTotalExtinctionMolecularNumberofTheoret-inumberofnumberofcoefficientsweightaminoacidscalpInegativelypositively

(Da)(M-1#cm-1)

chargedchargedresiduesresidues

112114112

112112111111111

11998.712394.112128.812128.812112.712098.912022.612015.0

9.709.349.49

9.499.499.579.379.25

7118

88899

1617151515161514

12950~1307514440~1456514440~1456514440~1456514440~1456514440~1456514440~1456514440~14565

半衰期

稳定系数

Estimated

Instability

hal-flife

index

(h)

30303030304.44.44.4

24.5335.2628.55

28.5529.3127.0120.5031.28

物种名称Species

编号Locus

蛇苔Conocephalumconicum拟南芥Arabidopsisthaliana向日葵Helianthusannuus

-NP-173697P00070

AAA92712AAR30955P00072P00060P00056

荞麦Fagopyrumesculentum番茄Solanumlycopersicum玉米Zeamays

注:消光系数是分光光度计法在280nm波长水中测得。

Note:Theextinctioncoefficientsaremeasuredspectrophotometricallyin280nminwater.

表2 对蛇苔CytC预测的亚细胞位点

Table2 TheresultofpredictingsubcellularlocationofCytCfromConocephalumconicum(L.)Dum.

预测位点

Predictedlocation得分Score

线粒体Mitochondrial0.546928

内质网ER0.112172

细胞质

Cytoplasmic0.100889

细胞外

Extracellular0.0819316

溶酶体Lysosomal0.0679985

细胞核Nuclear0.0357395

过氧化氢酶体细胞膜高尔基体

PeroxisomalMembranceGolgiapparatus0.032686

0.0131917

0.00846455

第4期 边春象等:蛇苔细胞色素C(CytC)的序列分析及功能预测435

超家族,该保守区大约在第5到108位氨基酸之间(包括血红素和铁原子的结合位点)(图5)。用ClustaWl2把蛇苔CytC的氨基酸序列同已研究过的向日葵、荞麦、番茄、玉米和水稻CytC的氨基酸序列进行比较,结果表明:这些序列存在高度的同源性,并且起始的第一个氨基酸大部分为丙氨酸(图6)。通过这几个已经公布活性位点的氨基酸序列,我们可以预测蛇苔的活性位点为C23、C26、H27和M89,其中血红素与C23和C26结合,铁原子与H27和M89相互作用,这些功能位点在这些植物中没发生任何变化。另外,从图中还可以看出CytC在蛋白质修饰位点同样十分保守,如乙酰化位点(A1/A2)和三甲基赖氨酸修饰位点(K80/K81和K94/K95,玉米第94个位点除外)。总体看来,植物中CytC

在功能区十分保守。

图5 蛇苔CytC的保守区

Fig.5 TheconserveddomainofCytCfrom

Conocephalumconicum(L.)Dum.

3 小结

通过以上分析可以确定,从蛇苔cDNA文库中得到的这段核酸序列为cytc基因,这是cytc基因在

2.6 蛇苔CytC的功能区预测

通过BlastConservedDomains对蛇苔CytC的保守区进行分析的结果显示,它属于细胞色素C

[27]

苔类植物中的首次报道。该基因全长924bp,它包括一个339bp开放阅读框,编码112个氨基酸,与拟南芥、向日葵、番茄等植物CytC在序列、

性质和

/*0表示该列的氨基酸残基完全相同;/:0表示可发生保守性替换;/.0表示可发生半保守性替换;/o0表示乙酰化修饰位点;/-0表示血红

素和铁原子的作用位点;/+0表示三甲基赖氨酸修饰位点

/*0meansthattheresiduesinthatcolumnareidenticalinallsequencesinthealignment;/:0meansthatconservedsubstitutionshavebeenobserved;/.0meansthatsem-iconservedsubstitutionsareobserved./o0meansthesitemodifiedacetylalanine;/-0meanstheinteractivesiteswithhemeandiron

ion;/+0meansthemodifiedsitesoftrimethyllysine(exceptthesitesinZeamays)

图6 蛇苔CytC与其他植物的多序列比对

Fig.6 ThemultiplesequencealignmentofCytCinConocephalumconicum(L.)Dum.andothers

436武汉植物学研究 第27卷

571-

功能结构等有很高的同源性。对该基因的分析和预测有利于对蛇苔CytC的功能和作用机制的研究,如构建功能突变体等,进而促使我们对蛇苔乃至苔类植物整个电子传递系统的深入了解,最终揭示这一古老陆生植物电子传递的机制,为研究其他植物的电子传递或整个陆生植物在电子传递进化方面奠定基础。参考文献:

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/exti.html