His标签蛋白包涵体的变复性及其纯化

His标签蛋白纯化步骤

若目的蛋白在上清表达，则使用试剂盒buffer（Novagen His?Bind Purification Kit, 70239）；若为包涵体，则需自配buffer。 （1）试剂准备 ① 12.5mL 1×charge buffer （1.6mL原液+10.9mLSW） ② 32.5mL 1×binding buffer （4mL原液+28.5mLSW） ③ 15mL 1×wash buffer （1.9mL原液+13.1mLSW） ④ 15mL 1×Elute buffer (3.8mL原液+11.2mLSW) （2）装柱

①盖上下盖，轻轻混匀His-bind Resin（若柱子不是首次使用，只需把已再生的柱床小心重悬，同样过夜沉降即可）。

②转移4mLHis-bind Resin至柱中，沿管壁流下，一次性加足，否则胶面会形成断面，影响吸附效果。

③用封口膜封住上口，置4℃冰箱，沉降过夜。 （3）过柱前准备（大约1h）

①使胶床上液依重力自动流下。

②待留至床顶时，依次加入以下溶液（用滴管沿管壁小心加入，且要一次性加足） a.7.5mL无菌SW b.12.5mL 1×charge buffer c.7.5mL 1×binding buffer 注：各步骤间连接要流畅，勿使胶床干燥 （4）上样过程

上样时同前一样，要小心贴壁加入，可一次性加满柱子（会使样品流有较大压力），随时可补加样品，使柱子保持满的状态。 （5）洗脱

依次加入：①25mL 1×binding buffer ②15mL 1×wash buffer ③15mL 1×Elute buffer 收集前8管（首先塞上下面的塞子，室温放置20min，再收集） 跑PAGE胶，进行蛋白浓度测定。 （6）柱再生

①1×strip buffer配制 7.5mL 1×strip buffer：1.9mL原液+5.6mLSW

②柱子纯化完后，加入7.5mL 1×strip buffer，洗涤至液面稍高于床顶，用塞子封住下口，直立放置4℃过夜 ③次日依次加入：

5mL 6M盐酸胍0.2N乙酸（57.3g盐酸胍+1.2mL冰乙酸+SW→100mL） 5mL SW

2.5mL 2%SDS

2.5mL 25%无水乙醇 2.5mL 50%无水乙醇 2.5mL 75%无水乙醇 12.5mL 100%无水乙醇 2.5mL 75%无水乙醇 2.5mL 50%无水乙醇 2.5mL 25%无水乙醇 2.5mL SW

12.5mL 100mM EDTA pH8.0 (1.861gEDTA+50mL SW调pH8.0) 7.5 mL SW

7.5 mL20%无水乙醇（加满细柱部分） 4℃保存柱子

若His标签蛋白为包涵体，则需先进行变复性，步骤如下： ① 收集菌体（离心，8800rpm，15min），弃上清 ② PBS洗3遍 ③ 40mL（若为400mL菌液） 1×binding buffer（非变性）重悬菌体，超声波裂解至菌液

变澄清（中途可离心收集沉淀，再次重悬，裂解，以释放更多的杂蛋白）。 ④ 离心，8800rpm，15min，弃上清，目的蛋白存于沉淀中，30mL（若为400mL菌液） 1

×binding buffer（变性）重悬。 ⑤ 冰上孵育1h（或过夜），以便完全溶解蛋白，离心15000rpm，30min，以除去不可溶物

质→0.45μm滤膜过滤上清后再过His纯化柱。

8×binding buffer（40mM咪唑，4M NaCl，160mM Tris-HCl pH7.9） 咪唑（68.08g/mL）0.272g NaCl（58.45g/mL）23.37g Tris（121.14g/mL）1.93g SW定容至100mL，调pH7.9

1×binding buffer（100mL） 8×binding buffer 12.5mL SW 87.5mL

含6M尿素的1×binding buffer 8×binding buffer 12.5mL 尿素 36.036g

SW定容至100mL，调pH7.9

变性的1×wash buffer（6M尿素，20mM咪唑，20mM Tris，0.5M NaCl） 尿素 7.2g NaCl 0.5845g 咪唑0.0272g Tris 0.04845g

SW定容至20mL，调pH7.9

变性的1×Elute buffer（1M咪唑，6M尿素，0.5M NaCl，20mM Tris） 尿素 7.2g NaCl 0.5845g 咪唑1.36g Tris 0.04845g

SW定容至20mL，调pH7.9

若目的蛋白在上清表达，只需PBS洗三遍，PBS重悬，超声波裂解至澄清，离心8800rpm，15min，上清即为样品。

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