谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析

以谷子(Setaria italica)为材料,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物,用5'RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序,

植物学通报（6）：A""A，:;6!"[6!>

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####################################################!"!!!!"研究论文!

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摘要

关键词

#

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"谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析!李园莉!江元清!赵武玲"阎隆飞北京!"""#$）（中国农业大学生物学院，植物生理学与生物化学国家重点实验室以谷子（!"#$%&$&#$’&($）为材料，提取总%&’。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物，用(’%’)*方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白+,&’作探针进行的-./01234杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到5载体后进行测序，序列分析结果表明：谷子肌动蛋白基因的编码区长!!6!个核苷酸，编码了677个氨基酸；所得序列（命名为89’+）与:24;<4=中注册的肌动蛋白基因序列的相似性均在>"?以上，与其它肌动蛋白氨基酸序列的相似性达@#?以上。根据高等植物肌动蛋白序列相似性重建了进化树，表明谷子肌动蛋白与水稻肌动蛋白异型体%’+A和%’+6之间的亲缘关系最为密切，在进化过程中分化时间最为接近。分子进化谷子，肌动蛋白基因，快速扩增+,&’末端，!"#$%$&’$()*+,*$-*.$’"/0%0#1.-2%$3*$*14#56%""*2（!"#$%&$&#$’&($）B9C/<4DBEF9’&:C/<4DGE4HIJ’KL/DBE4HC*&B/4HDM2E（)*’’"+"*,-&*’*+&($’!(&".("/，)0&.$1+%&(2’#2%$’3.&4"%/&#5；!#$#"6"57$8*%$#*%5*,9’$.#905/&*’*+5:-&*(0";&/#%5，;2ENE4H!"""#$）.7024’-25.0<O%&’P<QEQ.O<02RS3.TTEOO20（!"#$%&$&#$’&($;2</UV）Q22ROE4HQV,2H2423<02W3ET23Q.S<+0E4Q’+.RE4H32HE.4P232R2QEH42R<4R(’%’)*02+14EX/2P<Q2TWO.Y2R0..Z0<E4012<+0E4+,&’.S!"#$%&$&#$’&($V-./01234ZO.00E4H<4<OYQEQPE01W3.Z2S3.TW2<024R3EO<+0E4H242+.RDE4H32HE.4Q1.PQ01<001232EQ<1EH1QETEO<3E0YZ20P224012<+0E4.S!"#$%&$&#$’&($<4RW2<V512W/D0<0EU2<+0E4H242P<QQ2X/24+2R<S023+O.4E4HE40.W:*8D5U2+0.3<4RQ2X/24+E4H32Q/O032U2<O2R01<0E0+.40<E4Q<4.W2432<RE4HS3<T2.S!!6!ZW，24+.RE4H<W3.02E4.S677<TE4.<+ERQV-ETEO<3E0Y+.TW<3EQ.4PE01.0123<+0E4H242Q2X/24+2QE4012:24;<4=Q1.PQ01<0E0Q1<32Q.U23>"?4/D+O2.0ER2Q2X/24+2QETEO<3E0Y<4R.U23@#?<TE4.<+ERQ2X/24+2QETEO<3E0YPE01.0123<+0E4QV512W1YO.H2420E+032232+.4Q03/+02R.4012Z<Q2.S<TE4.<+ERQ2X/24+2QQ/HH2Q0Q01<001232O<0E.4Q1EW（%’+A，%’+6）EQT.Q0E40ET<02<4R012YTEH101<U2REU23H2R<0Z20P224TEOO20<+0E4<4R3E+2<+0E4Q012Q<T20ET2V8*/9#4(0!"#$%&$&#$’&($，’+0E4H242，(’%’)*，8.O2+/O<32U.O/0E.4肌动蛋白是在真核生物中普遍存在的一种古老的蛋白质，是构成细胞骨架和肌肉肌小节的主要成分，执行着重要的生理功能，如细胞分裂、细胞运动、细胞形状变化、内吞作国家自然科学基金资助（&.V6#77""(A，，本文序列在:24;<4=中的检索号为’MA@@AA>。6#76"A@"，6#@7""77）同等贡献。通讯联系人。’/01.3S.3+.332QW.4R24+2V52O："!"D>A@#A>7A。

作者简介：李园莉，女，理学硕士，现为中科院微生物研究所读博士生。江元清，男，理学硕士，现在北A@岁，A7岁，

京农业生物技术研究中心工作。赵武玲，女，副教授，主要从事植物肌动蛋白基因的克隆、差异表达以及调控方面的研究。

收稿日期：接受日期：责任编辑：刘晖A""!D"7D"6A""AD"6D"@

以谷子(Setaria italica)为材料,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物,用5'RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序,

Z期李园莉等：谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析Z--用、胞吐作用以及多种细胞运动如顶端生长、细胞器运动、胞质环流、花粉管生长等（!"#$#%&’(#)(*!")%%+,，-../；!$)’0#%)(*!1"&’,)，-.23）。高等动植物中，肌动蛋白都是由

。这些基因高度相似，通过多轮复制由一个基因祖先进化而来多基因编码（4’%$#&，-.2-）

（5)(0#)(*6%7*"+88#，-...）。

不同生物肌动蛋白具有高度保守性，（%#9&)1#8#($(7:6#%&#%等建立了由核苷酸替代

简称%(;）而引起的氨基酸替代（)8’(+)1’*;7<;$’$7$’+(;）与保守蛋白（如1&#+$’*#;7<;$’$7$’+(;，

珠蛋白、胰岛素、肌动蛋白等）基因进化年代（以百万年计，的线性关系，8’&&’+(=#)%;，5>）

其中对动物、菌类和植物肌动蛋白的估计为-?%(;@-AA5>（BCA5>），即这些生物肌动蛋白的氨基酸残基变化-?约需-AA百万年，暗示着肌动蛋白基因在进化过程中承受着较大的选择压力，在生物体内执行着重要的生物学功能（6#%&#%!"#$，-.2A）。

谷子是起源于我国或东亚的一种禾本科D/作物，营养价值高，多年来人们对其遗传育种方面作了大量工作（李润植等，。我们选取谷子作为材料，对其肌动蛋白基因的-..3）

结构及其功能进行分析，并结合前人的工作，为利用肌动蛋白研究真核生物特别是禾本科植物的进化提供一些资料。

!材料和方法

!"!材料与试剂

谷子（%!"#&’#’"#$’(#），又称粟（谷），采用中品六号，在温室播种，选取培养一周的幼苗提取总EFG。克隆载体为9HI5:CJK（L），参照M)*N#<等（-..O）的方法自制P载体。受体

。各种限制性内切酶为华美公司和6%+8#0)产品，菌为)*(+$’QMCQFG@,’-.#:)(+E!"

R、P/QFG连接酶购自华美公司，P)SQFG聚合酶为T’+;$)%产品，C’EGDIU’$购自VPR，W’X:)%*P55’(’9%#9;QFG67%’K’1)$’+(;=;$#8为6%+8#0)产品，QRHQFGV)<#&’(0)(*Q#$#1$’+(U’$为T+#"%’(0#%5)(("#’8产品，其它试剂均为进口或国产分析纯。

!"#寡聚核苷酸引物

根据文献（M’0"$+,#%)(*5#)0"#%，-.2O）设计引物，由大连P)U)E)公司合成。正向引物6-（YZ!L[A）为C’（GDP）（DGH）（GP）（GH）（HG）（PG）（GH）GDDGPHHDHHGHHHGPZ’；反向引物6[（L---Z!L--Z/）为C’（PD）（PH）（HD）。PPGHGGHDGPPDDHPHGDZ’

!"$总%&’的提取

采用W)*;,+%$"等（-.22）的方法，只是最后改用3C?乙醇洗涤EFG沉淀两次、吸干，溶于-CVQI6D处理的无菌水中。$

!"(%)*+,%扩增

参照C’EGDI说明书进行。

补水至-C\C$!-(-!反转录[\C98+&引物6[，C$0总EFG，V，3A]-A8’(后冰浴-

8’(。加入以下组分：[\C$V-A^6DE缓冲液，[\C$V[C88+&@V50D&[，-$V-A88+&@V

加入-$*FP6;，[\C$VA\-8+&@VQPP。/[]温育-8’(，V!79#%;1%’9$P5%反转录酶，/[]

温育CA8’(，3A]-C8’(终止反应。加-$VEF);#M@EF);#G于Z3]保温ZA8’(降解EFG。

!-(-#

!-(-$./&’的纯化与加尾按说明书进行。在CA$+,%6DE仪为M=<)’*公司产品，V反应体系中依次加入C$V-A^6DE

以谷子(Setaria italica)为材料,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物,用5'RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序,

F&3植物学通报&@卷!"##$%，&’(!)&(**+,-)./012，3’45*+,引物1&，3’45*+,引物13，4!)67/8，390:;7/8聚合酶，用..<3=补充至4(!)。1>?参数：@ABA*CD；@AB&*CD，A4B&*CD，E3B&

用&’3G琼脂糖凝胶电泳检测。*CD，F4个循环后E3B延伸&(*CD，

!"#$%&产物的克隆与序列分析

!’#’!（1H86&，I$DJ:DK/+’$%&产物杂交鉴定将本室豌豆卷须肌动蛋白基因克隆

用!"#"酶切后回收肌动蛋白67/8片段，用地高辛进行标记后作为探针，与所扩LMEMMM）

目的片段的连接、转化、筛选及鉴定参照N:*!%++K等（&@Q@）的方法进行。增片段进行N+"OP$%D杂交。!’#’(

由上海基康公司用8JR1?RNSFEE!’#’)序列测定与进化分析用试剂盒纯化质粒，

序列的拼接、分析采用7/8NRN软件；在/>JR（POO5：7/8测序仪测序，--TTT’D6!C’D,*’DCP’

用J,:2O3’&5%+U%:*（8,O26P",$#%&，&@@E）与I$DJ:DK中已报道的序列进行相似U+V-J)8N0）

性比较。用J)8N0软件在I$DJ:DK中收集已发表的植物肌动蛋白序列，采用7/8N08?软件包（7/8N08?RD6’，&@@M）中的S$U8,CUD进行多序列对齐；再将其输入>,"2O:,W&’Q软件（0P+*52+D$#%&，&@@A）进行多重比较，并用邻位相连法（/$CUP!+%XY+CDCDU，/XZ法）（N:CO+"

绘制进化树，用自展法（J++O2O%:5CDU）对进化树进行评估；最后用0%$$[C$T&’:D./$C，&@QE）

输出图形化的进化树。4软件观看、

(实验结果

("!总&*+的提取

电泳检测结果如图&所示：紫外测定其=73M(-=73Q(\&’@&(，3QN、&QN%?/8条带完整，

表明提取总?/8完整性及纯度均良好。

("(肌动蛋白编码区/0*+的&12$%&扩增结果

4’?8>H方法特点是反转录时使用反向特异性引物，1>?时

使用特异性引物，两步之间加入了67/8纯化步骤以利扩增的进

行。由于本实验所用引物简并性强，加大了扩增的难度，经多次

试验扩增出一长约&’&K!的带，结果如图3所示。

电泳结果（泳道3）表明：通过4’?8>H方法扩增谷子肌动蛋

白基因有明显的主带，大小约为&’&K!，估计可能是肌动蛋白基

因，有待进一步鉴定。

(")3456789:杂交鉴定&12$%&扩增产物图!总?/8甲醛变性电将本室的豌豆卷须肌动蛋白R类异型体基因作为探针与?0X泳

结果如图F所示：结果显示二者同源性很高，进一,-.’!H,$6O%+5P+%$2C2+#1>?产物杂交，O+O:,?/8OP%+"UP:U:%+2$U$,步说明所扩增的片段极可能是肌动蛋白基因。6+DO:CDCDU#+%*:,.$P].$’&，

&(!UO+O:,?/8；3，4!UO+X(";&12$%&产物的克隆与阳性克隆的筛选

将?0X1>?产物不经纯化直接与0载体进行连接，采用蓝、O:,?/8

白斑方法筛选出阳性克隆。结果如图3所示，泳道A白斑质粒明显比蓝斑质粒及空载体的迁移率小，说明它可能插入了目的片段。

("#$%&及酶切鉴定

以筛选出的阳性克隆质粒为模板，用前述引物进行1>?扩增，结果（图A泳道3）表明

以谷子(Setaria italica)为材料,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物,用5'RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序,

"期李园莉等：谷子肌动蛋白基因的克隆及序列分析">"此克隆插入有目的基因片段；利用载体上的多克隆位点进行双酶切分析，结果如图!（泳道"、。!）

表明用!"##$$#%#双切时目的片段被切成约%&&和"&&’(的条带，从而推测序列内含有!"##或$#%#

位点。

图!)*+,-)扩增结果及阳性克隆的筛选

"#$%!)*+,-)./012345607.//5859:;(:0838</

72:5/0=>，?@A$&’()"+*%+)#B4.C/.0；D，!)*+,-)(.:6173；"，’21/72:5/；!，EF83/72:5/；

G，(HIB+GJ;（K）

(240L86图&)*+,-)产物的M:13F+/.5杂交鉴定"#$%&M:13F/.5’2:338594542+N080:;)*+,-)(.:6173=-O，

?@A$&’()"+*%+)#；>，!

)*+,-)(.:6173!’(测序结果

由图G可见，我们获得了谷子肌动蛋

白基因的编码区序列，它长度为>>">个核

苷酸，编码"QQ个氨基酸。

&序列分析与讨论

&’*谷子肌动蛋白7?@A序列酶切位点分

析表明在D%%’(位置处存在一$#%#酶切

位点（G’），印证了此前（D=G）的HAH-*-"’

推测。

&’!相似性比较

自I2P8594等（>RQ"）解译出第一个肌动

蛋白的氨基酸序列后，目前在H/5S45C中图)阳性克隆的,-)及酶切鉴定注册的肌动蛋白基因或片段达到D&RDT个。"#$%),-)456/5PNL/689/038:5:;(:0838</72:5/(240+将本文所得序列（B#A7）与H/5S45C中的其L86

>=!?@A$&’()"+*%+)#B4.C/.0；D=,-):;(:0838</它生物的肌动蛋白基因序列进行了相似性72:5/；"=6:1’2/689/03/6’N!"##$$#%#；!=6:1’2/68+

比较，发现其相似性均在T&U以上。在禾9/03/6’N,%+#$,+-#；G=,1.8;8/6(:0838</(240L86本科内，（AVD"!!&&，的核苷酸序列的相似性为R&U；与高粱（WQR"Q%）B#A7与大麦>&G&53）

的相似性为%!U，与水稻（W>TD%&）的相似性为%"U。

以谷子(Setaria italica)为材料,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物,用5'RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序,

卷

图!谷子肌动蛋白基因的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列

以谷子(Setaria italica)为材料,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物,用5'RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序,

C:H

密相关的。

子肌动蛋白与其它"!种植物肌动蛋白的分子进化树

以谷子(Setaria italica)为材料,提取总RNA。根据植物肌动蛋白基因编码区的两端的保守序列设计了简并引物,用5'RACE方法扩增出了谷子肌动蛋白基因编码区序列。以豌豆肌动蛋白cDNA作探针进行的Southern杂交分析表明扩增出了目的基因。将所获得的片段克隆到T载体后进行测序,

%3=植物学通报34卷无根进化树。

由上图可见，高等植物肌动蛋白进化树至少可分为三个分化群。其中，谷子肌动蛋白与水稻肌动蛋白异型体!"#$和!"#%之间的亲缘关系最为密切，且与拟南芥肌动蛋白

暗示植物肌动蛋白各异型体""#&以及锦葵肌动蛋白’("#形成一个独立的次级分化群，

在进化过程沿不同方向、以不同的速率分化，以适应不同亚细胞活动的需要，这也是肌动蛋白在生命现象中的重要作用的反应。此外，我们还可以看出，单子叶植物与双子叶植物的肌动蛋白在进化中相互交叉，表明被子植物肌动蛋白基因家族起源于一个远早于单、双子叶植物分化前的共同祖先。

（$111）研究了影响蛋白质进化的主要因素后认为蛋白质进化速率主要)*+,-((.和/0

取决于功能上的需要或选择压力，而较少受氨基酸组成的影响。20-和/0（3445）对影响蛋白质进化的氨基酸十种性质的研究表明，遗传密码的进化趋向于以最大限度地降低氨基酸的极性。我们比较了上述各物种肌动蛋白基因所编码的氨基酸变化的位置和分布之后（图略），发现尽管肌动蛋白之间有大量的更换替代，但其序列的亲水—疏水特性有强烈的相似性，反映出保持蛋白质三级结构上具有强烈的抗选择压力（60789*:.,-;<’.-78.,，

，为组装成肌动蛋白纤丝所必需。345=）

所以，从分子水平来研究生物进化看，肌动蛋白无疑是一个非常好的工具，它可以反映出生物进化的先后顺序，使我们能够了解生物进化的真正进程。

本工作得到了谷子肌动蛋白基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列，既有助于了解谷子的起源和进化，也丰富了谷子细胞骨架方面的研究资料，进一步的工作尚在进行中。

参考文献

李润植>赵志立>毛雪编著>344&?谷子遗传育种原理?北京@气象出版社

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B-IP,**ZF>C,09(#8UC>’-;0-90()著Q金冬雁>黎孟枫等译R>344$?分子克隆实验指南Q第二版R>北京@科学出版社>T$

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/eu7j.html