伪狂犬病病毒上海株(PRV-SH)gE-gIGFP+缺失株的构建

在构建了含伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶??Bam??HI和??Bst??pI缺失掉gE基因5'端363bp,同时把绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒插入到缺失部分,并在下游引入一个多克隆位点

!"卷#期

$%%"年$月微生物学报!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$&’()!"*+,-./-01’)#$%%"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!伪狂犬病病毒上海株（!"#$%&）’()*’+$*,-!.缺失株的构建

姜焱#侯玉峰$陈溥言#

（#南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点实验室

（$南京出入境检验检疫局南京$#%%%#）南京$#%%2>）

摘要：在构建了含伪狂犬病病毒（?@+.A’-/,7+@&7-.@，上海株:C基因和:5基因克隆鉴定?B&）

的基础上，采用酶切的方法构建了载体D:5C。然后用限制性内切酶!"#EC和!$%DC缺失掉:5基因>’端"F",D，同时把绿色荧光蛋白（G*?）基因表达盒插入到缺失部分，并在下游引入一个多克隆位点，构建了缺失转移载体D:5C4G*?。用HIJK?转染试剂盒将D:5C4G*?转染了感染

待出现O%P病变后收获病毒，并以蚀斑法得到纯化的缺失了:5Q:C?B&4LE的MEN4$#细胞，

重组病毒株。小鼠试验证实了缺失株的毒力有所下降。

关键词：伪狂犬病病毒，转移载体质粒，绿色荧光蛋白（G*?）表达盒:5RQ:CRQG*?S缺失株，

中图分类号：T2""文献标识码：K文章编号：%%%#4F$%2（$%%"）%#4%%#>4%F

伪狂犬病病毒（?@+.A’-/,7+@&7-.@，是引起多种家畜和野生动物以发热、流产和死?B&）

#］亡、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的一种疱疹病毒［。基因组为线状双股核酸长度约H1K，

#>%U,。猪是该病毒的主要宿主及传染来源。伪狂犬病对养猪业已造成了巨大的经济损［$］失。各种灭活苗及弱毒疫苗的使用在对该病的防治中起到积极作用，但随着对该病研究的深入，发现利用常规疫苗对该病根除、持续感染的防治是不成功的。随着分子生物学的发展，人们已能对一些病原的基因进行改造，使其失去致病作用。国内外对?B&分子生物学方面的研究越来越深入，已确定了主要毒力基因。其中，:5是一个重要的毒力基［"］因，而:C也与毒力有关。它们与?B&在神经系统中的侵袭和扩散作用密切相关。据

［］只要缺失这V/=’,@等!报道，:5决定毒力的部分是第#$>W#$F位的缬氨酸和半胱氨酸，

两个氨基酸就能降低病毒的嗜神经性，而不影响免疫原性。同时:C糖蛋白对诱导完全保

［>］护是必须的。本研究在?B&4LE的:5和:C基因之间缺失>#%,D并插入了带XY&启动

构建成转移载体质粒，并以蚀斑法得到纯化的缺失了:5Q:C子和增强子的G*?报告基因，

重组病毒株-?B&4LE。由于在G*?的下游引入一个多克隆位点，这为将来构建多价苗打下基础。

/

/0/材料和方法病毒株、细胞株、载体

?B&4LE和MEN4$#细胞由本室保存。D5G*?4X#由美国陈新斌博士赠送，DZX:C和DZX:5由本人构建。大肠杆菌HE>!

由本室保存。

作者简介：姜焱（#23$4），女（汉族），江苏泗阳人，博士，主要从事动物病毒学和分子免疫学的研究。现工作单位：江苏省出入境检验检疫局动检实验室，南京白下路#号（$#%%%#）。546/7(：87/9:0/9#%$2;0/<’’)=’6)=9

收稿日期：修回日期：$%%$4%"4%2，$%%$4%34"%

在构建了含伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶??Bam??HI和??Bst??pI缺失掉gE基因5'端363bp,同时把绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒插入到缺失部分,并在下游引入一个多克隆位点

卷

在构建了含伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶??Bam??HI和??Bst??pI缺失掉gE基因5'端363bp,同时把绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒插入到缺失部分,并在下游引入一个多克隆位点

.期姜焱等：伪狂犬病病毒上海株（+$6,N!）&’R?&",?)*+K缺失株的构建.F用!"#!"、$%&#"""和’()$"进行酶切鉴定。阳性克隆命名为%&’"。

将(用*+,"、试剂盒回收约01234含-56立即早期&的%’)*+,-.质粒，-."/"消化，!

以酚?氯仿抽启动子的)*+片段。将回收的)*+以789:;<大片段及#=>+混合补平后，

提，加入.?.2体积的@A;8?/的=BCD（%!(10）和0倍体积的无水乙醇沉淀E=C，F2G乙醇洗一次，再以(（%!H12）溶解，即为)*+基因表达盒片段。/>’!

用!"#!"和!/0%"消化%&’"，用试剂盒回收(34的目的片段，用789:;<酶补平。将

加入C>+和>IE=C连接酶，%&’"酶切回收补平的片段与回收补平的)*+片段混合，IJ

过夜后，转化大肠杆菌E!(涂布CA%K平板，挑选白色菌落，@FJ摇振培"感受态细胞，

［L］提取质粒，重组质粒命名为%&’",)*+。养，按文献

!"#$%&’()*’+)缺失重组病毒的构建及筛选

于@(AA的塑料平皿中培养M!7,0.细胞成单层后，接种+$6,N!株（.2@>-"E(2），@FJ培养.O0P后，按EQ>C+试剂盒说明书进行转染，然后放于@FJ(G-Q0培养至细胞出现H2G以上的病变，收获病毒，于RF2JO@FJ反复冻融@次，低速离心去细胞碎片，上清中即可能含重组病毒。将转染获得的病毒上清液作.S.2稀释，取(O.2/接种培养于直!

径L2AA平皿内的M!7,0.细胞，待出现单个分散的病毒蚀斑时，在荧光显微镜下观察，将

冻融@有荧光的蚀斑标记好，覆盖上琼脂后，用吸管将其吸出，置于21(A/的维持液中，

次，在L2AA平皿中重复进行这一步骤0次后，于TL孔板稀释纯化@次，即可得到稳定和纯化的重组病毒。

!",$%&’()*’+)缺失重组病毒的生物学特性

比较两者所形成+$6&’R?&"R缺失重组病毒株与+$6,N!株分别接种M!7,0.细胞，

的空斑大小以及测定两者的>-"E(2。

小鼠试验!"-

（约012U.2F+*V）腹部皮下注射小鼠（"-$小鼠，为+$6用重组病毒细胞培养物210A/

血清阴性），分为0组，一组为对照组，（012U.2(+*V）剂量的+$6,N!攻毒，0周后用05/E

计算其保护率。

.

."!结果/’(+载体的构建

用!"#!"K$%&#"""消化%V-&’，回收&’基因，与用同样酶切的&"进行连接，转化，挑取白色菌落培养提取质粒，经’()$"、（图0），表明&’基因已克!"#!"和$%&#"""酶切鉴定

隆入%V-&"载体中。

.".含0($基因缺失载体的构建

回收的)*+基因表达盒经789:;<酶补平与%&’"经!/0%"和!"#"酶切回收的大片段用789:;<酶补平进行连接，转化，涂布CA%K平板，挑选白色菌落培养，提取质粒，经$%&,

（图@），表明)*+基因表达盒已插入到%&’"载体中，且是反向插入#"""和’()$"酶切鉴定

的，重组质粒命名为%&’",)*+。

."1重组病毒筛选

按EQ>C+的说明书将%&’",)*+转染感染了+$6,N!株的M!7,0.单层细胞，待出现

在构建了含伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶??Bam??HI和??Bst??pI缺失掉gE基因5'端363bp,同时把绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒插入到缺失部分,并在下游引入一个多克隆位点

)!微生物学报*E卷

以绿色荧光蛋白为!"#以上的病变时收获病毒。将收获的病毒稀释后接种$%&’()细胞，

标志，利用荧光显微镜通过蚀斑法得到纯化重组病毒（图*）

。

图!

+,-.("#$%酶切鉴定结果+,-.E图&"#$%’()*酶切鉴定结果/01213456789-:;<1=672>:?@?5A3,3/01213456789-:;’K+L<1=672>:?@?5A3,3

(.9-:;B’()%;C$%&D;;;；).9-:;B!"#>;C$%&D;;;；

E.9-:;B!"#>;C’()%;；*.9-:;B!"#>;；F.G?2H12IJ’)F

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""".

图+

+,-.**,-#$./#%.缺失重组病毒在012’!3细胞上的荧光

（)"R)"）；Q.+547213=1@=178L>O-:PB-;P362?,@7@$%&’()/01213456783=211@,@-60121=7MN,@?@6L>O-:PB-;PNA8547213=1@=17@$%&’()=155

（)"R)"）$.$.SL:,@81=61DNAL>O-:PB-;P362?,@7@$%&’().

!4+重组病毒的生物学特性

L>O’T%-:PB-;PBK+LC缺失株和L>O’T%在$%&’()细胞上两者都具有较好的增殖能力，它们在>&细胞上的/S;IF"均可达)"PUBMJ。L>O’T%株/S;IF"为)"PUV)BMJ，L>O’T%

说明-:PB-;P缺失后并不影响病毒在细胞上的-:PB-;PBK+LC缺失株/S;IF"为)"PWVXBMJ，

增殖，这与-:B-;基因为L>O的非必需基因是一致的（图F）。同时对缺失株和野毒株在

结果发现两者无明显差别。$%&’()细胞上形成的空斑大小进行了比较，

表3

/?N51)

K2749

L>O’T%-:B-;BK+LC

S7@6275PP攻击保护试验（用*,-’51株进行攻毒）[7.78D1?6013(WT42<,<723*"G726?5,6AB#EE)""L2761=6,7@78M,=1?-?,@36=0?551@-1Y,60L>O’T%=7@6?,@,@-(GJIZ4?@6,6A78M,=1WW

在构建了含伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶??Bam??HI和??Bst??pI缺失掉gE基因5'端363bp,同时把绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒插入到缺失部分,并在下游引入一个多克隆位点

缺失株的构建

进

株的

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在构建了含伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶??Bam??HI和??Bst??pI缺失掉gE基因5'端363bp,同时把绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒插入到缺失部分,并在下游引入一个多克隆位点

3\微生物学报XO

卷感染后将不产生针对!"缺失的部分抗体，因此能通过血清学方法将缺失毒株与野毒感染猪区别开来。本研究中，构建的#$%&’(株!")*!+)*,-#.缺失株，不仅降低了毒力，也可利用血清学方法将缺失毒株免疫猪与野毒感染猪相区别，为淘汰野毒感染猪，建立无#$感染的猪群，并最终控制和消灭#$提供了有用的工具。

参

［/］殷考文献震，刘景华0动物病毒学0第二版0北京：科学出版社，/1120

［3］45665785965:;<04=85>?8@:A9=8=!B=CDE5?F=:@A95E（G?H5EIJB’EF9E5@E5）K9:?E0!"#$%##&’"()*+,"-*"(%’./+01*2，/11/，

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/11^0

［2］%@7]9H94，Y57EK==:6,，S8?BK5:"U，/03(0Q9K5@6657?@65F#E5?F=:@A95EK9:?E5_D:5EE97!57K58=D!8B>=D:=6597"=CR=!

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