异丙肾上腺素致大鼠心肌肥厚时心肌细胞核Ca2转运

异丙肾上腺素致大鼠心肌肥厚时心肌细胞核!"#$转运

王培勇!!，刘健"，许蜀闽!，唐朝枢#

（!$第三军医大学病理生理学教研室，重庆%#&&#’；"$第三军医大学新桥医院心内科，重庆%&&&#(；

#$北京大学第一临床医学院心血管病研究所，北京!&&&#)）

摘要：目的观察异丙肾上腺素（*+,）致大鼠心肌肥

厚模型心肌细胞核%)-."/摄取、钙释放通道肌醇!，

%，)0三磷酸（*1#）受体（*1#2）和34.5,6758受体（242）

的动力学变化，以探讨细胞核-."/的转运是否参与

心肌肥厚发生。方法*+,（+9"&、!&和):;?<;=!剂

量递减#6，#:;?<;=!维持(6）制备大鼠心肌肥厚

模型，用差速离心和蔗糖密度梯度离心提纯心肌细

胞核，用%)-."/同位素法测定细胞核钙摄取，用［#>］

标记配体分析心肌细胞核*1

#

2和242的动力学特

点。结果与对照组相比，*+,可导致大鼠心肌显著

肥大，伴有显著心肌纤维化；心肌细胞核膜*1

#

2与

其配体的最大结合容量（?

:.@

）减少"#$%A（!B

&$&)），解离常数（"6）无明显变化（!C&$&)）；

细胞核242的?

:.@增加)D$D A（!B&$&!），"

6

无

明显变化（!C&$&)）；%)-."/摄取显著低于对照组（!B&$&!），最大摄取与对照组相比降低E"A（!B &$&!），达半数最大摄取时［-."/］无显著变化。结论*+,导致大鼠心肌肥厚纤维化发生过程中，心肌细胞核%)-."/摄取能力降低，核上242数目上调，而*1#2数目下调，受体亲和力无变化，提示心肌细胞核钙调节系统参与心肌肥厚的发生过程。

关键词：心肌肥厚；细胞核；受体，肌醇!，%，)0三磷酸；受体，34.5,6758；钙；异丙肾上腺素

中图分类号：2#E#

文献标识码：F

收稿日期："&&!0&D0"D接受日期："&&!0!"0&#

基金项目：国家自然科学基金资助项目（#D’(&#%(）；国家自然科学基金资助项目（#D’(&#D"）

作者简介：王培勇（!DEE=），男，山东省诸城市人，理学博士，副教授，主要从事心血管病理生理学教学和科研工作；刘健（!DE’=），女，山东日照市人，主治医师、讲师，医学博士；唐朝枢（!D%)=），男，重庆市人，教授、博士生导师，从事病理生理学教学和科研工作。

!联系作者G8H：（&"#）E’()"##D=’"!#，

I0:.7H：J4K.5;L:.7H$M::N$9,:$95文章编号：!&&&0#&&"（"&&"）&!0&&")0&E

关于心肌肥厚的发生机理，多年来一直是心血管疾病研究领域的热点，但是至今还没有完全阐明。-."/信号在心肌细胞的作用尤为重要，无论是超负荷还是神经体液因素导致的心肌肥厚，均涉及胞浆-."/稳态失衡［!］。近年来分子生物学研究证明，心肌缺血、心肌肥厚、心力衰竭等病理情况下，心肌细胞核功能也发生严重紊乱，但心肌肥厚时胞浆-."/紊乱与核反应异常的关系尚未阐明。最近基于肝细胞核的大量研究证据表明，细胞核上可能存在独立的-."/调节系统［"］，-."/跨核被膜转运是核-."/信号转导和核-."/调节核功能如基因转录、OPF合成等的首要环节。某些研究显示，核钙转运功能的改变具有重要的病理生理意义，如大鼠肝细胞再生时，核钙FG1酶活性增加；我们以往的研究发现，早期败血症休克大鼠肝细胞核钙转运和钙FG1酶活性均增强［#］。我们曾经报道了大鼠和家兔心肌细胞核存在钙泵（-."/0FG1.+8），能主动摄取%)-."/，其活性呈钙浓度（［-."/］）和FG1浓度（［FG1］）依赖，并被蛋白磷酸化调节［%］。推测心肌细胞核的钙调节系统在心肌肥厚的发病过程中具有重要的意义。因此本工作在异丙肾上腺素（7+,J385.H758，*+,）导致的大鼠心肌肥厚纤维化动物模型上，观察心肌细胞核%)-."/摄取和-."/释放受体〔肌醇!，%，)0三磷酸受体（75,+7M,H!，%，)0M37JQ,+JQ.M83898JM,3+，*1

#

2）和34.5,6758受体（34.5,67583898JM,3，242）〕的动力学改变，以探讨体液损伤因素引起心肌肥厚时心肌细胞核功能紊乱的环节，进一步阐明心肌肥厚发生的机理。

%材料与方法

%$%材料与试剂

R7+M.3大鼠，"，体重!&&S!)&;，由本校实验动

?

)

"

?

中国药理学与毒理学杂志"&&"年"月；%&（!）：")=#&

物中心提供，!"#、$%&’#()’*（+%）、肌醇,，-，./三磷酸

（)’#")0#1,，-，./0$)23#"23&0*，!4

5）、6748&

9

、二硫苏糖

醇（()03)#03$*)0#1，:77）、苯甲基磺酰氟（23*’%1;*03%1/ "<1=#’%1=1<#$)(*，4>?@）和标志酶测定试剂购自?)A;&公司（美国）；亮肽素（1*<2*20)’）、抑肽酶（&2$#0)’)’），胃酶抑素（2*2"0&0)’）购自>#1*B<1&$4$#C*"公司（美国）；-.D&D19（,E-F7GH?A I,D&）、!/;%#/［5J］!45（［5J］!45，,E KF4GH?;#1I,）和［L，9,（"）/5J］+%（［5J］+%，5E,-.7GH?;#1I,），购自6;*$"3&;43&$;&/ B)&G)#0*B3（美国）。其余试剂均为国产M+或6+级。

!"#异丙肾上腺素致大鼠心肌肥厚模型制备大鼠分为9组，心肌肥厚组：按+#’&等［.］方法略作修改，"B!"#，以9N、,N和.;A?OA I,?(I,剂量递减5(，再以5;A?OA I,?(I,连续K(。对照组：以生理盐水代替!"#处理。大鼠常规饲养，于停药9-3后称体重（GP），以9NQ乌拉坦（.;R?OA I,，)2）麻醉，开胸取出心脏，用-S预冷生理盐水冲洗后，剔除左右心房，称左右心室重量（TP）。心肌肥厚程度以心室重量指数（TP U GP）表示。取心尖部位作常规病理检查。其余心肌用于以下实验。

!E$心室胶原含量测定

!"#实验组和对照组心脏各V只，置烤箱脱水，称重，按P#*""’*$［V］的方法测定羟脯氨酸含量，乘以系数KE-V即为胶原含量。

!E%心肌细胞核的提纯［%］

所有操作在N W-S下进行。将大鼠心脏用.N ;R冰冷7X>液（;;#1?R I,：7$)"/JD1.N，XD19.，>AD19.，2J KE.）洗去红细胞，剪碎后加入.倍体积等渗匀浆液〔（;;#1?R I,）：蔗糖9.N，YM76,E N，:77 ,EN，4>?@,E N，和（;A?R I,）：亮肽素,，抑肽酶,，胃酶抑素6,的7X>液〕中，用内切式匀浆器低速匀浆9E.;)’（5N"Z.次），9NN目尼龙网过滤，离心（,-NN Z#，,N;)’）9次，弃上清，将沉淀加入,倍体积的含,E N;#1?R I,蔗糖/7X>液中，充分混匀加入5倍体积的9E.;#1?R I,蔗糖/7X>，混匀后超速离心（,9N NNN Z#，VN;)’），沉淀即为纯化的心肌细胞核E采用R#[$%法行蛋白质定量，二苯胺法行:86定量，用原子吸收分光光度法测定钙含量E按文献方法测定下述亚细胞成分标志酶的活性：.\/核苷酸酶（肌质膜）、葡萄糖/V/磷酸酶（肌浆网）和琥珀酸脱氢酶（线粒体）［9］。用分离纯化的心肌细胞核进行下述实验。

!"&心肌细胞核［$’］()$放射配体*受体结合分析［+］

分离纯化的细胞核用含（;;#1?R I,）7$)"/JD1 .N，Y:769EN，2J FE5的低渗液悬浮，进行［5J］!45结合反应，分别加浓度递增的［5J］!45（NE F W,.’;#1?R I,），反应体积,NN!R，加入核蛋白每管NE,;A，NS 下反应,N;)’。结合与游离的［5J］!45用离心法（.NNN Z#，.;)’）分离，沉淀洗涤后用滤纸充分吸净离心管的残留液体，加.N!R,;#1?R I,的8&]J 溶解，转至,N;R水溶性闪烁液中，用"/液体闪烁计数议测定［5J］!45放射活性。非特异结合通过加,N !;#1?R I,的!45测定。重复-次实验，每次各组细胞核取自.只大鼠。用4$)^;5E N软件（M$&232&(?#=0/ [&$*，美国）作饱和曲线拟合分析，计算出解离常数（$

(

）和最大结合量（G

;&_

）。采用单点结合饱和分

析，%‘G

;&_

Z&’（$(a&）。

!",心肌细胞核［$’］-./012304放射配体*受体结合分析［5，6］

取制备的纯化细胞核,NN!A，加入缓冲液〔（;;#1?R I,）：JY4Y?.N，2J KE-，XD1,NNN，674 ,EN，YM76,EN，D&D19NE L.5，4>?@NE,，苯甲脒NE9和（;A?R I,）：亮肽素,，抑肽酶,，胃酶抑素6,，G?6 ,NN〕，终反应体积为,NN!R，［5J］+%浓度为NE.W-F ’;#1?R I,，非特异结合加非标记+%5N!;#1?R I,。根据D3$)"4&00#’的软件P)’>6bD（3002：U U[[[E"0&’/ =#$(E*()11)2#$*滤器上经双层玻璃纤维膜抽滤，以.;R冰冷的缓冲液冲洗-次，滤膜干燥后加入闪烁液，在"/液体闪烁计数仪上测［5J］+%放射活性。每份样品均作双管，非特异性结合为总结合的.Q W,NQ。重复.次实验，每次各组细胞核取自.只大鼠。由.次实验的均值作

饱和曲线拟合分析得到$

(

和G

;&_

值（分析方法同上）。

!"+心肌细胞核%&7/#8转运测定［!9］

参照文献的方法，并作改进。反应液为（;;#1?R I,）：XD1,9.EN，JY4Y?9NEN，>AD19.E N，2J KE N，6749EN，YM76NE,，-.D&9a,FE.OGH，终体积NE. ;R。反应液中的游离［D&9a］为NE,W5E9!;#1?R I,，

通过YM76与D&D1

9

的缓冲体系控制，根据G&$0)=)［,,］的多元缓冲对计算方法确定所加入的总钙量，然后

?

V

9

?()*"+,+-./0"12.34)10516.2.#71"89.:*6.2.#79NN9@*C；!,（,）

用!"#$%&（’(!)*+

?,-’）荧光测定法核对。./0预温1)23后通过加入(4&)5蛋白质的核，

始动反应，温育一定时间后加入’),(4&)*+?,-’657+&终止反

应，在62++28*#9抽滤器上以(4:1!)微孔滤膜抽滤，用(4’)*+?,-’657+&冲洗.次。滤膜干燥后加入闪烁液，在"%液闪计数议上测定:17$&;放射强度。同时做非特异摄入管，操作同上，但反应液中不含<=>。核:17$&;转运?总摄入-非特异摄入。重复@次实验，每次各组细胞核取自1只大鼠。!4"

统计学方法

实验数据以!!A "表示，两组比较采用B9+CDE #检验，多组间比较采用方差分析，组间$检验。

#结果

#$!异丙肾上腺素致大鼠心肌肥厚的特征和分离

心肌细胞核特征

实验组大鼠FD GF*’(H 内，死亡率为1I ::。存活大鼠心脏发生明显肥大，JB I KB 较对照组增加:’L 〔（:4M:A (4:&）%"（.4:.A (4&:）)5

?5-’湿重，&N (4(’〕。取心尖部位经石蜡切片，OP 染色，显微镜下观察到，心室壁明显增厚，心内膜下层有大片纤维化区域和散在的局部心肌坏死灶，其余的心肌纤维增粗，排列紊乱，具有明显的心肌肥厚纤维化表现。GF*组心室肌胶原含量较对照组增加M ’L

〔（:(4/A :4’）%"（&&41A &4/）)5?5-’干重，&N (4(’〕

，钙含量较对照组增加:’L 〔（’/4/.A .4.）%"（’&4@A &41）))*+?5-’蛋白质，&N (4(1〕。本实验采用密度梯度离心所制备的心肌细胞核在显微镜下观察呈长卵圆形，无细胞碎片污染；核蛋白质含量为匀浆的’I :(，蛋白质与QR<含量比值仅为’(S ’&，核

回收率约为’/L S &(L ，GF*组的核产出率较对照组

低..L 〔（(4T/A (4(M ）%"（’4::A (4’.）)5?5-’湿重，&N (4(’〕，各亚细胞器组分标志酶的活性均低于1L 。

#$#心肌肥厚大鼠心肌细胞核%&’受体动力学的改变

图’<，’K 分别为［.O ］G>.与分离纯化的大鼠心肌细胞核结合的饱和曲线和UD$CDE$#H 作图。结果

显示GF*致大鼠心肌肥厚组G>.与核膜结合的K )$V 较对照组减少&.4:L 〔（.(’A ’:）%"（.T.A &:）8)*+?5-’蛋白，&N (4(1〕，’H 在两组之间无明显差异〔（@41A (4/）%"（@4&A (4M ）3)*+?,-’，&W (4(1〕。#$’心肌肥厚大鼠心肌细胞核()*+,-.+/受体特征

的变化

放射配体%受体结合分析结果显示，GF*致心肌肥厚大鼠［.O ］XY 与心肌细胞核的K )$V 较对照组增加1T4TL 〔（’(@4(A.41）%"（@@4.A :4(）8)*+?5-’蛋白，&N (4(’〕，’H 无明显变化〔（’4MM A (4&&）%"（’4T&A (4:’）3)*+?,-’，&W (4(1〕，如图&所示。#40

肥厚心肌细胞核017$#2摄取的变化

在<=>存在下，

心肌细胞核对:17$&;摄取具有［7$&;］依赖性，随［7$&;］增加而升高，在(4:!)*+?,-’

［7$&;］范围内呈线性增加，以后逐渐饱和4GF*肥大心肌细胞核在［7$&;］各浓度点:17$&;摄取均显著低于对照组。其:17$&;摄取的最大量与对照组相比降低@&L 〔分别为（(4/&A (4’&）%"（’4MT A (41@）!

)*+?5-’蛋白，&N (4(’〕，两组间:17$&;摄取达半数最大量时［7$&;］无显著差别〔分别为（(4.1A (4(1）%"（(4..A (4(1）!)*+?,-’，&W (4(1〕，结果如图.

所示。

3.4!$5*67(*6.,+87(9/（:）*+-58*68;*(-<=,6（>）?,(!@A),@［’B ］.+,C.6,=!，0，1@6(.<;,C<;*6/（［’B ］%&’）D.+-.+46,8*(-.*8A),8)6/+78=/.6*E/+?(,A .C,<(/+*=.+/6(/*6/-(*6C （"）*+-8,+6(,=(*6C （#）$!!A "，(?:)

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7讨论

心肌肥厚纤维化是多种心血管病共同的病理过

程，其发生机理尚未完全阐明。近年来的研究证明，胞内%&’(信号途径与心肌肥厚的发生密切相关。然而，胞浆%&’(如何通过影响核%&’(进一步参与心肌肥厚信号的转导尚不清楚。已有研究表明%&’(

并非被动地自由的进出细胞核，而是通过细胞核上

的相对独立的%&’(转运系统所主动调节［’］。这一系统可能由%&’(摄取贮存和释放等成分组成，其中

CD E F 和FGF 是一类配基操纵的%&’(释放通道，最早发现它们存在于内质网、肌浆网和线粒体上，而最新

的研究表明心肌细胞核膜上也存在这一系统［?’］，参

与调节细胞内%&’(信号的幅度和频率，而%&’(信号频率和幅度的差异是%&’(特异调控细胞内不同生

理过程的内在机理［?E ］

。缺血或超负荷的心脏，发生

心肌肥大、纤维化和心肌细胞排列异常等结构重塑变化。对于心肌重塑时钙通道、H&()%&’(交换以及

肌浆网钙摄入、释放的稳态调节失衡改变，目前已有较清楚阐明。然而，C,.如何通过影响细胞核%&’(信号转导进一步参与心肌肥厚的发生尚不清楚。因而，细胞核%&’(释放和摄取在心肌肥厚发生中起重要作用值得探讨。

大量研究表明，胞浆%&’(信号异常是心肌重塑的重要环节。多种体液因子包括血管紧张素!、去甲肾上腺素、苯肾上腺素和内皮素)?等除能引起心肌细胞肥大反应外，都能增加胞内%&’(浓度，另外导致心肌肥厚的牵张和机械负荷刺激也可引起心肌

细胞内%&’(的增加［?］

。心肌重塑时肌浆网钙释放

和摄取的研究，报道较多。如$*6&等［?I ］

在压力负荷大鼠心肌肥大模型上的研究发现，%&’()$JD&,+和

FGF 的@FH$水平在轻度肥大的心肌表达增加，

而?K ’?&’(#)")*+,-#./+0%’.-1.2+/+34.#56+!(2+/+34’>>’L+M ；CD

（?）

在严重的肥大心肌表达降低，呈典型的双向变化，而肌浆网的!"#$摄取也出现类似的改变。%"&&’(等［)*］观察到代偿腹主动脉缩窄大鼠心肌肥大，心肌在严重肥大时%+%,%-.降低*/0，而肌浆网该受体蛋白水平和高亲和力位点均降低#*0，降低的程度与心肌肥大程度呈正相关。123&45等［)6］在腹主动脉缩窄6周家兔左室肥大模型上也观察到类似的结果，肌浆网%+%密度降低780，而二氢吡啶受体密度无显著改变。另外的研究发现心衰时肌浆网9:7%,%-.表达增加#倍，同时伴%+%,%-.表达下降7/0［);］。从某种意义上说，心肌重塑的功能和结构的改变是各种刺激通过信号转导引起基因表达改变的结果。细胞!"#$稳态失衡是心肌重塑发生的共同信号转导通路之一，但迄今有关心肌重塑时，心肌细胞核钙调节系统如何变化尚未见文献报道。

本工作给大鼠连续)/<5=95’，首先用较大剂量95’造成心肌局灶性损伤，随后在小剂量95’作用下逐渐发生纤维化和心肌肥厚，其心脏增大、心肌胶原和钙含量显著增加，组织学上也具有明显的心肌纤维化、肌纤维增粗、排列紊乱等重塑改变。95’组心肌组织细胞核得率降低，即单位重量心肌组织的细胞核含量减少，提示由于心肌肥厚，单位重量的心肌细胞数目降低。这些结果说明心肌肥大纤维化模型制备成功。

心肌重塑从本质上可能是胞浆!"#$信号异常导致核!"#$调节紊乱进而引起核反应异常的过程，而!"#$跨核膜转运是心肌核!"#$信号转导的关键环节。本研究观察到肥大心肌细胞核与［7>］9:7的最大结合容量显著减少，与［7>］%+的最大结合容量显著增加，解离常数均无明显变化，表明细胞核上的9:7%下调，而%+%上调，受体亲和力不变。由于%+%上调的程度比9:7%大，提示肥大心肌细胞核的!"#$释放能力可能增加。此外，本研究发现肥大心肌细胞核钙摄取最大容量显著降低，而到达半数最大摄取的!"#$浓度无显著变化，说明核的钙摄取活性受到抑制，这一现象可能是由于细胞内钙超载造成核钙增加从而引起反馈调节，也可能与%+%上调!"#$释放增加有关。心肌重塑时细胞核上!"#$释放摄取系统的变化与其他作者对肌浆网!"#$释放摄取系统的变化不相同。这种变化的不一致性可能反映了细胞核钙调节系统与肌浆网钙调节系统的功能差异。目前已知，肌浆网!"#$摄取和释放的改变是心肌肥大时心肌舒缩功能异常的重要环节。由于心肌细胞核的钙调节功能对心肌的核反应具有重要的意义，由此推测，心肌细胞核!"#$调节系统可能参与了心肌肥大发生时的核功能改变。当然要完全证明这一观点，心肌肥大时核钙调节改变与基因表达的关系还有待于进一步探讨。本实验的结果首次证明细胞核钙转运系统的改变参与95’导致肥大心肌重塑。

!参考文献：

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（本文编辑董立春）

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