磷酸寡糖全酶法制备工艺的研究

磷酸寡糖全酶法制备工艺的研究

摘要

磷酸寡糖(Phosphoryl Oligosaccharides，POs)指麦芽低聚糖中的葡萄糖残基与

磷酸根通过共价键连接的一种新型功能性低聚糖，由麦芽三糖至麦芽六糖组分组成。

作为一种天然、安全的新型功能性低聚糖，磷酸寡糖除具备一般低聚糖的理化特性外，

还具有促进体内钙、铁等矿物质吸收和溶解、抗龋齿、抗淀粉老化、水果和切花保鲜

等独特的功能特性，可广泛应用于食品、保健、医药、饲料添加剂等行业。尤其值得

注意的是磷酸寡糖的补钙补铁功能。钙铁都是人体内丰富的矿物质，对人体的作用不

言而喻，而今缺钙缺铁现状严重，一般的补钙补铁产品效果欠佳。磷酸寡糖在弱碱性

条件下，能与钙、铁等矿物质形成可溶性复合物，使得钙、铁离子在肠道内保持较高的浓度，从而促进人体的吸收，是一种很好的新型补钙补铁制剂。因此，研发制备磷

酸寡糖，具有重要的现实意义。本文对全酶法制备磷酸寡糖的工艺进行了优化研究，

具体研究内容如下：

1．对目前国内外已有的磷酸寡糖的构成、功能特性研究及相关糖类的制备、分

离检测方法展开综述；分析比较了磷酸寡糖与相关产品的补钙补铁及抗龋齿、抗淀粉老化功效；磷酸寡糖制备工艺中涉及到的结合磷含量的测定方法、液化工艺、低聚糖

的分离检测方法等。

2．以市场随机购买韵蓰粉及淀粉磷酸酯为原料，通过分光光度法及感应耦合等

离子体原子发射光谱(ICP．AES)法对其中的总磷含量及结合磷含量进行了测定分析。

分光光度法的测定波长为825nm，且较ICP．AES法更适于淀粉磷酸酯中磷含量的测

定。市售马铃薯淀粉的平均结合磷含量为440ppm，而市售淀粉磷酸酯的结合磷含量

均较低，不适于磷酸寡糖的制备研究。

3．采用全酶促反应机制结合低压喷射液化技术制各磷酸寡糖前体—低DE值麦

芽低聚糖浆。工艺流程中考虑pH、酶用量、糖化时间、糖化温度对DE值的影响作

用。通过响应面分析法(RSM)优化出制备DE值为35的低聚糖浆的最佳酶解条件

为：淀粉乳浓度150a6、pH值5．9、耐高温a．淀粉酶用量35 U／g，真菌酶用量2．3

U／g、普鲁兰酶用量1．0 U／g、糖化温度60℃、糖化时间148 rain。通过高效阴离子

交换色谱(HPAEC．PAD)定性分析，确定麦芽低聚糖浆的主要组分麦芽二糖、麦芽

三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖及麦芽七糖。

，‘

J

4．通过柱层析方法对磷酸寡糖进行分离纯化。采用Chitopearl BCW-2501阴离子

交换树脂为填料，O．02mol／L乙酸．乙酸钠缓冲液(pH=4．5)洗脱中性糖，含有

0．1mol／LNaCl乙酸．乙酸钠缓冲液(pH=4．5)洗脱磷酸寡糖。Sephedex G．10柱层析脱

盐，以水为流动相，脱盐效果较好。以结合磷含量为指标，磷酸寡糖的柱层析分离纯

化得率为76．97％。

5．以HPAEC．PAD法对磷酸寡糖进行组分分析。相对于中性糖，磷酸寡糖的出

峰时间向后延迟。对比脱磷后的磷酸寡糖与麦芽低聚糖标准品的保留时间，确定其主

要组分为麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖。红外光谱溴化钾压

片表明：样品在1080em-l处有P．O．C基团的伸缩振动吸收峰，928em-1处有五价

磷的P．O伸展振动。进一步确定磷酸寡糖为结合有磷酸基团的麦芽低聚糖混合物。以

总糖含量为指标，计算出磷酸寡糖的最终得率为0．71％。

关键词：磷酸寡糖；低DE值；分离纯化；结构分析；工艺优化；

II

^

●

Abstract

Phosphorylated oligosaccharides(POs)，a new functional oligosaccharide，were

composed of maltotriose，maltotetraose，maltopentaose，maltohexaose and maltoheptaose，

within covalently-bound phosphate groups linked to the glucose residues．As a new,natural

and security functional oligosaccharide，POs had the effects of promoting the absorption of alkaline earth metal such aS calcium or iron in a living body,preventing carious teeth，suppressing retrogradation of starch，preserving the plants or fruits longer and SO on．Accordingly,POs call be widely used in food，health care，medicine，feed additives，etc．Considerable attention has been focused on the capability of promoting the absorption of calcium and iron．As abundantly minerals，the effects of calcium and iron were

conspicuous in the living body．At present，situations of reduced calcium and iron absorption were serious，and general inhibitions were less effective．However,Pos had the ability to form a soluble complex诵tll minerals(such aS calcium，iron)and had an inhibitory effect on the formation of mineral·phosphate precipitates，to maintain a high concentration of soluble minerals，thus promoted the absorption of minerals alkaline earth metal in human body．As a new inhibitor,the preparation of phosphorylated

oligosaccharides has important practical significance．The task of this paper was to

optimize the enzymatic preparation of phosphorylated oligosaccharides on the basis of

previous researches．

1．The structures and functions of POS，methods of preparing and isolating

oligosaccharides were reviewed by reading and consulting lots of previous papers．

Comparing effects of Pos and homogeneous products，such邪promoting the absorption of

minerals，preventing carious teeth,suppressing retrogradation of starch．Besides，the

different measurements of phosphorus，liquefaction methodology and analytical methods

were also compared．

2．The total phosphorus and binding-phosphorus of commercial starch and phosphate

starch were measured by Spectrophotometry and Inductively Coupled Plasma Emission Spectrometry(ICP-AES)．The results showed that Spectrophotometry is more suitable for the analysis of phosphorus in starch than ICP-AES，and the wavelength was 825nm．The binding-phosphrus of commercial potato starch was 440ppm．Furthermore，commercial phosphate starch was not suitable for the preparation of Phosphoryl Oligosaccharides

which had a low binding—phosphorus content．

3．The POS precursor-maltooligosaccharides谢t}l low dextrose equivalent(DE)were

III

^

prepped by enzymatic methodology and jet liquefaction．Optimization of hydrolysis

conditions was investigated by Response Surface Methodology(RSM)，and effects of pH，

Fungal Amylase，saccharification temperature and time were all tested．The optimal DE of

3 5 was appeared at the follow conditions：starch concentration at 1 5 OBd，pH at 5．9，

thermostable a-amylase at 35U／g，劬gal amylase at 2．3u／g，pullulanase at 1．0U／g，saccharification temperature at 60*(2 and time at 148rain,respectively．111e hydrolyte were

analyzed by HPAEC·PAD．ne results showed that maltose，maltotriose，maltotetraose，maltopentaose，maltohexaose and maltoheptaoseas were the main components．

4．Separetion and preparetion of POS were done by Chitopearl BCW-2501 column chromatography．Neutral sugars were washed out、)l，itll a 20mM acetate buffer(pH 4．5)，

and phosphorylated oligosacchafides were eluted by the same buffer containing 0．I M NaCI．

Then，POS were applied to a Sephadex G一1 0 column to remove the salts．111e yield rate of

column chromatography was 76．97％．

5。Fractions of POS were abtaincd by HPAEC—PAD．Results demonstrated that

retention time of POS was longer than neutral sugars．Comparing the retention time of de·phospharylated oligossacharides with authetic maltooligosaccharides，founded that

maltotriose，maltotetraose，maltopcntaosc，maitohexaose and mMtoheptaoseas were the

main components．Infrared chromatography showed that stretching vibration absorption

peaks of P—O—C and P—O appeared in 1 080cm-1 and 928 cm·l nearby．Thereby,it predicted

that POs were carbohydrates combined with phosphate groups．The yield rate of POS was

0．7 1％，to the total sugar content of indicators．

Keywords：Phosphorylated Oligosacchafides，Low dextrose equivalent，Separetion and

Preparetion，Structure analysis，Optimization

IV

产

，

，

，

，

●

目录

中文摘要????????????????????????????????．．I

Abstract??????????????????????????????????????????．．III

El j录????????????????????????????????????????????．、，

1文献综述???????????????????????????????．1

1．1前言??????????????????????????????1

1．2磷酸寡糖概述???????????????????????????1

1．2．1磷酸寡糖的组成与结构????????????????????．1

1．2．2磷酸寡糖的功能特性?????????????????????。2

1．3磷酸寡糖的制备工艺研究??????????????????????．．4

1．3．1磷含量的分析研究????????????????????????4

1．3．2低DE值麦芽低聚糖浆的制备研究???????????????．5

1．3．3磷酸寡糖的分离纯化?????????????????????6

1．3．4低聚糖的分析检测方法?????????????????????6

1．4研究展望?????????????????????????????．7

2弓I言???????????????????????????????????????????．9

2．1课题研究意义???????????????????????????．．9

2．2研究内容?????????????????????????????9

3材料与方法????????????????????????????????1l

3．1材料、仪器和试剂?????????????????????????ll

3．1．1材料????????????????????????????????????．1l

3．1．2主要仪器及设备???????????????????????．．1l

3．1．3主要试剂??????????????????????????12

3．2淀粉原料的筛选? .? .? .? .? .? .? .? .? .? .? .? .? .12 3．2．1淀粉水分含量测定方法? .? .? .? .? .? .? .? .? .? .．12 3．2．2总磷含量的测定? .? .? .? .? .? .? .? .? .? .? .?．．13 3．2．3游离磷含量的测定???????????????????????．．14

3．2．4结合磷含量的测定??????????????????????14

3．3低DE值麦芽低聚糖浆的优化工艺研究???????????????14

3．3．1 DE值测定方法???????????????????????．14

3．3．2总糖含量的测定方法??????????????????????．15

3．3．3喷射液化制备低DE值的麦芽低聚糖浆?????????????1 5

3．3．4 HPAEC．PAD法分析麦芽低聚糖浆的组分???????????．．16

V

●

3．4磷酸寡糖的分离纯化研究?????????????????????17

3．4．1 Chitopearl BCW-2501阴离子交换树脂的结构及交换原理?????．．17 3．4．2层析柱的制备与上样?????????????????????18

3．4．3中性糖的洗脱????????????????????????18

3．4．4洗脱液浓度的选择??????????????????????18

3．4．5磷酸寡糖的脱盐处理?????????????????????18

3．5磷酸寡糖的组分分析方法?????????????????????．19

3．5．1磷酸寡糖的脱磷处理?????????????????????19

3．5．2高效阴离子交换色谱(HPAEC．P!AD)定性分析磷酸寡糖?????．19 3．6磷酸寡糖的结构分析方法??????????????????????20

3．6．1磷酸寡糖的冷冻干燥?????????????????????20

3．6．2红外光谱分析???????????????????????。20

3．7磷酸寡糖得率的计算方法?????????????????????。20

4结果与分析?????????????????????????????．．2l

4．1淀粉原料的筛选?????????????????????????．2l

4．1．1分光光度法吸收波长的选择??????????????????2l

4．1．2磷标准曲线的绘制??????????????????????2l

4．1．3精密度及回收率实验??????????????????????22

4．1．4不同样品中结合磷含量的分析研究???????????????22

4．2磷酸寡糖前体—低DE值麦芽低聚糖浆制备工艺的优化????????23 4．2．1还原糖标准曲线的绘制(DNS法)??????????????．．23

4．2．2总糖标准曲线的绘制?????????????????????．24

4．2．3酶解条件单因素实验分析???????????????????24

4．2．4酶解生产低DE值麦芽低聚糖的响应面试验分析????????．．27

4．2．5低DE值麦芽低聚糖浆组分的分析??????????????．．3l

4．3磷酸寡糖的分离纯化???????????????????????．．32

4．3．1洗脱液浓度的选择??????????????????????．．32

4．3．2不同浓度洗脱液各项指标分析? .? .? .? .? .? .? .? .。32

4．4磷酸寡糖的组分分析? .? .? .? .? .? .? .? .? .? .? .?。33

4．5磷酸寡糖的结构分析???????????????????????。35

4．6磷酸寡糖得率的计算????????????????????????36

5讨论??????????????????????????????????????????．．37

6主要结论???????????????????????????????。38

参考文献????????????????????????????????．．39

Vl

■

●

致谢??????????????????????????

作者简介?????????????????

硕士期间发表的论文?????????????。

本科和硕士期间获得奖励????????????

VlI

1文献综述

1．1前言

寡糖又称低聚糖(Oligosaccharides)的概念，是B．Helgerich等于1930年首先提出的

【11。它们通常指由2～10个单糖通过糖苷键连接形成的具有直链或支链的低度聚合糖

类，一般以还原端的糖命名，如麦芽寡糖、寡果糖、寡木糖、纤维寡糖等【21。根据寡

糖的生物学功能可将其分为功能性寡糖和普通寡糖两大类。普通低聚糖包括蔗糖、麦

芽糖、麦芽三糖、乳糖等，它们可被机体消化吸收产生能量【3】。而功能性寡糖通常不

被胃酸及人体酶所水解，不能被人体肠道所利用。与一般的低聚糖相比，功能性低聚

糖具有如促进双歧杆菌增殖、抑制体内毒素生成，调节肠胃功能、抗衰老、防止胆固

醇积累、降低血压等独特的生理功能，是功能性食品开发和研究的重点【4羽。

功能性低聚糖在世界上的发展非常迅速，日本、美国、欧洲一些国家为全球主要

的生产国，同时也是主要的消费市场。日本的功能性低聚糖开发较早，品种也最多，

低聚果糖1983年即达到产业化生产规模，开始进入市场[71。目前日本国内低聚糖的生

产无论产量、价格优势及消费量、出口量均居世界领先地位【引。美国已利用其在糖化

学方面的优势，在特殊低聚糖的研究开发上进展迅速，多种低聚糖药物、低聚糖疫苗

等正在开发【91。比利时、法国、荷兰等欧洲国家也有多年开发低聚糖的历史，低聚果

糖已被欧盟批准为食物配料，而不是食品添加剂[71。20世纪80年代，我国开始对低聚

糖的研究，在“九五"期间形成工业规模和商品化，经历了初步研究一实验室生产一

工业化生产一产业化一高纯度专业化的五个阶段。目前，国内功能性低聚糖的主要品种有低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、大豆低聚糖、

水苏糖等【101。

1．2磷酸寡糖概述

磷酸寡糖的概念最早是由日本学者Kamasaka,H．等于1995年提出的，是指麦芽低

聚糖中的葡萄糖残基与磷酸根通过共价键连接的一种新型功能性低聚糖，由麦芽三糖

至麦芽六糖组分组成【I¨。

1．2．1磷酸寡糖的组成与结构

磷酸寡糖是分子中带有磷酸酯键，且聚合度在3"-'6之间的麦芽低聚糖混合物。

Takeda和Hizukuri研究表明，约60*／',-70％的磷酸基团是结合在葡萄糖残基中的C-6

上，余下的部分主要结合在C．3上【12】。磷酸基团与麦芽低聚糖中葡萄糖残基的主要结

合方式如图1．1所示(图中R代表葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖或麦芽四糖)。相关研

究¨叫表明，磷酸寡糖的平均聚合度为4．03，由PO．1和PO．2两部分组成，其中主要

组分为PO—l。对PO。1和PO．2进行组分分析发现：PO．1的平均聚合度为4．02，由麦

芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖构成，每一葡萄糖残基上连接有～个磷酸基团：而PO．2

的平均聚合度为5．82，由麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖和麦

芽八糖组成，其中麦芽五糖和麦芽六糖为主要组分，每一个葡萄糖残基上至少连接有

两个磷酸基团。日本学者【ll】研究结果表明：磷酸寡糖中的PO．1部分主要是由3．磷

酸寡糖和6．磷酸寡糖组成，见图1．2所示。

图l·l磷酸寡糖中磷酸根与葡萄糖残基的主要结合方式

Fig．1·l Combination ofGlucosyl Residue and Phosphate Group in Phosphoryl Oligosaccharides

6P

油I

6P

占，

≥礴酸寡艟6-Wl练曩

图!-2磷酸寡糖PO-I组分的结构简ItlI’哪

Fig．1-2 Illustration ofthe Structures ofthe PO-I Fraction ofPhosphoryl Oligosaccharides[’4】

C}f1：表葡萄塘残基．●代表葡萄糖残基还原末端．3P代表与葡萄塘残基第3位碳原子相结合的磷酸基团．6P 代表与葡萄骱残基的第6

位碳原子相结合的磷酸基团．

1．2．2磷酸寡糖的功能特性

研究表明，磷酸寡糖具有促进体内钙、铁等矿物质吸收和溶解、抗龋齿、抗淀

粉老化等独特的功能特性。此外，将磷酸寡糖可添加到液体或粉末状肥料及药剂中，

还可起到保持植物如水果和切花的保质期的作用【15】。现对已有的主要研究结果综述如

2

为10mM的PO．2添加至含有钙离子及磷酸盐的溶液中，24小时后仍能使溶液中的可

溶性钙离子浓度保持在原来的60％左右【131。采用大鼠空肠结扎的方法进行实验，分

别将相当于0．8mg／mL钙含量的磷酸寡糖钙、氯化钙、乳酸钙注入结扎空肠中，隔一

定时间检测空肠腔洗脱物中钙离子的含量。研究结果表明，大鼠肠道对磷酸寡糖钙的

吸收能力与其对可溶性钙复合物中钙的吸收能力基本相当，都保持在60％左右【14l。

此外，作为铁的强化剂磷酸寡糖具有增加无机铁溶解性的生理功效。分别将PO．1和

PO．2溶液与FeCl3溶液混合，用NaHC03溶液或0．2M的Na3P04缓冲液调节pH 6．5～

7．4，37℃条件下保温48h，检测上清液中铁离子的含量。实验结果表明，PO．1组分

能够促进与其自身摩尔质量相当的铁离子溶解，而PO．2则能促进约10倍于其自身摩

尔质量的铁离子溶解【2¨。

1．2．2．2抗龋齿、促进牙齿再矿化

随着人民生活水平的不断提高，饮食中致龋因素不断增多，预防工作显得尤为重

要。龋齿是由于牙齿结构遭到破坏而引起的一种传染性流行病[221。龋齿病的发生是口

腔细菌造成牙釉质、牙本质、牙骨质脱矿的结果【231。磷酸寡糖具有PH缓冲能力，可

降低口腔中的酸度。此外，磷酸寡糖亦不能被口腔细菌代谢利用，从而达到抗龋齿的

功效。Kamasaka等【24】取经过人工去矿化的牙釉质切片，在37"C条件下，分别用矿物

质溶液(a)和含有磷酸寡糖钙的矿物质溶液(b)再矿化一周，结果如图1．3所示。由图

可以看出含有磷酸寡糖钙的矿物质溶液对牙齿的再矿化效果较好。基于磷酸寡糖不被

口腔微生物发酵利用的特点，日本学者已将其作为一种功能性添加剂加入口香糖中，

实验证明磷酸寡糖确实起到了加强牙齿釉质的再矿化，防止齿质损坏的效果。

图1．3牙釉质片段扫描电镜‘枷

Fig．1-3 Scanning Electron Microscope of Planoparallel Sections from Enamel[241

1．2．2．3抗淀粉老化

淀粉的老化是一个淀粉分子从无序到有序的过程，分子链间借氢键相互吸引与排

列，使体系自由焓降低，最终形成结晶【25】。影响淀粉老化的因素有淀粉来源【26】，直链

淀粉的含量【271，水分，温度【2砌等。磷酸寡糖分子中的羟基，可与水分子较好的结合，

维持产品的水分活度；葡萄糖残基上的磷酸基团可阻碍淀粉分子的定向取向，从而综

合抑制淀粉的老化。有研究表明【15】，在相同的时间内，磷酸寡糖的抗淀粉老化的能力

超过日本已上市的抗淀粉老化制剂“刑ioligo"(含60％以上的麦芽三糖)。因此，可

将磷酸寡糖作为抗老化保鲜剂，添加于面包、米团、年糕等制品中，以起到保韧及延

长保质期的功效。

1．2．2．4无不良风味及口感

酪蛋白磷酸肽(CPPs)是由酪蛋白经酶水解分离纯化而得的一种天然活性肽产

品【291。由于含有三个磷酸基团，同磷酸寡糖一样，可在中性或碱性的条件下，与金属

离子，特别是钙离子形成可溶性复合物【3们。但研究表明，CPPs具有苦昧或迟发苦味。

在感官审评实验中，CPPs II(由含量大于12％的CPPs去除苦味化合物得到)的苦味

阈值为5xlO五％，而磷酸寡糖溶液浓度在1％时仍无苦味【13】。因此，磷酸寡糖作为添

加剂添加于食品中时，不会影响产品原有的风味及口感。

1．3磷酸寡糖的制备工艺研究

1．3．1磷含量的分析研究

淀粉中通常含有少量的无机盐，而无机盐主要是磷酸和某些阳离子形成的赫类。

磷在淀粉中一部分以磷脂质的形式存在，一部分以磷酸酯的形式结合在葡萄糖残基上

【311。Takeda和Hizukuri掣12】研究表明，磷酸基团主要是结合在支链淀粉的B 链上，

且约60％-70％的磷酸基团是结合在葡萄糖残基的C．6上，余下的部分主要结合在C．3

4

上。马铃薯淀粉作为结合磷含量最高的天然淀粉磷酸酯，平均每200"-'500个葡萄糖

基中结合有一个磷酸基团【131，结合态磷含量约在100．1000ppm[32】。但由于不同的马

铃薯品种及种植条件，其结合磷含量亦存在一定差异[33,34】。目前，淀粉磷酸酯中磷含

量的测定主要有重量法、原子吸收法、容量法、分光光度计法、X射线荧光法等。其

中分光光度法是我国和国际上分析淀粉磷酸酯总磷含量的标准方法【35,36】。姜元荣等【37】采用分光光度法以680nm为检测波长研究了淀粉磷酸酯取代度的测定方法：Takahiro

Noda等人‘38’391以能量色散X射线荧光光谱法(ED．XRF)对535种马铃薯淀粉中的

磷含量进行了分析测定，表明马铃薯淀粉总磷含量在308．1244ppm。

1．3．2低DE值麦芽低聚糖浆的制备研究

磷酸寡糖是分子中结合有磷酸基团的麦芽低聚糖混合物，因此，制备其前体—低

DE值麦芽低聚糖浆是磷酸寡糖研究的重要前提。淀粉酶作用于底物的过程包括液化、

糖化、脱支等多重反应。传统的酸液化法生产低聚糖易生成有色物及复合糖类，产物

复杂，产率低140】。随着现代酶制剂工业的不断发展，制糖工业也进入了一个全新的发

展阶段，酶法液化以其工艺简单、成本低、产品质量高的优势逐渐替代了原有的液化

工艺。可以采用的酶主要有耐高温a．淀粉酶，p．淀粉酶，糖化酶，真菌a．淀粉酶，普

鲁兰酶等。蒸汽喷射液化器的研制成功更进一步加速了制糖工业的发展，亦由此产生

了喷射液化法制糖工艺。蒸汽喷射液化器是将两种不同压力的流体高速混合，并发生

物质和能量交换的装置?】。喷射液化法的原理为：在喷射时，高压蒸汽与薄膜状淀粉

浆料直接混合，蒸汽在高物料流速和局部强烈湍流作用下迅速凝结，释放出大量潜热，

使淀粉在极短时间内均匀受热糊化1421。

工业上以DE值表示淀粉糖液中还原糖含量(以葡萄糖计)占干物质含量的百分

率【40l，它是控制淀粉水解程度的关键指标。DE值低，则制备的糖液中葡萄糖的含量

低；反之，葡萄糖的含量较高。DE值的控制受多方面因素的影响，如pH值、酶用

量、酶解时间、酶解温度等。马涛、李福谦等人【43朋】以大米淀粉为原料研究了制备低

DE值麦芽糊精的酶解条件；韩玉洁等【45】对以马铃薯淀粉为原料制备高麦芽糖浆的液

化影响因素进行了研究；杨铭铎等[461对马铃薯淀粉制备低D E值麦芽糊精的工艺条

件进行了优化。

从表面上看，磷酸寡糖前体与普通麦芽低聚糖的制备过程相似，但在淀粉酶作用

于马铃薯淀粉时，将受到连接在葡萄糖残基上的磷酸基团的电荷效应和空间位阻效应

的影响【13J，使得酶解产物为聚合度较大(一般在10以上)的麦芽低聚糖，酶解反应的

转化率大为降低，且产物中麦芽三糖至麦芽六糖组分的比例偏低。毛跟年等人【47】对磷

酸寡糖前体．麦芽低聚糖的制备做了初步研究，但并未进行优化处理。本课题研究小

组成员亦在实验室进行了前期优化研究。实验中采用耐高温铲淀粉酶、葡萄糖氧化酶及普鲁兰酶共同作用制备麦芽低聚糖浆，但由于实验室不能进行喷射液化，DE值不

易控制，导致产物中葡萄糖含量高，而低聚糖类含量较低。

1．3．3磷酸寡糖的分离纯化

由于磷酸寡糖分子中结合有磷酸基团，其分离特性与果糖1,6．二磷酸有相似之

处。磷酸基团带有负电荷，因此可以采用离子交换法除去不带电荷的中性糖。Katayama．Tatsuo等人【48】采用Dowex SAR作为树脂填料，以0．4M NaCl(pH=2)为洗

脱剂，分离纯化出FDP。应汉杰等【49】对201×7，D301，D201，HJ-30，717等不同型号树

脂分离FDP的性能进行了研究，筛选出了型号为HJ．30的树脂，分离FDP效果较好。

Sven M娃ller-Loermies等【50】采用高效阴离子色谱CarboPac PAl半制备柱，以H20和600mMNaOAc为洗脱剂，从E．coli J．5脂质糖中成功分离出磷酸化的低聚糖类。Martin Horst等【51】采用QAE．Sephadex A．25对6．磷酸甘露糖及6．磷酸葡糖酸盐的分离情况进行了研究。日本学者【l5】采用壳聚糖修饰的离子交换层析柱，以含有盐溶液的乙酸缓冲

液对磷酸寡糖进行分离纯化。本课题研究小组成员采用HJ．30弱碱性阴离子交换树

脂，0．5mol／LNaCl作为洗脱液，亦可将磷酸寡糖分离出来【52l，但得率过低。

1．3．4低聚糖的分析检测方法

低聚糖的分离检测方法目前有多种，如：薄层色谱法、气相色谱法、高效毛细管

电泳法，高效液相色谱法(HPLC，折光示差检测器)，高效阴离子色谱法(电化学检

测器)等。气相色谱法(GC)测定糖类，具有选择性好、样品用量少、分辨率高、快速

准确、灵敏等优点，但糖类物质本身没有足够的挥发性，必须要将其转化为挥发性衍

生物【531。张威等嗍对土壤中的8种单糖进行糖腈乙酰酯衍生化，而后通过气相色谱法对这8种糖的含量进行了测定，但衍生试剂的加入量、肟化反应时间等都对测定结

果有一定影响。

薄层色谱法所需实验条件简单、方便，斑点较清晰，常用于糖类物质的定性分析。

Kamasaka等【12】以乙腈．水(8：2，v／v)作为展开剂，硫酸．甲醇溶液(1：1，v／v)作为

显色剂，对PO．1组分进行初步定性分析。毛跟年等【55】亦对脱磷后的磷酸寡糖进行了

薄层层析，分别对展开剂正丁醇：乙酸：水(3：l：1，v／v)，水：乙酸乙酯：吡啶

6

(25：100：35，v／v)：显色剂苯胺-二苯胺．磷酸，硝酸银．氨水．氢氧化钾的展开效果及

显色效果进行了比较，初步确定磷酸寡糖的主要组分为麦芽三糖．麦芽六糖。

高效阴离子色谱法是近年来发展比较迅速的糖类化合物分析方法。由于糖缺少紫

外吸收的特点，常用的高效液相色谱(紫外检测器)并不适于糖的检测。Rocklin首

先提出用阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC．PAD)分析糖类化合物【56】。目前HPAEC．PAD也已经广泛应用于各类样品中糖类的分析领域。HPAEC．PAD(high

performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detector)是配有脉冲

安培检测器的高效阴离子交换色谱。其基本原理是利用糖在高pH(>12)介质中能

解离成阴离子，使其在附聚薄壳型阴离子交换树脂柱上进行交换层析，分离后的糖组分进入PAD进行检测，从而达到高效、快速、微量(pm01．nm01)的分离与检测【57】。

于泓等【58】对HPAEC—PAD法分离测定糖类化合物中的色谱柱温度、采样电位和流动相

浓度等影响因素进行了研究。结果表明，通过改变温度及提高采样点位均可以改善糖

的分离检测状况。潘媛嫒等【591采用眦C．PAD法分析了麦汁和啤酒中的糖，建立了

HPAEC．PAD同时测定单糖、二糖和多种低聚糖的方法。其研究中使用ICS．3000多功

能色谱装置及CarboPac PAl00阴离子交换柱，采用水、O．25 mmol／L NaOH溶液和

lmol／L NaOAc溶液三元梯度淋洗，葡萄糖、果糖、麦芽糖、麦芽三糖一麦芽七糖得

到很好的分离，检出限(S／N=3)在13"--88 Pg范围内。

鉴于灵敏度高，检测限更低等优点，Kamasaka等人【141将HPAEC．PAD法用于磷

酸寡糖的组分分析，采用DX．300色谱系统及CarboPac PA．100阴离子交换柱，以

NaOH和NaOAc溶液为流动相。结果表明，由于分子中磷酸基团的作用，磷酸寡糖

的保留时间延长。通过对比脱磷后POS与麦芽低聚糖标准品的保留时间，初步确定

磷酸寡糖的组分。本实验室前期采用HPLC与示差折光检测联用进行糖分析，可将低

聚糖初步分离开【521，但灵敏度及专一性较差。

1．4研究展望

磷酸寡糖作为一种具有独特的功能特性的天然、安全新型功能性低聚糖。其研究

和开发尚处于起步状态。目前，日本市场已有相关磷酸寡糖产品出售，但仅只本江崎格力高株式会社生产。我国学者谷利伟于1999年对磷酸寡糖作了简要介绍删，但并

未引起相关领域研究者的关注。至今国内关于磷酸寡糖的研究开发仅见零星报道

[48，52，551161-63]。

7

本课题研究小组前期对磷酸寡糖的制各工艺做了初步的研究，但目前仍存在着很

多有待解决的问题。全酶促反应机制的控制、低聚糖的分离检测方法、磷酸寡糖的产

率过低等问题都有待进一步研究与改进。随着科学技术的发展及研究的进一步深入，

一些新技术也应用到磷酸寡糖的研究当中来了，如：低压喷射液化技术，酶工程技术，

磷酸化修饰技术等。此外，一些相关的酶学研究及微生物细胞发酵技术研究也在逐步

开展，相信在不久的将来会有更多研究成果出现。

2引言

2．1课题研究意义

功能性低聚糖在食品、医药、饲料添加剂及植物保护方面都有着广阔的应用前景，

已引起各国学术界的重视。磷酸寡糖作为一种新型功能性低聚糖，除具备一般功能性

低聚糖的功能特性，还具有促进体内钙、铁等矿物质吸收和溶解、抗龋齿、抗淀粉老

化等独特的功能特性，尤其值得注意的是磷酸寡糖的补钙功能。钙是人体内最丰富的

矿物质，对人体的作用不言而喻，而今缺钙现状严重，一般的补钙产品效果欠佳。现

代医学专家通过大量研究证明，人体从20岁开始每天亏损钙30"--50mg，这就需要骨

钙库每天支出30"-'50mg的钙去补足血钙，结果造成人体骨总量以每年1％的速度丢失。

由于饮食结构的不平衡，尤其是以谷类为主食的我国人群钙的摄入量仅占营养学家推

荐量的50％，所以补钙成为保健医学的一大课题。磷酸寡糖在弱碱性条件下，能与钙

离子形成可溶性复合物，并阻碍其与日常摄入的碱性磷酸盐、草酸盐、植酸等形成难

溶的化合物，使得的钙离子在肠道内保持较高的浓度，从而促进人体的吸收，是一种

很好的新型补钙制剂，具有广阔的开发空间。

此外，磷酸寡糖能够调整肠道菌群，但不像一些具有肠道调节功能的寡糖易导致

肠鸣腹泻，符合人们对食品安全的日益增长的要求。随着经济的发展和人民生活水平

的提高，居民的健康状况有了明显改善。但由于饮食结构不合理，如脂肪摄入量过多

等，各种常见病、多发病的患病率增加。此外，随着“三高"类疾病的年轻化趋向及

老龄化社会的临近，中国有望成为世界最大的保健品生产、消费国，这也为具有独特

生理功能的功能性寡糖提供了良好的市场前景。

我国是世界上马铃薯的生产大国，但加工比例还不到产量的百分之五，是世界上

马铃薯加工能力最低的国家之一，综合利用方面薄弱，经济价值发挥不充分。本论文

以马铃薯淀粉为原料采用酶工程技术手段制备具有独特功能特性的磷酸寡糖，必将提高马铃薯淀粉的附加值，促进相关农业的发展。此外，本研究的开展也对我国淀粉糖工业的发展及新型功能性低聚糖的研发具有积极的促进作用。

2．2研究内容

在国家科技政策的支持下，课题“马铃薯淀粉全酶法和纳滤技术生产磷酸寡糖的

研究”获得了国家863计划资助(课题编号2006AAl02340)。作为863计划的专题项

目于2006年11月正式立项。本文的研究内容是该课题的重要组成部分，主要研究内

9

容如下：

l、研究分析不同的市售淀粉及淀粉磷酸酯中的结合磷含量，筛选出适于磷酸寡糖制

备的原料。

2、以马铃薯淀粉为原料，通过响应面分析法优化出制备磷酸寡糖前体一低DE值麦

芽低聚糖浆的最佳酶解条件。

3、磷酸寡糖的分离纯化工艺研究。

4、对制备的磷酸寡糖进行组分分析及结构分析。

IO

3材料与方法

3．1材料、仪器和试剂

3．1．1材料

马铃薯淀粉：宁夏固原淀粉有限公司

淀粉磷酸酯：市售

耐高温睁淀粉酶：丹麦诺维信生物工程公司，21000 U／ml

真菌酶：丹麦诺维信生物工程公司，2000 U／ml

普鲁兰酶：丹麦诺维信生物工程公司，400 U／rnl

碱性磷酸酯酶：大连宝生物工程(大连)有限公司，0．4U／gL

Chitopearl BCW-2501树脂：日本光和株式会社赠送

Sephadex G．10凝胶：北京索莱宝科技有限公司

CarboPac PA-1 00分析柱(2x250mm)及保护柱(2x50mm)．．美国Dionex公司

CarboPac PA-200分析柱(3x250rnm)及保护柱(3x50mm)：美国Dionex公司

3．1．2主要仪器及设备

ICS．3000高效阴离子交换色谱仪(脉冲安培检测器)：美国Dionex公司

UV-2102C紫外．可见分光光度计：上海尼龙科仪器有限公司

NEXUS．870傅立叶红外光谱仪：美国尼高力仪器公司

PB．10 pH计：德国赛多利斯股份公司

ABl04-N电子天平：梅特勒．托力多(上海)有限公司

Allegra 64R高速冷冻离心机：美国贝克曼库尔特有限公司

F．2H生物反应器：上海申生科技有限公司

DF．101 S磁力搅拌水浴锅：巩义市英峪予华仪器厂

3．0cmx60cm层析柱：上海锦华层析设备厂

2WAJ阿贝折光仪：上海光学仪器五厂

LGJ．12冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司

R206旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司

DB．2加热板：常州国华电子仪器有限公司

Millipore超滤离心管(3KD)：美国密理博有限公司

低压喷射液化器：上海兆光喷射液化技术有限公司

配料罐、层流罐、糖化罐：安庆中石化四建集团

节能多效降膜真空蒸发浓缩器：无锡市华英生化设备制造有限公司

3．1．3主要试剂

标准品(葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖)，均购自SIGMA公司

乙酸钠：购自德国Fluka公司，色谱级

50％(wlw)氢氧化钠：购自美国Fisher Scientific，色谱级

浓硝酸、浓盐酸、浓硫酸、钼酸铵、氯化钙、冰乙酸、氢氧化钠、氯化钠、硝酸银、3，5．二硝基水杨酸、丙三醇、苯酚、乙酸乙酯、吡啶、氨水、苯胺、二苯胺、磷酸、丙酮等均为国产分析纯。

3．2淀粉原料的筛选

3．2．1淀粉水分含量测定方法【删

取干净的空铝盒，放在130℃烘箱内烘30min．60rnin，取出铝盒置于干燥器内冷

却至室温，取出称量：再烘30min，重复进行冷却、称量至前后两次质量差不超过

O．0059，即为恒质(蛳)。

精确称取59+O．259充分混匀的试样，倒入恒重后的铝盒内，使试样均匀分布在盒

底表面上，盖上盒盖，立即称量铝盒和试样的总质量(m1)。在整个过程中，应尽可

能减少铝盒在空气中的暴露时间。

称量结束后，将盒盖打开斜靠在铝盒旁，迅速将盛有试样的铝盒和盒盖放入已预

热到130"C的恒温烘箱内，当烘箱温度恢复130℃时开始计时，样品在130"C条件下

烘90min，然后取出，并迅速盖上盒盖，放入干燥器中，铝盒不可叠放。铝盒在干燥

器中冷却30min-45min至室温，然后将铝盒从干燥器内取出，在2min内精确称量出

样品和带盖铝盒的总质量(m2)。对同一样品应进行两次平行测定。

计算：X=(ml-m2)／(ml-mo)×100

X_——试样水分含量，％；

mo-呻质后空铝盒和盖的总质量，单位为克(g)；

ml——干燥前带有样品的铝盒和盖的总质量，单位为克(g)；

m2——干燥后带有样品的铝盒和盖的总质量，单位为克(g)；

如果两次平行测定结果的绝对差值不超过O．1％(质量分数)，则取两次测定结果

12

2)标准曲线的绘制：称取105+_2。C烘1小时的无水磷酸二氢钾0．4393 g，精确至

0．5 mg，溶于水，并准确稀释至1 L，取该液10 mL，加水准确稀释至250 mL，作为标

准磷溶液。取七只50 mL的容量瓶，分别加入0．0、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0和10．0 mL 的磷标准溶液，它们分别对应于0、4、8、12、16、20和40 u g的磷。七只容量瓶分

别加入水，使每只瓶的总体积为30 mL，并混合均匀。依次加入4 mL钼酸铵溶液和2 mL

抗坏血酸溶液，每加入一只即混合均匀。沸水浴槽中加热10 min，迅速冷却至室温，

定容。在波长825 ni／l时测定吸收率，并以磷含量为横坐标X，吸光度为纵坐标Y，画

出标准曲线。

3)样品中总磷含量的测定：根据试样中的估计含磷量，称取适量混合均匀的样品，

精确到0．0002 g，使样品重量对应于吸收率范围在0．1．0．7之间。将所称样品倒入凯氏

烧瓶内，加入15 mL硫酸．硝酸试剂，逐渐加热消化至瓶内液体微沸，继续煮沸至棕

色气体变成白色，液体变成澄清为止。待消化液冷却到室温后，加入45 mL水，用氢

氧化钠溶液将pH值提高到7，再将瓶内溶液定量地移入一个具有适当容量的容量瓶

内，加水至刻度，并充分摇匀。

吸取一等分样品液于50 mL锥形瓶内，加水至30 mL，混匀后与标准曲线显色反

映相同，根据标准曲线得出相应的磷的含量。用蒸馏水代替样品进行空白测定。对同

一样品进行三次测定，取平均值。

3．2．2．2感应耦合等离子体原子发射光谱(ICP．AES)法

1)原理：当氩气通过等离子体火炬时，交变电磁场使其电离、加速并与其他氩原

子碰撞，使更多的氩原子电离，形成原子、离子、电子的粒子混合气体，即等离子体。由于不同元素的原子在激发或电离时可发射出特征光谱，因此，通过与标准溶液进行比较，即可定量测定样品中各元素的含量。

2)工作条件：Atomscan Advantage感应耦合等离子体原子发射光谱仪，500 mm焦

距，光栅刻线2400条／mm，输出功率1350 W，检出限30 mg／L(P)，载气流量1．85

mL／min，载气压力30 psi，检测线波长213．6 nnl。

3)样品处理：称取l-1．5 g试样置于50 mL凯氏瓶中，加入15 mLHN03及数滴H2S04，

加热回流8 h，直至瓶内液体变成无色，取下浓缩至5 mL，冷却后，定容至10 mL，测

定。

3．2．3游离磷含量的测定【36’37】

称取1．5-2．0 g试样置于50 mL烧杯中，用l mol／L的盐酸溶解，并用蒸馏水将其

全部洗进250 mL容量瓶中，充分摇匀，定容，过滤待用。移取5～10 mL滤液(视含磷

量而定)至50 mL锥形瓶内，依次加入4 rnL钼酸铵溶液和2 mL抗坏血酸溶液，加后

立刻混匀，沸水浴中加热10分钟，迅速冷却到室温，50 mL容量瓶中定容。用蒸馏

水代替样品进行空白测定，用分光光度计在波长825 nm处测定该溶液的吸光度，并

从标准曲线上读出相应的磷的含量。对同一样品进行三次测定，取平均值。

3．2．4结合磷含量的测定

结合磷含量％=总磷含量％一游离磷含量％

3．3低DE值麦芽低聚糖浆的优化工艺研究

3．3．1 DE值测定方法

3．3．1．1还原糖含量的测定嘲

在氢氧化钠和丙三醇存在下，还原糖能将3，5．二硝基水杨酸中的硝基还原为氨

基，生成氨基化合物。此化合物在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈橘红色，在540nm

波长出有最大吸收，其吸光度与还原糖含量呈线性关系。t

1)标准曲线的绘制：

准确称取葡萄糖1．00009，配制成Img／mL标准葡萄糖溶液。分别取0mL、lmL、

2mL、3mL、4mL、5mL、7mL置于不同的25mL容量瓶中，加入DNS试剂2mL，

置100"C水浴中煮沸2分钟显色，迅速冷却，定容，在540nm处测定吸取度。以还原糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2)样品中还原糖含量的测定

取浓度适当(含葡萄糖3"-4mg)的样品液lmL，按上述方法步骤操作，测得吸

光度值，再以标准曲线计算出还原糖含量。

14

3．3．1．2 DE值的计算公式【40】

DE值％=(还原糖含量／干物质含量)×100％

其中干物质量用阿贝折光仪测定。

3．3．2总糖含量的测定方法【硐

苯酚与硫酸的混合物可与己糖、糖醛酸等发生显色反应，己糖显色反应后在

490nm处(戊糖及糖醛酸在480nm)有最大吸收，总糖含量与吸光度值呈线性关系。

1)绘制标准曲线：

准确称取葡萄糖20mg，配制成40mg／mL标准葡萄糖溶液。分别吸取标准葡萄糖

溶液0．0 mL，0．4 mL，0．6mL，O．8mL，1．0mL，1．2mL，1．4mL，1．6mL及1．8mL，

各补水至2．0 mL，分别加入1．0 mL 6％苯酚及5．0mL浓硫酸，静置10分钟，摇匀，

室温放置20分钟后于490nm处测吸光度。以糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，

绘制标准曲线。

2)样品中总糖含量的测定i

取一定量的样品液，按上述方法操作，测得吸光度值，再以标准曲线计算出总糖

含量。

3．3．3喷射液化制备低DE值的麦芽低聚糖浆

3．3．3．1工艺流程

耐高温a．淀粉酶、CaCh

l

马铃薯淀粉一调浆、pH值一配料啼喷射液化一液化保温一快速

冷却一糖化一灭酶一离心呻浓缩一麦芽低聚糖浆

f

真菌酶、普鲁兰酶

3．3．3．2操作步骤和要点

1)调浆：在配料罐内先加水，在搅拌过程中加入马铃薯淀粉，把粉浆乳调到

10．15086，用HCl和Na2C03调至pH值为5．0-6．5，加入0．03．0．06wt％的氯化钙作为

淀粉酶的保护剂和激活剂。

2)液化工艺：在调好的浆料中加入耐高温伍．淀粉酶，用量为30-40U／g淀粉。将

调配好的淀粉浆乳泵入喷射器，蒸汽直接进入乳液薄层，瞬间达到液化温度使淀粉糊

化、液化。喷射温度105．115"C，控制出料温度为95．97"C。从喷射器中出来的料液，

1S

进入密闭层流罐，在95．98"C条件下保温25．30min。碘试反应显碘本色时，通蒸汽灭

酶。

3)糖化工艺：将淀粉液化液转入糖化釜中用真菌酶和普鲁兰酶协同作用，真菌酶

用量为2．0．8．0U／g淀粉，普鲁兰酶用量为0．3—1．ou／g淀粉，糖化温度55-65"12，糖化时间2．3h，升温至100℃灭酶。

4)浓缩：经节能多效降膜真空蒸发浓缩系统浓缩至固形物含量为60—65％，备用。3．3．3．3酶解条件单因素试验设计

单因素试验设计采用相同的淀粉乳浓度，以DE值作为评价指标，研究不同的pH

值、真菌酶用量、糖化温度和糖化时间对麦芽低聚糖浆DE值的影响。

3．3。3．4响应面试验设计

根据响应面分析Box．Behnken设计法，综合单因素的实验结果，选取真菌酶用量、

糖化温度、糖化时间作为考察因素，分别以Xl、x2、X3表示；每一个自变量的低、

中、高实验水平分别以-l、0、1进行编码：选择pH 5．9、普鲁兰酶用量1．0眺淀粉；对酶解条件进行优化实验，实验设计见表3-1。

表3-1试验因素水平及编码

!生!堕：!!堑璺!!曼变垒!!坚!!也坐!堡!巳旦坠些!坚堕!堡垒箜l鲤

变量因素水平

3．3．3．5数据分析

采用F检验对实验数据进行方差分析以评价模型的统计意义，数据分析软件采

用Design Expert 7．0。

3。3。4 HPAEC．PAD法分析麦芽低聚糖浆的组分

1)色谱条件：

色谱柱：CarboPac PA．100分析柱(2mmx250mm)和保护柱(2×50 mm)；检测

器：脉冲安培检测器(PAD)，Au工作电极，Ag／AgCl参比电极：柱温：30。C：进样体

积：20“L：流动相：A：200mmol／L氢氧化钠；B：Imol／L乙酸钠；流速：0．25ml／min；

氢氧化钠和乙酸钠梯度洗脱。

16

2)绘制标准品谱图【67】

称取色谱级葡萄糖(G1)、麦芽糖(G2)、麦芽三糖(G3)、麦芽四糖(G4)、麦

芽五糖(G5)、麦芽六糖(G6)、麦芽七糖(G7)标准品各10．0mg，用超纯水分别溶

解定容至lOmL，配制成lmg／mL的储备液。吸取一定量的储备液按表3．2配制成麦

芽低聚糖标准混合使用液。经用0．22ttm的水系滤膜过滤后进样。

表3-2麦芽低聚糖标准液的配制

标准物质G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7

吸取量，mL O．10 O．10 0．20 0．30 0．40 0．50 1．OO

定容体积，mL 10

应用液浓度，u g／mL 10 10 20 30 40 50 100

3)样品检测

取制备的麦芽低聚糖浆混合物，离心除蛋白质等杂质后，用去离子水稀释至

1001．tg／mL，经0．22p．m的水系滤膜过滤后进样。

3．4磷酸寡糖的分离纯化研究

由于磷酸基团以共价键形式结合在葡萄糖残基上，所以磷酸寡糖分子带有负电

荷。因此，可以通过阴离子柱层析的方法除去麦芽低聚糖浆中不带电荷的中性糖，分

离纯化出磷酸寡糖。

3．4．1 Chitopearl BCW-2501阴离子交换树脂的结构及交换原理

H 甲I H 甲I H3 甲H3

-

I

-

cH2一CH—cH2一哗+．(cH幽一_+_cH2一cH—CH2一OH

l I I l

OH CH3 CH3 OH

图3-I Chitopearl BCW-2501单元的分子结构【删

Fig．3．IMolecular structure ofthe monomeric unit ofChitopearl BCW-250116|l

Chitopearl BCW-2501阴离子交换树脂的单元结构由三部分组成：由壳聚糖构成

不溶性的三维空间网状骨架：羟基及季胺基团为连接在骨架上的功能基团：OH’为功

能基团所带的相反电荷的可交换离子【68】。Chitopearl BCW-2501骨架上带的季胺基团能解离出阴离子OH。，与糖溶液中的带负电荷的磷酸根进行交换，从而将磷酸寡糖吸

附在树脂上，与中性糖分离开，再用高离子强度的盐溶液将其洗脱下来。

17

3．4．2层析柱的制备与上样∽l

实验中采用湿法装柱。将3．0cmx60cm的层析柱垂直固定，加水至柱体积的1／2

高度，缓慢连续地加入树脂，同时保持层析柱下端出口处于打开状态，使树脂在柱中

均匀地沉积至适当高度。装柱时要保持速度均匀，以避免产生断层及气泡。然后用大

量0．02mol／L乙酸．乙酸钠缓冲液(pH=4．5)将树脂填料平衡24h。

用移液枪吸取5mL根据方法3．3．4制备的麦芽低聚糖浆样品(固形物含量为65％)，

均匀地加入层析色谱柱中，同时打开流出口，使样品渗入到床层中。当样液液面稍高

于填料液面时，关上流出口，加入去离子水，增高液面，反复几次，至样品完全进入

树脂床层，开始洗脱。

3．4．3中性糖的洗脱

麦芽低聚糖浆中的中性糖部分由于不含有磷酸基团，不带电荷，所以不能被吸附

在阴离子交换树脂上。取DE值为36％、固形物含量65％的麦芽低聚糖浆5mL上样。

以0．02mol／L乙酸．乙酸钠缓冲液(pH=4．5)作为洗脱剂，控制洗脱速度在1．2mL／min，用自动收集器收集洗脱液，固定相同时间收集一管。采用苯酚一硫酸法【65】检测洗脱液

中的总糖含量。最后合并出峰部分。经旋转蒸发仪浓缩后，取部分样品测定其中的磷

含量。

3．4．4洗脱液浓度的选择‘

中性糖洗脱完毕后，以含有NaCI的0．02mol／L乙酸．乙酸钠缓冲液(pH=4．5)洗

脱磷酸寡糖。改变洗脱液中NaCl的浓度，考察其对磷酸寡糖的洗脱效果的影响。实

验中分别考察含0．1m01／LNaCl，0．2 mol／INaCl，O．3 mol／LNaCl，0．4 mol／LNaCI，0．5

mol／LNaCl，0．6 mol／LNaCl，1．0tooⅥNaCl的乙酸．乙酸钠缓冲液对磷酸寡糖的洗脱效

果。洗脱速度：1．2mL／min，10min收集一管。苯酚—硫酸法165]检测总糖含量，并以吸

光度为纵坐标，洗脱管数为横坐标，绘制洗脱曲线。

3．4．5磷酸寡糖的脱盐处理

采用含NaCI的缓冲液液洗脱磷酸寡糖时，所得的洗脱液中含有大量的NaCI，影

响磷酸寡糖后续的相关分析测定。透析袋脱盐法由于所用的时间较长且不能大规模应

用，因此不适用于磷酸寡糖的生产。而以麦芽低聚糖为主要组分的磷酸寡糖，分子量

约在600---3000范围内，远大于NaCl。因此，实验中采用葡聚糖凝胶柱(G．10)脱

盐的方法对磷酸寡糖进行脱盐纯化处理。

凝胶柱脱盐的原理【70】为：凝胶层析时根据分子大小不同的一种纯化物质的方法。

以凝胶为固定相，以水为流动相，样品溶液流过层析柱，小分子通过扩散作用进入凝

胶颗粒内部，而大分子则被排阻于颗粒之外。大分子行程短且速度快，小分子行程长

且速度慢。因此，大小分子向下移动的速度发生差异而将大小分子分离开来。实验中

用1％AgN03溶液检测洗脱液中是否含有氯离子，以判定脱盐效果。

3．5磷酸寡糖的组分分析方法

3．5．1磷酸寡糖的脱磷处理【I列

磷酸基团是以共价键的形式结合在磷酸寡糖分子中的葡萄糖残基上，影响磷酸寡

糖的定性分析，因此，在进行组分分析前需将磷酸基团除去。碱性磷酸酯酶在一定条

件下，可以将磷酸寡糖分子中葡萄糖残基上的磷酸酯键水解，除去磷酸基团，且反应

条件温和，不破坏寡糖分子结构。

取制备的磷酸寡糖粗品400)tL，含有10mM MgCl2的Tris—HCI缓冲液(pH=9．0)

909L，0．4U／J_tL的碱性磷酸酯酶10p．L，分别加入1．5ml道夫管中，37"C条件下反应

36h。然后置于超滤离心管(3KD)中离心去除碱性磷酸酯酶，转速6000r／min，时间．5．2高效阴离子交换色谱(黜20min。3

C．PAD)定性分析磷酸寡糖

1)色谱条件：

色谱柱：CarboPac PA．200分析柱(3mm×250mm)和保护柱(3mmxS0mm)；检

测器：脉冲安培检测器(PAD)，Au工作电极，Ag／AgCl参比电极；柱温：30"C；进样

体积：20此；流动相：A：100mmol／L氢氧化钠；B：lmol／L乙酸钠；流速：0．25ml／min；

氢氧化钠和乙酸钠梯度洗脱。洗脱条件如下表所示：

表3．3梯度洗脱条件

时问。rain 流速，ml／min 流动相。％曲线，CUI'VC

A B

2)绘制标准品谱图

标准品的配制同方法3．3．6，糖检测波形见表3．4所示。

表3．4糖检测波形

时间，scc 电位，V 积分时问，scc 电位，V 积分

O．oo+0．10 0．42 ·2．00

O．20 +o．10 开始0．43 +0．60

0．40+O．10 结束0．44 ·0．10

0．41 ．2．oo O．50 -O．10

19

3)样品检测

取制备的磷酸寡糖粗品，用去离子水稀释至lOI-tg／mL，经0．229m的水系滤膜过

滤后进样。

3．6磷酸寡糖的结构分析方法

3．6．1磷酸寡糖的冷冻干燥

取经过脱盐纯化后的磷酸寡糖溶液，放入玻璃培养皿，厚度为2．3mm。然后置于

一20"12冰箱中预冻7．8d,时，使其迅速冷却到共晶点温度以下。打开真空冷冻干燥机，待真空度达N5．5Pa、冷阱温度在．7012以下时，将冷冻到共晶点温度以下的磷酸寡糖放入干燥室内，冷冻干燥24小时，制得粉末产品。

3．6．2红外光谱分析

红外吸收光谱分析(瓜)依据的信息主要是分子内部原子间的相对振动(分子振

动)，以及分子转动的特征信息。在化合物红外光谱图上，吸收峰越大，说明化合物

对这区域光吸收越强。而对每一个化合物来说，在哪些波数可产生吸收峰是与其化学

结构，特别是官能团密切相关的【7I】。通过化合物的红外光谱图，确定含哪些官能团，进一步确定化学结构。

’取冻干的磷酸寡糖样品，通过溴化钾压片法进行红外光谱分析。通过红外光谱图

中糖类物质和磷酯键的特征吸收峰，对磷酸寡糖的化学结构进行分析。

3．7磷酸寡糖得率的计算方法

磷酸寡糖％=(麦芽低聚糖浆总糖含量／磷酸寡糖总糖含量)X 100％

4结果与分析

4．1淀粉原料的筛选

4．1．1分光光度法吸收波长的选择

在分光光度法中，吸收波长的选择对测定结果的准确度和精密度都有很大影响。

姜元荣、王庆林等分别选用680 nm、690 nm等作为吸收波长137．72]。但GBl2092．89

中采用的吸收波长为825 nlnf3们。一般来说，样品的最大吸收峰处应为检测时所选择的吸收波长，避免样品中其它杂质的干扰。因此，研究中对磷标准液进行了全波段扫

描以确定其最大吸收波长。图4．1是以空白样为参比样，对作标准曲线时磷含量401．tg 的一个样品从420．950 nln进行全波段扫描所得的谱图。由图可以看出，其最大吸收

值位于825 nm处。因此，实验中采用825 nm作为测定波长。

Abs

图4．I磷标准液全波段扫描图

Fig 4-l Full Sc锄of authentic phosphorus

4．1．2磷标准曲线的绘制

以磷酸二氢钾作标准，其磷含量与吸光度在0．40嵋范围内符合比尔定律。标准曲

线的回归方程为：Y=O．0176x．0．0015，相关系数R2=0．9999，回归效果显著。

2l

ABS

O．8

O．6

o．4

o-2

O

0 10 20 30 40 50

磷含t(gg／mL)

图4-2磷含量与吸光度标准曲线

Fig 4-2 Standard curve among phosphorus content and absorbance

4．1．3精密度及回收率实验

根据方法3．2．2及3．2．3对市售马铃薯淀粉样品中的磷含量进行分析研究，并采用外标法在处理样品时外加磷酸盐进行回收率测定，结果见表4．1。

衰4-1马铃薯淀粉样品中磷含量的精密度及回收率结果分析

!呈!!曼兰：：垫曼丝：21坚坚兰Z驾璺竖2：型21 2＆2§也2磐12唑璺!i2 P21签2：塑!!

总磷(mg／Kg) 游离磷变异1日I收率

测定次数分光光度变异回收率lcF ．A藤厂—委■事—面砭r(mg／

Kg) 系数

法系数法系数

汪：1日：取磷酸二氢钾439．4mg．(吉霹100mg)·帑解定容至100mL·取I mL(古磷l mg)为外加磷．

由表4．1可以看出，在淀粉磷酸酯结合磷含量的分析研究中，ICP．AES法与分光

光度计法的精密度及回收率均较高，但分光光度计法精密度稍高于ICP．AES法。但ICP．AES法易受原料中其它无机离子谱线的干扰，使测定结果产生较大的误差，且操作成本较高。因此，综合考虑，实验中选用分光光度法作为原料筛选的分析方法。4．1．4不同样品中结合磷含量的分析研究

根据方法3．2．2及3．2．3分别对5种市售淀粉磷酸酯的总磷及游离含量进行测定，通过方法3．2．4计算出结合磷含量。每个试样平行3次，取平均值，结果见表4．2。％％％％％％

5●7

5

3

％∞孵卯舛粥6

％

B屹￡!B

№m哪m螂蚴姒㈣肌嬲m言暑册％溉麒％n眨

％

3

5

2

O

8

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％

5

O

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3

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5

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2

饥掰粥渤8蹴m

表4-2不同淀粉磷酸酯的结合磷含量结果分析

一一．．!!坐兰：Z垦箜竺坠21 P垒2：业2磐12翌!121也gi垡韭坐P12：￡!坠箜!!墼! ．

样品重复(mg／Kg) 均值(mg／Kg) 相对平均偏差标准偏差

表4-3方差分析结果

坠坦!：j竺呈丝：21：璺塑笠f型Q坚2

变异来源自由度平方和均方F值Fo．ol

由表4．3可以看出，方差分析结果：F=1082．49>F0．01，表明不同淀粉磷酸酯的结

合磷含量存在极显著差异。而SAS多重比较结果表明，2撑与5#N差异不显著(P>0．05)，其余试样间均存在显著差异(P<0．05)。

1撑与2拌均为马铃薯淀粉(注：是结合磷含量最高的天然淀粉磷酸酯)，其含量差

异显著，可能是由品种差异所致。因在一定程度上，马铃薯品种及种植条件的不同，其结合磷含量亦差异很大。而3撑、4撑、5撑均为淀粉磷酸酯，理论上其结合磷含量应显著高于原淀粉(马铃薯淀粉)，但由表4．2可以看出它们的结合磷含量均较低，不

适于磷酸寡糖的生产。

4．2磷酸寡糖前体一低DE值麦芽低聚糖浆制备工艺的优化

4．2．1还原糖标准曲线的绘制(DNS法)

按实验方法3．3．2．1绘制还原糖标准曲线，见图4．3。由图可以看出，还原糖含量

与吸光度在0---8mg／mL质量浓度范围内符合比尔定律，此标准曲线的回归方程为：Y=0．2613X+0．014，相关系数R2=0．9996。

O 2 4 6 8

还糖含量(mg／mL)

图4-3还原琚标准曲线

Fig．4-3 st锄dard CBINC of reducing sac圮harides

4．2．2总糖标准曲线的绘制

根据方法3．3．3绘制总糖标准曲线，见图4．4。由图可以看出，总糖含量与吸光

度在O---40“g／mL质量浓度范围内符合比尔定律，此标准曲线的回归方程为：

Y=O．0182x．0．0005相关系数(R2=0．9999)，回归效果显著。

YtO．0182x·0．0005

O 10 30 40

糖含量(pg／mL)

圈4-4总括标准曲线

Fi94-4 StaIldard cllrvc oftotal saccharidcs

4．2．3酶解条件单因素实验分析

预实验结果表明：在淀粉浆质量分数15％，耐高温Q．淀粉酶用量35u／g条件下，

喷射液化，98"C保温30min即液化完全。此时立即降温结束液化工艺，液化DE值均

控制在12．15范围内，相关因素的影响作用不显著。因此，实验中仅考察糖化过程中酶解条件对DE值的影响作用。

4．2．3．1 pH值对DE值的影响

为考察pH值对DE值的影响，实验中固定淀粉浆质量分数15％，耐高温0【．淀粉酶

酶卫

石

o

2

o

触仉

n

m

仉

用量35U／g，真菌酶用量5．0U／g，普鲁兰酶用量1．0U／g，酶解温度60"C，酶解I'tj．1130min，

不同pH值对DE值的影响见图4—5。

55

50

45

趔40

山

口35

30

25

20

4．7 5．1 5．5 5．9 6．3 6．7 7．1 7．5

pH值

图4·5 pH僵对DE僵的影响

Fig 4-5．Effects ofpH on DE Values

由图4．5可以看出，随着pH值的增加，DE值呈先增加后又降低的趋势。当

pH低于5．9时，DE值随着pH值的增加而增加，在pH值5．9时DE值达到最大。

当pH值继续增加，DE值则呈下降趋势，这与酶的自身性质有关，即酶在一定的

pH值范围内表现出最大活力，pH值过高或过低均会改变酶的活性中心构像，甚

至改变整个酶分子的结构使其变性失活。耐高温a．淀粉酶及真菌酶的最适pH值均

在5．5—7．0范围内。因此，本实验选用的pH范围为5．9．6．3。

4．2．3．2真菌酶用量对DE值的影响

为考察酶用量对DE值的影响，实验中固定淀粉浆质量分数15％，耐高温a．淀粉酶

用量35U／g，pH值5．9，普鲁兰酶用量1．0U／g，酶解温度60"12，酶解时I'a-J130min，不同

酶用量对DE值的影响见图4．6。

55

50

45

j粤40

山

口35

30

25

20

2 8 ll “ 17 20

酶用量(u／g)

图4-6翼西酾用量对DE僵的影响

Fig 4-6．Effects ofamount ofFungal Amylase On DE Value

从图4—6可以看出，随着真菌酶用量的增加，淀粉的水解速率加快，DE值不断上

升。真菌酶的作用机理为：水解直链淀粉及支链淀粉中的a．1，4．糖苷键，产生葡萄糖、

麦芽糖及低聚糖。当酶用量为2．0．8．0U／g时，DE值较低，且比较接近30．40的范围。随

着酶用量的继续增加，DE值持续上升，淀粉水解生成的葡萄糖量不断增大，低聚糖

含量降低，不利于磷酸寡糖的生产。因此，本实验选用真菌酶用量的范围为2．0-8．ou ／g。

4．2．3．3糖化温度对DE值的影响

为考察糖化温度对DE值的影响，实验中固定淀粉浆质量分数15％，耐高温0【．淀粉

酶用量35U／g，pH值5．9，普鲁兰酶用量1．OU／g，真菌酶用量5．ou／g，酶解时间130min，不同温度对DE值的影响见图4．7。

55

50

45

j四40

∞

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/eq1q.html