2020版《中国药典》液相色谱法检验操作规程(USP)

一、目的：

制订详尽的工作程序，规范检验操作，保证检验数据的准确性。

二、范围：

本操作规程适用于参考美国药典标准检验品种液相色谱法的测定。

三、职责：

1、检验员：严格按操作规程操作，认真、及时、准确地填写检验记录；

2、化验室负责人：监督检查检验员执行本操作规程。

四、内容：

1、简述：液相色谱一词，如本纲要中所用，是高压液相色谱和高效液相色谱的同义词。LC是一种基于固体固定相和液体流动相的分离技术。

2、固定相：根据所用的固定相的类型，通过分配、吸附或离子交换过程实现分离。最常用的固定相是改性二氧化硅或聚合物珠。通过添加长链烃类来修饰珠粒。完成分析所需的具体包装类型由各个专著中的“L”指定表示（另见下面的色谱柱部分）。珠子的大小通常也在专著中描述。包装类型和尺寸的变化包括在本章的系统适用部分中。

3、色谱柱：

3.1术语柱包括不锈钢、内衬不锈钢和聚合物柱，用固定相填充。柱子的长度和内径影响分离，因此典型的柱子尺寸包括在单独的专著中。在本章的系统适配部分中讨论了列尺寸的变化。简编专著不包括适当专栏的名称；这种省略避免了出现对供应商产品的认可和市场中的自然变化。请参阅色谱柱以获取更多信息。

3.2在LC程序中，除另有规定外，保护柱可按下列要求使用：(a)保护柱的长度必须是分析柱长度的NMT15%，(b)内径必须等于或小于分析柱的内径，(c)填料应与分析柱(例如，二氧化硅)相同，并含有相同的结合相(例如，C18)。在任何情况下，在正式程序中规定的所有系统适用性要求必须安装在保护柱上。USP-NF测试和测定中使用的填料（L）、相（G）和载体（S）的完整列表位于USP-NF和PF、试剂、指示剂和溶液-色谱柱中。该列表旨在为色谱学家在识别个别专著中指定的相关色谱柱时提供方便的参考。

4、流动相：流动相是溶剂或溶剂混合物，如在专著中所定义的。

5、装置：液相色谱仪由包含流动相的储液器、在高压下迫使流动相通过系统的泵、将样品引入流动相的注射器、色谱柱、检测器和数据收集装置组成。

6、梯度洗脱：在色谱过程中连续改变溶剂组成的技术称为梯度洗脱或溶剂编程。梯度洗脱曲线在单独的专著中作为梯度表提出，其中列出了流动相在规定时间的时间和比例组成。

7、程序：

7.1用流动载气平衡柱、注射器和检测器，直到接收到恒定信号。

7.2通过注射器隔片注射样本，或使用自动采样仪。

7.3开始温度程序。

7.4记录色谱图。

按规定作分析。

8、色谱图的定义和解释：

8.1色谱图：色谱图是检测器响应、流出物中分析物浓度或作为流出物浓度相对于流出物体积或时间的度量的其他量的图形表示。在平面色谱中，色谱可指具有分离区的纸或层。

8.2如Figure 1表示两种物质1和2的典型色谱分离。对于峰1，tR1和tR2是各自的保留时间；h是高度，h/2是半高度，Wh/2是半高度处的宽度。W1和W2是基线处的峰1和2的各自宽度。空气峰是气相色谱的特征，对应于LC中的溶剂前沿。这些空气峰的保留时间，或未保留的成分，被指定为TM。

Figure 1：两种物质的色谱分离

8.3闭合容积（D）：也被称为闭合的体积，是洗脱液相遇点和柱顶之间的体积。

8.4保持时间（TM）：保持时间是洗脱未保留组分所需的时间。（参见Figure 1，在基线中显示的空气或未滞留的溶剂峰，）。

滞留体积（VM）：滞留体积是洗脱未保留组分所需的流动相的体积。它可以从保持时间和流速f计算，用mL/min：

VM=tM×F

在排阻色谱法中，使用符号VO。

理论板数（N）:N是柱效率的量度。高斯提出它是由：

N=16(tR/W)2

其中，tR是物质的保留时间，W是其底部的峰宽，这是通过将峰的相对直边外推到基线而获得的。N值取决于被色谱的物质以及操作条件，例如流动相或载气的流速和温度、填料的质量、填料在柱内的均匀性，以及毛细管柱的厚度、固定相膜的厚度和柱的内径和长度。在使用电子积分器的情况下，通过方程可以方便地确定理论板的数目：

其中W h／2是半高度的峰值宽度。然而，在争议的情况下，只有基于峰值宽度在基线的方程将被使用。

峰：峰是从柱中洗脱单个组分时检测器响应的色谱记录部分。如果分离不完全，则可以将两个或更多个组分洗脱为一个未分解的峰。

8.5峰-谷比（P/V）：当两个峰之间没有达到基线分离时，p/v可被用作相关物质测试的系统适应性标准。如Figure 2，表示两种物质的部分分离，其中H P是在小峰的外推基线之上的高度，H V是在分离次要和主要峰的曲线的最低点处的外推基线之上的高度：

p/v= H p/H v

Figure2：峰谷比的测定

相对延迟（R ret）：相对延迟是分析物行进的距离与参考化合物同时行进的距离的比率（参见Figure 3），并用于平面色谱。

Figure3：典型的平面色谱法

8.6相对保留(r)1：在相同条件下获得的组分相对于另一组分的调整保留时间的比率，用作参考：

r=t R2t M/t R1t M

其中t R2是从感兴趣化合物的注射点测得的保留时间；t R1是从用作参考的化合物的注射点测得的保留时间；t M是在该程序中定义的非保留标记的保留时间，均在同一柱上的实验条件。

8.7相对保留时间（RRT）：也称为未调节相对保留。在USP中通常是在未经调整的相对保留条件下进行的，除非另有说明。

RRT=t R2/t R1

符号r G也用于指定未调整的相对保留值。

相对标准偏差百分率：

8.8延迟因子（RF）：延迟因子是斑点中心移动的距离与流动相同时移动的距离的比值，用于平面色谱。使用Figure 3中的符号：

R F=b/a

8.9保留因子（K）1：保留因子也称为容量因子(k)。定义为：

K=固定相物质量/流动相物质含量

K=固定相分离时间/流动相分离时间

组分的保留因子可以从色谱图中确定：

k=(t R-t M)/t M

8.10保留时间（Tr）：在液相色谱中，保留时间tR被定义为样品注射到洗脱样品区出现最大峰值响应之间的时间。TR可以用作识别的参数。

色谱保留时间是它们所代表的化合物的特征，但不是唯一的。样品和参考物质的保留时间的重合可以用作构建身份简档的部分标准，但是其本身可能不足以建立身份。给定化合物的绝对保留时间可以从一个色谱图变化到下一个色谱图。

8.11保留体积（VR）：保留体积是用于洗脱组分所需的流动相的体积。它可以从保留时间和流速在mL/min中计算：

V R=t R×F

8.12 R S分辨率：分辨率是混合物中两个组分的分离，计算为：

R S=2×(t R2-t R1)/(W1+W2)

其中，t R2和t R1是两个组分的保留时间，W2和W1是通过将峰的相对直边外推到基线而获得的峰基处的对应宽度。

在使用电子积分器的情况下，通过方程可以方便地确定分辨率：

R S=1.18×(t R2-t R1)/(W1,h/2+W2,h/2)

8.13分离因子(α)：分离因子是对两个相邻峰计算的相对保留度(按照惯例，分离因子的值总是>1)：

α=k2/k1

8.14对称因子（AS）2：峰的对称因子，也称尾部因子（Figure 4）是通过以下来计算的：

A S=W0.05/2f

其中，W0.05是在5%高度处的峰值的宽度，f是从峰值最大值到峰值前沿的距离，该距离是在峰值高度的点5%处从基线测量的。

Figure4：不对称色谱峰

8.15 拖尾因子（t）：见对称因子。

9、系统适用性

9.1系统适合性测试是液体色谱方法的一个组成部分。这些试验用于验证色谱系统对于预期的分析是足够的。

9.2测试基于这样的概念，即设备、电子、分析操作和分析的样品构成可被这样评价的积分系统。

9.3可能影响色谱行为的因素包括：

9.3.1流动相的组成、离子强度、温度和表观pH值

9.3.2流速、柱尺寸、柱温和压力

9.3.3固定相特性，包括色谱载体类型（颗粒基或整体）、颗粒或大孔尺寸、孔隙率和比表面积。

9.3.4反相和其他表面改性的固定相，化学修饰的程度（如端盖、碳负荷等）。

9.3.5分辨率，Rs，是理论板数，n（也称为效率），分离因子，和容量因子，K。[注：所有的术语和符号都在前面的部分定义和色谱图的解释中定义。对于给定的固定相和流动相，可以指定N，以确保紧密洗脱的化合物彼此分离，建立系统的一般分辨率，并确保从药物中分离出内部标准。这是一个不可靠的方法来确保分辨率比直接测量。柱效率在一定程度上反映了峰值锐度，这对于痕量组分的检测是很重要的。

9.4对标准制剂或其他标准溶液的重复注射进行比较，以确定是否满足精度要求。除非个别专著中另有规定，否则如果要求为 2.0%或更小，则使用来自分析物的五次重复注射的数据来计算相对标准偏差%RSD；如果相对标准偏差要求为m，则使用来自六次重复注射的数据。矿石大于2%。

9.5对于药物物质专著中的测定，其中纯物质的值为100%，并且没有说明最大相对标准偏差，对于参考溶液的一系列注射计算最大允许%RSD：

%RSD=KB√n/t90%,n-1

其中K是常数（0.349），由表达式K= (0.6/√2)× (t90%,5/√6)得到，其中0.6/√2表示B=1.0注射6次后所需的相对标准偏差百分比；B是在个体专著的定义中给出的上限-100%；n 是数字；参考溶液的重复注入(3≤n≤6)，t90%,n-1是学生在90%概率水平（双面）上的n-1自由度。

9.6除非另有规定，允许的最大相对标准偏差不超过可重复性要求表中给出的适当值。此要求不适用于相关物质的测试。

相对标准偏差要求

9.7对称因子AS是峰对称性的度量，对于完全对称的峰是统一的；并且它的值随着尾随变得更加明显（参见Figure 4）而增加。在某些情况下，可以观察到小于1的值。由于峰值对称性偏离了1的值，因此，积分和精度变得不那么可靠。

9.8信噪比（S/N）是一个有用的系统适用性参数。S/N的计算如下：

S/N=2H/h

其中，H是从峰值顶点到基线所测量的峰值的高度，在距离上外推到半高处的峰值宽度的5倍；h是在距离上观察到的最大噪声值和最小噪声值之间的差，距离是峰值的半高处的宽度的5倍，并且，如果可能的，同样位于等高峰的周围（见Figure 5）。

Figure5：噪声和色谱峰，S/N比的组成部分

这些系统适应性测试是通过从单个专著中指定的标准溶液或其他溶液的重复注射中收集数据来执行的。

9.9除却专著中的参数规定外，还可使用其他合适的操作条件。

为了满足系统的适宜性要求，对指定的色谱系统进行调整可能是必要的。为符合系统适用性要求而对色谱系统进行的调整不能用于补偿色谱柱故障或系统故障。只有在适合性试验中使用的所有化合物都有合适的标准(包括参考标准)时，才允许进行调整；调整或柱改变产生满足程序规定的所有系统适应性要求的色谱图。

9.10如果为了满足系统适应性要求而需要调整操作条件，则除另有规定外，否则下列清单中的每一项都是可以考虑的最大变化；这些变化可能需要额外的验证数据。为了验证该方法在新条件下的适用性，评估可能受变化影响的相关分析性能特征。多次调整会对系统性能产生累积影响，在实现之前需要仔细考虑。在某些情况下，可能希望使用与程序规定的那些尺寸不同的HPLC柱（不同的长度、内径和/或粒度）。无论哪种情况，固定相的化学特性（“L”指定）的改变将被认为是对该方法的修改，并且需要完全验证。梯度洗脱中流动相组成的调整可能导致选择性的改变，不推荐使用。如果需要进行调整，则允许改变塔填料（保持相同的化学性质）、初始等容保持时间（当规定时）和/或停留体积调整。在下面的文本中注意到梯度调整的附加余量。

9.11流动相的pH值（HPLC）：用于制备流动相的水性缓冲液的pH可调节到指定值或范围的±0.2单位内。适用于梯度和等度分离。

在缓冲液中的盐浓度（HPLC）：如果满足pH值的变化（见上文），在制备用于流动相的水性缓冲液中所用的盐的浓度可以调节到±10%以内。适用于梯度和等度分离。

9.12流动相组分比例（HPLC）：以下调整限值适用于流动相的次要组分（指定为50%或更少）。这些组分的量可以通过±30%相对调节。然而，任何分量的变化不能超过±10%绝对值（即，相对于总移动相位）。可以调节三元混合物中的一个次要组分。下面给出了二元和三元混合物的调整实例。

9.13二元混合物

规定比例50∶50，50的30%的绝对值为15%。，但这超出了任一分量绝对±10%绝对允许变化。因此，移动相位比只能在40:60-60:40的范围内进行调整。

规定比例2∶98，2的30%的绝对值为0.6%。因此，最大允许调整在1.4∶98.6–2.6∶97.4的范围内。

9.14三元混合物

规定比例60:35:5，对于第二组分，35%的30%是10.5%的绝对值，这超过了任何组分±10%

的绝对值的最大允许变化。因此，第二组分只能在25%—45%绝对值范围内进行调节。对于第三个分量，5的30%是绝对的1.5%。在所有情况下，使用足够数量的第一组分来给出总共100%个。因此，50:45:5–70:25:5 o或者 58.5: 35: 6.5–61.5: 35: 3.5 的混合物范围将满足要求。

9.15紫外-可见光检测器（HPLC）的波长：不允许偏离过程中指定的波长。由探测器制造商指定的过程或另一个验证的过程，用于验证检测器波长中的误差最多±3纳米。

9.16固定相

9.17柱长（HPLC）：见下面的颗粒大小（HPLC）。

9.18柱内径（HPLC）：线性速度保持恒定时可调节。见下面（HPLC）流速。

9.19颗粒大小（HPLC）：对于等度分离，只要柱长（L）与粒径（dp）的比例保持恒定或在规定L/dp比在-25%至+50%之间，可以修改柱的颗粒大小和/或长度。或者（关于对表面多孔颗粒应用粒度调整），如果理论板（N）的数量相对于规定柱在-25%至+50%以内，则可以使用L和dp的其它组合。当调整结果导致更大数量的理论板产生较小的峰体积时，应谨慎。这可能需要调整以最小化由于仪器管道、检测器单元体积和采样率以及注入体积等因素引起的柱外带展宽。当专著中没有提到粒径时，必须使用USP列定义中的最大粒径来计算该比率。对于梯度分离，长度、柱内径和颗粒尺寸的变化是不允许的。

9.20流速（HPLC）：当颗粒大小改变时，流速可能需要调整，因为较小的颗粒柱对于相同的性能（如通过降低板高度测量的）将需要较高的线速度。柱直径和粒径变化的流速变化可由：

F2=F1×[(dc22×dp1)/(dc12×dp2)]

其中F1和F2分别是原始条件和修改条件的流速，d c1和d c2是各自的柱直径，d p1和d p2是颗粒尺寸。

当在等度分离中，≥3-μm 至＜3-μm颗粒发生变化时，在线性速度的额外增加(通过调节流速)是合理的，条件是塔效率不会下降20%以上。类似地，＜3-μm 和≥3-μm颗粒改变时可能需要进一步降低线速度（流速），以避免柱效率降低20%以上。梯度分离不允许F、DC 和DP的变化。

此外，流量可调节±50%（仅等度分离）。

例子：调整柱长、内径、粒度和流速可以结合起来使用，以给出等效条件（相同的N），但压力和运行时间不同。下表列出了一些更流行的列配置，通过调整这些变量来提供等效效率（N）。

例如，如果专著中规定150mm×4.6mm；5-μm的柱在1.5mL/min下操作，用 75mm×2.1mm；

2.5-μm的柱在1.5mL/min×0.4=0.6mL/min下操作的可以预期得到相同的分离，同时压力增加约4倍，运行时间减少到原来的30%。

9.21注射体积（HPLC）：注射体积可根据它可接受的精度，线性和检测限度调整。注意，过量的注入体积会导致不可接受的带展宽，导致N和分辨率降低。适用于梯度和等度分离。

9.22柱温（HPLC）：柱温可调节±10°。建议采用控制柱温以提高保留时间的控制和再现性。适用于梯度和等度分离。

9.23除非另有规定，否则从分析物峰确定系统适宜性参数。

样品物质的Rr、R F或t R的测量值与参考化合物和混合物获得的值相差不超过从参考化合物的重复测定中统计确定的可靠性估计。在信息专著中可以提供相对保留时间，以帮助峰值识别。没有适用于相对保留时间的接受标准。

9.24适用性测试用于确定最终操作系统的有效性，它应该接受这个测试。根据需要注射适当的制剂，以便在整个过程中证明适当的系统适用性（如专著中方法的色谱系统部分所述）。

该制剂可以是标准制剂或含有已知量的分析物和用于控制分析系统的任何附加材料（例如，赋形剂或杂质）的溶液。每当色谱系统（设备、流动相组分或其他组分）或关键试剂发生显著变化时，就需要重新建立系统的适用性。没有样品分析是可接受的除非系统的适用性已经被证明。

10、定量：

10.1在定量过程中，忽略溶剂和试剂引起的峰或由流动相或样品基质产生的峰。

10.2在线性范围内，峰面积和峰高通常与化合物洗脱量成正比。峰面积和峰高通常由电子积分器测量，但是可以通过更经典的方法来确定。峰值区域通常被使用，但如果峰值干扰发生，则可能不那么精确。测量的成分与任何干扰成分分离。峰值尾部和前端被最小化，并且在可能的情况下避免在其它峰的尾部上测量峰值。

10.3尽管优选将杂质峰与标准品的色谱图中具有相似浓度的峰进行比较，但是杂质测试可以基于对杂质引起的峰响应的测量，并以药物峰面积的百分比表示。该标准可以是药物本身，在对应于例如0.5%杂质的水平上，假定类似的峰值响应。当必须以更大的确定性确定杂质时，使用杂质本身的标准或基于杂质相对于主要组分的响应应用校正因子。10.4外部标准方法：通过将样品溶液得到的响应和标准溶液得到的响应进行比较，确定定量组分的浓度。

10.5内标法：将等量的内标引入样品溶液和标准溶液中。选择内部标准使其不与测试材料反应，稳定，从定量(分析物)的组分中分离出来，并且不包含与分析物保留时间相同的杂质。分析物的浓度是通过将样品溶液中的峰面积或峰高与内标物的比值与标准溶液中的峰面积或峰高与内标物的比值进行比较。

10.6标准化程序：通过确定相应峰的面积为所有峰的总面积的百分比来计算测试材料组分含量的百分比，不包括由溶剂或试剂或由流动相或样品基质a产生的那些。那些处于或低于可忽略的极限的人。

10.7校准程序：测定或评估信号y与物质x的数量（如浓度、质量）之间的关系，并计算校准函数。分析结果是根据被测信号或分析物的评价信号及其在校准曲线上的位置来计算的。在对两种外部标准方法的杂质进行测试时，当样品溶液的稀释用于比较和标准化程序时，应用专著中指示的任何校正因子(例如，当相对响应因子在0.8-1.2范围之外时)。

10.8当杂质测试规定杂质总量或存在杂质的定量测定时，选择适当的阈值设置和适当的条件以积分峰面积是重要的。在这种测试中，忽略或忽略峰值的极限一般为0.05%。因此，数据收集系统的阈值设置对应于该限制的至少一半。对任何杂质的峰面积进行积分，这些杂质没有完全与主峰分离，最好是通过谷到谷的外推（切向撇去）。

1参数K，N，R，和RG开发用于等温GC分离和等规HPLC分离。因为这些项是热力学参数，所以它们仅适用于在恒温、流动相组成和流速下进行的分离。然而，对于用温度程序或溶剂梯度进行的分离，这些参数可以简单地用作比较手段，以确保存在适当的色谱条件来执行专著中预期的方法。

2通常的做法也是测量不对称因子，作为连接峰顶的垂直线与内插基线和峰前之间的距离的比率，以及该线

定，只有这里给出的公式（AS）是有效的。

五、参考文献：

美国药典

六、相关文件：

N/A

七、相关记录：

N/A

八、变更记录及原因：

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/eome.html