中国药科大学抗体·糖组学 - 图文

抗体——

一.

二．抗体水解

1.木瓜蛋白酶的水解片段

（1）裂解部位：IgG铰链区H链链间二硫键近N端侧切断。 （2）裂解片段：①两个Fab段（抗原结合段） ②一个Fc段（可结晶段） 2.胃蛋白酶的水解片段

（1）裂解部位：铰链区H链链间二硫键近C端切。

（2）裂解片段：①F(ab′)2包括一对完整的L链和由链间二硫键相连一对略大于Fab中Fd 的H链，称为Fd′含235个氨基酸残基；F(ab′)2具有双价抗体活性。 ②Fc可继续被胃蛋白酶消化成更小的片段，失去其生物学活性。 三．抗体的生物学功能

抗体是体液免疫应答中发挥免疫功能最主要的免疫分子； 1特异性地结合抗原 2活化补体

3结合Fc受体，发挥不同的生物学作用 （1）介导Ⅰ型变态反应 （2）调理吞噬作用

（3）发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC效应） （4）通过胎盘 四．抗体的治疗机制

（1）中和作用：用于感染性疾病，使病原体或其产生的毒素丧失致病力。

（2）示踪或导向作用：使与其相连的功能性分子特异性地激活或封闭、破坏靶细胞或靶分子。

（3）竞争性抑制作用/拮抗作用：与体内产生或体外进入的物质结合，阻止其与靶分子作用产生毒性损害。

（4）抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（ADCC）及补体依赖性细胞溶解作用（CDC）

（5）通过内影像作用模拟抗原，使疫苗更具安全性及广泛性 五．鼠源单抗的使用限制

（1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性 （2）半衰期短 （3）靶吸收差

（4）生产复杂，价格昂贵

六．基因工程抗体（Gene Engineering Ab） 鼠单克隆抗体的人源化的两个基本的原则

（1）保持或提高抗体的亲和力和特异性； （2）大大降低或消除抗体的免疫原性。

A.人-鼠嵌合抗体:（Human-mouse Chimeric Ab）用人C区取代鼠C区，可以较好解决鼠 源性单克隆抗体诱发HAMA等不良反应，延长单克隆抗体的半衰期， 改善单克隆抗体的药物动力学。

B.改型抗体:（Human izationAntibody）又称人源化抗体,把嵌合抗体的鼠FR区替换成人 FR区，则可能减少单克隆抗体的免疫原性。

C.小分子抗体:（Small Molecular Ab）完整的抗体分子，相对分子质量较大，难以穿过血 管壁，影响了靶部位对其的摄取。小分子抗体可分为Fab抗体、单链抗体、 单域抗体、超变区多肽等四种。

（1）Fab抗体:抗体的Fab段由重链V区（VH）及CH1功能区与轻链间以 二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。

（2）单链抗体:(Single chain Ab)在重链V区cDNA3′端与轻链V区cDNA5 ′端之间，用一寡聚核苷酸接头（linker，14-25个aa为宜） 连接成单链可变区基因片段，再与相应的载体体外重组，转化 至受体细胞，表达出一具有抗原结合能力的单链抗体多肽。 （3）单域抗体:（Single domain Ab)只有VH 或VL 一个功能结构域.单域抗 体的相对分子质量更小，更容易穿过靶组织，但由于VH单域 抗体不含有VL片段，VH的疏水面暴露较大面积，致使其抗 原亲和力大幅度下降， 非特异性吸附有所增加。

（4）超变区多肽：（hypervariable region polypeptide）只含有一个CDR多肽 的抗体。相对分子质量很小，对组织细胞具有极强的穿透 性，但是由于只含有一个CDR区，它的结合抗原能力是 不完全及不稳定的，且在体内相当不稳定。

D.人源性抗体:（1）噬菌体抗体库:（phage Ab Library）利用基因工程的方法可将全套 人抗体重链和轻链V区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达、分泌， 经筛选后获得特异性抗体，这种技术称为噬菌体抗体库.

PS:噬菌体抗体库技术与传统的杂交瘤技术相比具有明显的优越性：

①简便易行，节省时间； ②筛选的容量大；

③直接得到抗体基因，避免了杂交瘤细胞克隆不稳定的缺点； ④抗体库抗体可用原核细胞表达，无需组织培养，可大大降低单克隆 抗体生产的成本。

（2）Xenomouse（异源性或异基因鼠）:噬菌体抗体库制备的抗体通常为Fab 片段或ScFv抗体，由于没有Fc段，亲和力受到极大影响。Xenomouse 原理就是：将小鼠的全套抗体基因去除，同时将人的大部分轻链、重 链基因插入到小鼠的染色体当中，这样用抗原刺激小鼠时就可以发生人 抗体基因的重排，从而产生人源性抗体。

糖生物学(Glycobiology) ——李谦

1. 糖组（glycome）：是指细胞内所有的糖链（包括糖复合物）。

2. 糖组学（glycomics）：是研究生物中所有糖类化合物的分子结构与生物功能的关系、糖类的生物合成与分解代谢规律、糖类工具酶的基因表达与调控机制以及糖脂、糖蛋白合成与组装机制等的一门学科。

3. 转录因子（transcription factors，TF）：在真核细胞核中，有许多蛋白质能够帮助RNA聚合酶转录RNA。这类蛋白质统称转录因子或转录调节蛋白（transcription regulatory protein）。

4. 反式作用因子（trans-acting factor）：能直接或间接与顺式作用元件相互作用，进而调控基因转录的一类调节蛋白。

5. 顺式作用蛋白（cis-acting protein）：是以顺式作用方式调节基因转录的转录因子。 6. 酵母双杂交系统( Yeast two2hybrid system,Y2H)：是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统。将欲研究的两个目标蛋白的编码序列分别与GAL4的结合域和激活域的编码序列融合,构建成两个杂交系统;再将这两个杂交系统共同转化至含有报告基因的酵母细胞株;若两个目标蛋白发生相互作用,则会使DNA - BD和DNA - AD在空间上靠近进而激活报告基因的表达。

7. 酵母单杂交系统（Yeast one hybrid system ）：酵母单杂交技术是一种研究蛋白质和特定DNA序列相互作用的技术方法。

8. 噬菌体展示（Phage display techniques, PDT）： 其原理是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目的蛋白质与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。 9. 荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer）：

10. 串联亲和纯化（Tandem affinity purification , TAP）：是一种能够快速研究生理条件下蛋白质相互作用、揭示蛋白质复合体相互作用网络的新技术，如今已经成为研究蛋白质组学的一个被广泛采纳的工具。

11. 免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

12. 蛋白质片段互补分析（protein fragment complementation analysis，PCA）：（ 泛素蛋白可以分为两个片段，将编码这两个片段的基因分别与编码“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白的基因在胞质内进行融合表达，如果“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白发生相互作用，则泛素蛋白的两个片段得到重组而形成完整的泛素蛋白。）

13. 化学交联法（chemical cross linking）：化学交联是共价连接不同化学功能基团的技术，是对蛋白质化学修饰的简单延伸。

14. 蛋白质芯片（protein microarray）：蛋白质芯片技术，是DNA芯片技术的扩展，即在固体支持物表面高密度地固定化排列探针蛋白点阵，以特异地捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。

15. 荧光共振能量转移( Fluorescence resonance energy transfer,FRET)：可以在活体细胞生理条件下对蛋白质间的相互作用进行实时的动态研究,已成为现代蛋白质组学研究的有力工具。

16. 融合蛋白pull-down技术：基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。 17. 染色体免疫沉淀技术Chromatin immunoprecipitation （ChIp）：在生理状态下把细胞

内的DNA与蛋白质交联在一起，超声波将染色质打碎后，用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体。只有与目的蛋白结合的DNA片段才能够被沉淀下来 18. DNaseI足迹试验(DNaseI footprinting assay)：DNase I足迹试验是一种鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上结合位点的方法，蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被DNase破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。 19. 凝胶阻滞试验（DNA迁移率变动试验DNA mobility shift assay）：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。

20. SELEX技术(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)：利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体.

糖生物学的研究内容：糖组学的研究远较基因组学、蛋白质组学复杂。目前糖组学关注的焦点是糖蛋白，为了更好地与蛋白质组学相关联，将研究对象锁定为糖肽。研究核心内容为：①分析单物种生物所产生的所有聚糖；② 以糖肽为研究对象确认编码糖蛋白的基因；③结合有效的理化和生化性质，研究糖蛋白糖链的性质。主要分为三大部分：结构糖组学、功能糖组学以及生物信息学，其中结构糖组学主要包括“糖捕获”技术、亲和层析技术等，功能糖组学主要包括微阵列技术等。

糖组学（glycomics）：是研究生物中所有糖类化合物的分子结构与生物功能的关系、糖类的生物合成与分解代谢规律、糖类工具酶的基因表达与调控机制以及糖脂、糖蛋白合成与组装机制等的一门学科。

糖基化（glycosylation） 糖基化是在酶的控制下，蛋白质或脂质附加上糖类的过程。此过程为四种共转译与后共转译修饰的步骤之一，发生于内质网。蛋白质经过糖基化作用之后，可形成糖蛋白。

糖生物学研究的方法：多糖的提取方法 多糖的分离纯化 多糖的分析与结构鉴定

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