trizol LS 试剂使用中文说明书
更新时间:2023-11-16 05:38:01 阅读量: 教育文库 文档下载
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TRIzol LS 试剂(ambion)(中文说明书)
货号 规格 室温贮存 10296-010 100ml 10296-028 200ml
产品描述
TRIzol LS试剂适用于液体样品,如人、动植物、酵母、细菌或者病毒来源的液体样品,提取高质量的总RNA(DNA和蛋白质也可以)全过程只需1小时。TRIzol LS试剂里含有酚、异硫氰酸胍和其它成分,由于在摇匀样品过程中能很有效地抑制RNase活性,所以TRIzol LS试剂能维持RNA完整性。TRIzol LS试剂允许同时处理大量的样品。
TRIzol LS试剂能从一个样品里有序分离提取RNA、DNA和蛋白质。TRIzol LS试剂均质化样品后,加入氯仿,能看见分层现象,上层是透明的含RNA的水相,中间层,下层是红色的有机相(含有DNA和蛋白质)。水相RNA用异丙醇能沉淀分离;中间层或者下层中的DNA用乙醇沉淀分离;异丙醇沉淀能使蛋白质从酚-醇相的上清液中沉淀出来。沉淀出的RNA、DNA和蛋白质洗脱杂质,重悬后用于下游。
分离的RNA可以用于RT-PCR, Northern Blot analysis, Dot Blot hybridization, poly(A)+ selection, in vitro translation, RNase protection assay, and molecular cloning 分离的DNA可以用于PCR, and Restriction Enzyme digestion, and Southern Blots. 分离的蛋白质可以用于Western Blots, recovery of some enzymatic activity, and some immunoprecipitation.
注意:TRIzol LS试剂适用于液体样品(如,血液和病毒制品)。TRIzol LS试剂与TRIzol试剂仅在它们成分的含量上不同,TRIzol LS试剂的浓度更高,因此相对于同个样品时,TRIzol LS试剂需要量更少。不要将未稀释的TRIzol LS试剂用于固体样品。处理固体样品时,TRIzol LS试剂没有TRIzol试剂效果好,收率要低些。 警告
TRIzol LS试剂含有的成分具有毒、腐蚀性和刺激性,如果处理不慎会有危害健康。请在通风橱里操作,并穿好实验服、戴好手套和安全眼镜。避免直接接触TRIzol LS试剂,会导致皮肤、眼睛或者呼吸道等暴露部位的化学灼伤。如果万一接触了皮肤或者眼睛,请立即用大量水冲洗15min,必要时去医院护理。如果吸入了气体,立刻到通风地方呼吸新鲜空气,必要时去医院护理。 内容和贮存
TRIzol LS试剂有100ml和200ml两种规格的,室温运输和贮存。妥善保管,1年内性质都很稳定。 使用目的
仅用于研究,不能用于人或动物的诊断或治疗。 需要材料
分离RNA、DNA和蛋白质还需要下列材料,但是我们未提供 分离RNA时,需要:氯仿;异丙醇;75%乙醇(DEPC水处理过);无RNase水或者0.5%SDS;能达到12,000*g的高速离心机;聚丙烯微量离心管;水浴槽(55-60℃)。 分离DNA时,需要:氯仿;100%乙醇;75%乙醇;0.1M柠檬酸钠(10%乙醇);8mM NaOH;
能达到12,000*g的高速离心机;聚丙烯微量离心管。
分离蛋白质时,需要:氯仿;异丙醇;100%乙醇;0.3M盐酸胍(95%乙醇);1%SDS;能达到12,000*g的高速离心机;聚丙烯微量离心管。 样品准备 样品均质化
1.确定样品类型,在室温下如下表操作。TRIzol LS试剂与样品的体积比为3:1,一定要按指定的量加入TRIzol LS试剂,否则提取RNA会有DNA污染。
6
注意:当样品少量(<10细胞或者<10mg组织)或者样品体积<0.25mL,为方便提取RNA,需用无RNase水调整样品体积到0.25ml。
样品类型为生物液体时,操作步骤:1.每0.25ml样品加入0.75mlTRIzol LS试剂;2.移液器上下吹匀几次,使样品均匀。注意:污染物质含量高的生物液体(如,全血)应该先用无RNase水按1:1稀释。
样品类型为组织时,操作步骤:1.每50-100mg组织样品或者0.25ml组织悬液加入0.75mlTRIzol LS试剂;2.高速搅拌器混匀样品。注意:采集样品后要立即处理和冷冻组织样品,不能处理未稀释的固体样品。
样品类型为单层贴壁细胞时,操作步骤:1.吸出培养皿中的培养液;2.每10cm2表面积的培养皿加入0.3-0.4mlTRIzol LS试剂,直接加到培养皿里细胞上;3. 移液器上下吹匀几次,在培养皿里直接裂解细胞。注意:不要在培养皿中加水混匀,粘附在皿上的残留培养液足够了。 样品类型为悬浮细胞时,操作步骤:1.离心去除培养液获得细胞;2.每0.25ml样品(来自动植物或者酵母细胞5-10*106,或者细菌细胞1*107)加入0.75mlTRIzol LS试剂;注意:加入TRIzol LS试剂之前切忌洗涤细胞,避免增加mRNA降解机率;3. 移液器上下吹匀几次,裂解细胞,对于酵母或者细菌细胞,可能还需要高速搅拌器来充分裂解。
2.(可选)当样品里脂肪、蛋白、多糖或者胞外物质(如,肌肉、脂肪组织或者块茎植物等材料),需要再加个分离步骤,移除样品里难溶物质。注意:如果你还需要回收样品里DNA,就不能做此步。
具体步骤:1.混匀样品(如前面步骤1所述)后,4℃下,12,000*g离心样品10min;注意:离心后沉淀物质包含ECM、多糖和高分子量的DNA,RNA在上清液里,若样品富含脂肪,在上清液上面还有脂肪层;2.移除覆盖的脂肪层;3.将澄清的上清液移到新的离心管中。 3.进行相分离,或者储存已混匀的样品。此样品能在室温放置几个小时,或者在-60到-70℃至少一个月。 相分离
1. 室温静置已混匀样品(见混匀样品步骤)5min。
2. 每0.75mlTRIzol LS试剂加入0.2ml氯仿。盖紧离心管的盖子。 3. 使劲地手摇离心管15s。
4. 室温静置2-15min。
5. 4℃下,12,000*g离心样品15min。
注意:混合物被分为3层,上层是澄清的水相,中间层,下层是红色的酚-氯仿相,只有RNA被排除在水相里。上层水相体积约占TRIzol LS试剂最初体积的~70%。
6. 倾斜离心管为45°,小心地用移液器吸走水相,避免吸到中间层或者有机层。 7. 将水相移到新的离心管,然后进行RNA分离步骤。
8. 如果需要分离DNA和蛋白质,则保持中间层和酚-氯仿相有机层。详见DNA分离步骤和
蛋白质分离步骤。有机相可在4℃保存过夜。 RNA分离步骤
当制备和处理RNA时,需要采取适当措施避免RNase污染。 RNA沉淀
6
1. (可选)当沉淀从少量样品(<10细胞或者<10mg组织)提取的RNA,需要添加5-10μg
不含RNase的糖原作为水相的载体。注意:糖原是RNA的辅助沉淀剂,浓度≤4mg/ml时不会抑制第一链合成,也不会抑制PCR。
2. 每0.75mlTRIzol LS试剂加入0.5ml100%异丙醇到水相。 3. 室温静置10min。
4. 4℃下,12,000*g离心10min。
注意:离心前,RNA通常看不见,离心后,在离心管底部和侧面可见丝状沉淀物。 5. 进行RNA洗涤和重悬
RNA洗涤和重悬
1. 移走离心管里上清液,只留RNA沉淀。
2. 每0.75mlTRIzol LS试剂加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀。涡旋,混匀样品。 3. 4℃下,7500*g离心5min,弃上清液。
4. 真空或者空气干燥RNA沉淀5-10min,不要用真空离心干燥机干燥RNA沉淀。
注意:不要让RNA沉淀干燥太彻底,否则RNA沉淀溶解度降低,会使A260/280<1.6。 5. 用无RNase水或者0.5%SDS(20-50μL)重悬RNA沉淀,移液器上下轻轻吹溶液几次。
注意:如果要用于随后的酶反应中,就不要将RNA溶解在0.5%SDS里。 6. 在水浴槽55-60℃孵育10-15min。 7. 继续下游操作或者储存在-70℃。 DNA分离步骤
从相分离步骤中保存的中间层和酚-氯仿层提取DNA。
DNA沉淀
1. 移走覆盖在中间层上的残留水相层,这是涉及到DNA提取质量的关键一步。 2. 每0.75mlTRIzol LS试剂加入0.3ml 100%乙醇。 3. 盖紧离心管,上下颠倒几次,混匀样品。 4. 室温静置2-3min。
5. 4℃,2000*g离心5min,沉淀DNA。
6. 移走酚-氯仿层,如果需要提取蛋白质,则保留在新的离心管中。该上清液可在-70℃下
保存数月。
7. 对DNA沉淀进行DNA洗涤和重悬。
DNA洗涤和重悬
1. 每0.75mlTRIzol LS试剂加入1ml柠檬酸钠/乙醇溶液(10%乙醇溶有0.1M柠檬酸钠,PH8.5)。 2. 室温静置30min,不定时轻轻地上下倒置混匀。
注意:DNA能在柠檬酸钠/乙醇溶液里保存2h。
3. 4℃,2000*g离心5min,弃上清液。 4. 再次洗涤(重复步骤1-3)。
注意:当DNA沉淀较多(>200μg)时,重复洗涤两次。 5. 每0.75mlTRIzol LS试剂加入1.5-2ml75%乙醇。
注意:DNA样品在75%乙醇4℃能保存数月。
6. 室温静置10-20min,不定时轻轻地上下倒置混匀。 7. 4℃,2000*g离心5min,弃上清液。
8. 真空或者空气干燥DNA沉淀5-10min,不要用真空离心干燥机干燥RNA沉淀。
9. 以0.2–0.3 μg/μL 浓度用8mM NaOH重悬DNA,每50-70mg组织或者1*107细胞加入
8mM NaOH 0.3-0.6mL。
注意:我们高度建议用温和碱溶液重悬DNA,因为分离的DNA在水或者Tris缓冲液中重悬效果不好。
10. 4℃,12,000*g离心10min,移走不溶物质。
11. 将含DNA的上清液转移到新的离心管中,若需要,用HEPES调节PH,进行下游操作。
DNA能在4℃保存过夜,要想长期保存,则需用HEPES调节PH7-8,添加1mM EDTA,保存在4℃或者-20℃。 DNA和RNA产量测定
用RNA和DNA在260nm和280nm处的吸收值测定浓度。 预期产量
下表列出了各种来源材料提取RNA(A260/280>1.8)和DNA(A260/280为1.6-1.8)的标准产量
蛋白分离步骤
从DNA沉淀步骤后留下来的酚-氯仿层分离蛋白质,蛋白质沉淀或者蛋白透析。
蛋白质沉淀
1. 每1mlTRIzol LS试剂加入1.5ml异丙醇到酚-氯仿层。 2. 室温静置10min。
3. 4℃,12,000*g离心10min,保留沉淀的蛋白,弃上清液。 4. 对蛋白沉淀进行蛋白洗涤。 蛋白洗涤
1. 准备洗涤液,即:0.3M盐酸胍溶于95%乙醇。
2. 每1mlTRIzol LS试剂加入2ml洗涤液,洗涤蛋白沉淀。 3. 室温静置20min。
注意:蛋白样品可在0.3M盐酸胍-95%乙醇,4℃下保存一个月或者-20℃至少保存一年。
4. 4℃,7500*g离心5min,弃洗涤液。 5. 重复步骤2-4,两次。
6. 洗涤3次后,加入2ml100%乙醇,涡旋。 7. 室温静置20min。
8. 4℃,7500*g离心5min,弃乙醇洗涤液。
9. 空气干燥蛋白沉淀5-10min,不要干燥太彻底。 10. 进行蛋白重悬步骤。 蛋白重悬
1. 加1%SDS200μL,用移液管上下吹打直到蛋白重悬。
注意:为了彻底溶液蛋白沉淀,可能需要将蛋白沉淀在水浴槽50℃孵育。 2. 4℃,10,000*g离心10min,让不溶物质沉淀。
3. 将含有蛋白的上清液转移到新的离心管,进行下游操作或者保存在-20℃。 蛋白透析
1. 将酚-氯仿层溶液放进透析膜中。
注意:酚-氯仿层溶液能溶解某些透析膜(如,纤维素酯)。操作前需要检查下。 2. 在4℃下,用0.1%SDS溶液透析样品,需要更换3次0.1%SDS溶液,透析16h后第
一次更换,过4h后(即透析20h)第二次更换,过2h后(即透析22h)第三次更换。
注意:需要0.1%SDS溶液再次溶液蛋白样品,低浓度的SDS是不够的,若需要,可以先将蛋白沉淀溶解后再稀释SDS。
3. 4℃,10,000*g离心透析液10min,蛋白在上清液中。
4. 将上清液转移到新的离心管中,进行下游操作或者保存在-20℃。 5. (可选)加入100μL 1%SDS和100μL 8M尿素,溶解蛋白沉淀。 蛋白产量测定
Bradford法检测蛋白浓度(SDS浓度必须小于0.1%)。 问题与解决 问题 RNA产量低,DNA产量低或者蛋白质产量低 原因 ? ? 解决 ? 样品均化或者裂解不充分 最终RNA、DNA或者蛋白质重新溶解不完全 ? 减少原始材料的量。将组织切的更碎些,确保能完全沉浸在TRIzol LS试剂,达到最佳裂解效果。 反复用移液器吸移样品并在50-50℃加热样品,增大溶解。 样品收集后必须及时处理或者冷冻。 RNA样品保存在-60到-70℃,DNA样品和蛋白样品保存在-20℃。 在相分离后不要试图将水相溶液吸干净。 RNA降解,DNA降解或者蛋白降解 ? ? 样品收集后没有及时处理或者冷冻。 RNA、DNA或者蛋白分离后没有保存在正确的温度下。 吸取水相时也吸到了中间相或者有机相 ? ? RNA污染或DNA污染 ? ? ? ? 水相移除不彻底 0.1M柠檬酸钠-10%乙醇溶液洗涤DNA沉淀不充分 样品均质化时,TRIzol LS试剂体积用量不够 有机相移除不干净 ? ? RNA的A260/280值偏低 ? ? 在沉淀DNA之前必须吸干净残留的水相溶液。 确保0.1M柠檬酸钠-10%乙醇溶液洗涤DNA沉淀。 根据样品类型加入恰当量的TRIzol LS试剂。 相分离后不要试图将水相溶液吸干净。 ? ? DNA的A260/280值偏低 DNA样品里有酚残留 再用0.1M柠檬酸钠-10%乙醇溶液洗涤DNA沉淀1次。
? ? 水相移除不彻底 0.1M柠檬酸钠-10%乙醇溶液洗涤DNA沉淀不充分 样品均质化时,TRIzol LS试剂体积用量不够 有机相移除不干净 ? ? RNA的A260/280值偏低 ? ? 在沉淀DNA之前必须吸干净残留的水相溶液。 确保0.1M柠檬酸钠-10%乙醇溶液洗涤DNA沉淀。 根据样品类型加入恰当量的TRIzol LS试剂。 相分离后不要试图将水相溶液吸干净。 ? ? DNA的A260/280值偏低 DNA样品里有酚残留 再用0.1M柠檬酸钠-10%乙醇溶液洗涤DNA沉淀1次。
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