Ames试验步骤及报告模板

鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验

（Ames试验）

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鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型（his）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶①，可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物的筛选。

鼠伤寒沙门氏菌的突变型（即组氨酸缺陷型）菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时，则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型（表现型），因而在无组氨酸培养基上也能生长，故可根据菌落形成数量，检查受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使沙门氏菌突变型产生回复突变，代谢活化系统可以用多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝匀浆（S-9）制备的S-9混合液。

（一）主要培养基与试剂 1.培养基

（1）营养肉汤培养基 取5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨和5.0g氯化钠，加1000mL蒸馏水并加热溶解，调pH至7.2，分装后经灭菌，置普通冰箱保存备用，保存期不超过半年。

营养肉汤培养基 成分：牛肉膏 蛋白胨 NaCl 加蒸馏水至

（2）营养肉汤琼脂培养基 取2.0g琼脂粉加上述营养肉汤培养基100mL，加热融化后调pH为7.4，103kPa，20min灭菌，制备平板时，每皿20-25ml。营养肉汤琼脂培养基用作基因型鉴定的结晶紫敏感试验、抗氨苄青霉素和四环素试验、紫外线敏感性试验以及细菌活力鉴定等。

（3）底层琼脂培养基 成分：琼脂粉 蒸馏水 V-B培养基E 40%葡萄糖溶液

15g 930mL 20mL 50mL 2.5g 5.0g 2.5g 500mL

配制：将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。

配制：首先将前两种成分高压灭菌30min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。按每皿25mL制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中温孵24h，备用。

（4）顶层培养基 ①顶层琼脂：取6g琼脂粉、5g氯化钠加蒸馏水至1000mL。 ②0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液（诱变试验用）：取12.4mgD-生物素（相对分子质量224）和7.8ml组氨酸或9.5mgL-盐酸组氨酸/1000ml顶层培养基 ③顶层培养基：加热融化顶层琼脂，每100mL顶层琼脂中加10mL 0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液，混匀后分装在三角瓶中，灭菌。用时融化分装于小试管，每管2mL，在45℃水浴中保温。

2. 试剂

（1）0.8％氨苄青霉素溶液（鉴定菌株用，无菌配制）称取氨苄青霉素40mg，用0.02mol/L NaOH溶液稀释至5mL，保存于冰箱中。

（2）0.1％结晶紫溶液（鉴定菌株用）称取100mg结晶紫，溶于100mL无菌水中。

（3）L-组氨酸溶液和0.5mmol/L D-生物素溶液（鉴定菌株用）称取77.6mg/L组氨酸或95.9mg/L盐酸组氨酸和124mg D-生物素，分别溶于100mL蒸馏水中，灭菌，保存于4℃冰箱中。临时用时用无菌蒸馏水稀释10倍。

（4）0.8％四环素溶液，称取40mg四环素，用0.02mol/L盐酸稀释至5mL，保存于4℃冰箱中。适用于四环素抗性试验和氨苄青霉素-四环素平板。 （5）二甲基亚砜 光谱纯，103kPa，20min灭菌。 (6)Vogel-Bonner (V-B) 培养基E 成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O) 磷酸氢二钾(K2HPO4)

磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 加蒸馏水至

至1000mL。于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。 (7)40%葡萄糖溶液 成分：葡萄糖

400g

加蒸馏水至 1000mL 配制：加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至1000mL。于0.068MPa下高压灭菌20min。储于4℃冰箱。

（8）S-9辅助因子（10％S-9混合液） ① 0.4mol/L氯化镁（MgCl2）溶液：称取3.8gMgCl2，加蒸馏水稀释至100mL。 ② 1.65mol/L氯化钾（KCl）溶液：称取12.3gMgCl2，加蒸馏水稀释至100mL。 ③ 0.2mol磷酸盐缓冲液（pH7.0）：每10mL由437mg磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2

O）溶液和107.64mg磷酸二氢钠(NaH2PO4)溶液混合而成，调pH至7.0，经103kPa，20min灭菌或滤菌。5ml ④ 辅酶-Ⅱ（氧化型）溶液：准确称取辅酶-Ⅱ，用无菌蒸馏水溶解配制成0.02mol/L溶液，-20℃以下低温保存。30.6mg ⑤ 14.105mg 6-磷酸葡萄糖 ⑥ 10％S-9混合液（临用时配制）：取5mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）、0.1mL 1.65mol/L氯化钾溶液（12.3mg）、0.1mL 0.4mol/L氯化镁溶液（8.132mg）、14.105mg6-磷酸葡萄糖、

100g 500g 175g 2g 1000mL

配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水

30.6mg 氧化型辅酶-Ⅱ溶液，3.8ml蒸馏水，微孔滤膜过滤，和1mLS-9液混匀，置冰浴中待用。

3 菌株鉴定用和特殊用途试剂 (1) 组氨酸—生物素平板 成分：琼脂粉 蒸馏水 (V-B)盐溶液 40%葡萄糖

灭菌盐酸组氨酸水溶液(0.5g/100mL) 灭菌0.5mmol/L生物素溶液

15g 914mL 20mL 50mL 10mL 6mL

配制：高压灭菌琼脂和水后，将灭菌40%葡萄糖，V-B盐溶液和组氨酸溶液加进热的琼脂溶液中。待溶液稍为冷却后，加入灭菌生物素，混匀，浇制平板。用于无R因子主平板或测定组氨酸需要。

(2) 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板 成分：琼脂粉 蒸馏水 (V-B)盐溶液 40%葡萄糖

灭菌盐酸组氨酸溶液（0.5g/100mL） 灭菌0.5mmol/L生物素溶液

氨苄青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中) 四环素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中)

15g 910mL 20mL 50mL 10mL 6mL 3.15mL 0.25mL

配制：琼脂和水高压灭菌20min，将无菌的葡萄糖、VB盐溶液和组氨酸—生物素溶液加进热的溶液中去，混匀。冷却至大约50℃，无菌条件下加入氨苄青霉素溶液。应该在倾注琼脂平板后几天内，制备主平板。氨苄青霉素平板用于有R因子的主平板。再加入无菌四环素溶液。氨苄青霉素/四环素平板用于保存TA102菌株的主平板。能在冰箱中保存2个月，当无R因子的菌株生长时，平板不再使用。 （二）菌株的鉴定与保存

采用四株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102。TA97和TA98可检测各种移码型诱变剂，TA100可检测引起碱基对置换的诱变剂。TA102能检出其他测试菌株不能检出或极少检出的某些诱变剂，如甲醛、各过种氧化氢化合物和丝裂霉素C等交联剂。一般用来测试受试物诱变性时，必须通过四个菌株的检测，必要时可增加TA1535、TA1537、和TA104任一菌株。 菌株 TA100 TA98 TA97 TA102

组氨酸突变 hisG hisD hisD hisO hisG

LPS rfa rfa rfa rfa rfa

修复

R因子（pkM101） + + + +

检测突变 碱基置换 碱基置换 移码 碱基置换

菌株特性应与Ames试验标准相符。突变性菌的某些特性易丢失或变异，遇到下列情况应鉴定菌株的基因型。 ① 在收到培养菌株后。

② 当制备一套新的冷冻保存株或冷冻干燥菌株时。 ③ 当每皿自发回变数不在正常范围时。 ④ 当对标准诱变剂丧失敏感性时。 ⑤ 使用主平板传代时。 ⑥ 投入使用前。

1.菌株活化 生长 保存与使用

（1）从-70℃超低温冰箱中取出保藏管，置37℃水浴中速溶，将菌液划线接种于氨苄青霉素平板，置37℃培养24小时。

从平板上选择5个生长良好的菌落，将每一个菌落的一半分别接种于5支盛有完全培养液试管中，经37℃振荡培养24小时。

进行菌株基因型和生物学特性鉴定。菌株鉴定合格后方能使用。

菌株鉴定合格后予以保藏，每支安瓿瓶分装0.8ml菌液和二甲亚砜0.07ml火焰封口后保存于超低温冰箱。

若以主平板保存菌种时，对带有质粒的pkM101的菌株，其主平板中可加入氨苄青霉素25μg/ml，对TA102菌株（另带PAQ1），还需加四环素2μg/ml。划线接种的主平板可保存于4℃冰箱中，一般可保存两个月。

（2）按上述方法将菌株用平板活化，取菌振荡培养（37℃，210r/min，10小时）过夜。菌液在3000r/min离心20min，弃上清，将沉淀混悬于生理盐水中，供菌株鉴定用。 2.菌株鉴定

表1 试验菌株鉴定的判断标准 菌株 TA97 TA98 TA100 TA102 注 组氨酸 缺陷 + + + + “+”表示需要组氨酸 脂多糖屏障缺损 + + + + “+”表示具有rfa突变 氨苄青霉素抗性 + + + + “+”表示具有R因子 切除修复缺损 + + + - 四环素 抗性 - - - + 自发回变菌落数* 90-180 30-50 100-200 240-320 *在体外代谢活化条件下自发回变菌落数略增 “+”表示“+”表示具有△具有pAQ1uvrB突变 质粒

2.1. 组氨酸需求试验

原理：组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上，则不能生长。

鉴定方法：用0.1ml吸管将测试菌株增菌液分别于含生物素的最低葡萄糖平板和含组氨

酸/生物素平板上划线接种，于37℃下倒置培养48h后观察结果。

结果判断：组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长。 试验时，每株菌的5个菌落划与同一块平板上，每菌划完上述两种平板后，再划3块完全培养基平板（供Apr、Tcr、△uvrB试验）。

2.2. 结晶紫敏感试验（rfa突变）

原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些大分子物质如结晶紫能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影响。

鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL涂布于完全培养基平板上，用一直径6mm的圆过滤纸片，以结晶紫溶液（1mg/ml，无菌蒸馏水配制）浸湿，放在平皿中央。37℃下培养12-24h后观察结果。

结果判断：假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌带，说明该待测菌株具有rfa突变。阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带，说明存在rfa（深粗型）突变。这种变化允许某些大分子物质进入细菌体内并抑制其生长。TA97、TA98、TA100和TA102均有抑制带，野生型鼠伤寒沙门氏菌没有抑制带。

2.3. 抗氨苄青霉素（Apr）试验

原理：含R因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。因为R因子不太稳定，容易丢失，故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否。

鉴定方法：取2.1中划好的完全培养基板，将一滤纸条（约1.5×8.5mm）用氨苄青霉素浸湿，交叉放置于细菌接种线上。37℃下培养12-24h后观察结果。

氨苄青霉素溶液（8mg/ml，0.02mol/l NaOH配）新鲜配制，4℃保存。

结果判断；假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长，说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作用，表示含R因子，否则，表示测试菌不含R因子或R因子丢失。4个菌株经过24h培养，在氨苄青霉素带的周围依然生长不受抑制，即有抗氨苄青霉素效应，证明它们都带有R因子。

2.4. uvrB突变实验（紫外线敏感试验）

原理：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长，而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。

鉴定方法：取2.1中已划好菌的完全培养基平板，用黑纸盖住平板的一半，置紫外灯下照射（15W，距离33cm）8秒钟。置37℃下孵育12-24h后观察结果。

结果判断：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。对紫外线敏感的三个菌株（TA97、TA98、TA100）仅在平皿没有照射过的一半生长，具有野生型切除修复酶的菌株TA102仍能生长。

2.5. 四环素抗性试验（Tcr）

原理：具有pAQI的菌株对四环素有抗性。

鉴定方法：取2.1中划好的完全培养基板，将一滤纸条（约1.5×8.5mm）用四环素溶液浸湿，交叉放置于细菌接种线上。37℃下培养12-24h后观察结果。

结果判断：假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环素平板上生长，表明该测试菌株对氨苄青霉素和四环素两者有抗性，具有pAQI质粒，否则，说明测试菌株不含pAQI质粒。TA102菌株生长不受抑制，对照菌株有一段生长抑制区，表明TA102菌株有抗四环素效应。

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