Ames试验步骤及报告模板
更新时间:2024-01-24 15:00:01 阅读量: 教育文库 文档下载
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鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验
(Ames试验)
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鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的组氨酸营养缺陷型(his)菌株,在含微量组氨酸的培养基中,除极少数自发回复突变的细胞外,一般只能分裂几次,形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后,大量细胞发生回复突变,自行合成组氨酸,发育成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用,在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶①,可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关,故此法现广泛应用于致癌物的筛选。
鼠伤寒沙门氏菌的突变型(即组氨酸缺陷型)菌株在无组氨酸的培养基上不能生长,在有组氨酸的培养基上可以正常生长。但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时,则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型(表现型),因而在无组氨酸培养基上也能生长,故可根据菌落形成数量,检查受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使沙门氏菌突变型产生回复突变,代谢活化系统可以用多氯联苯(PCB)诱导的大鼠肝匀浆(S-9)制备的S-9混合液。
(一)主要培养基与试剂 1.培养基
(1)营养肉汤培养基 取5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨和5.0g氯化钠,加1000mL蒸馏水并加热溶解,调pH至7.2,分装后经灭菌,置普通冰箱保存备用,保存期不超过半年。
营养肉汤培养基 成分:牛肉膏 蛋白胨 NaCl 加蒸馏水至
(2)营养肉汤琼脂培养基 取2.0g琼脂粉加上述营养肉汤培养基100mL,加热融化后调pH为7.4,103kPa,20min灭菌,制备平板时,每皿20-25ml。营养肉汤琼脂培养基用作基因型鉴定的结晶紫敏感试验、抗氨苄青霉素和四环素试验、紫外线敏感性试验以及细菌活力鉴定等。
(3)底层琼脂培养基 成分:琼脂粉 蒸馏水 V-B培养基E 40%葡萄糖溶液
15g 930mL 20mL 50mL 2.5g 5.0g 2.5g 500mL
配制:将上述成分混合后,于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。
配制:首先将前两种成分高压灭菌30min后,再加入后两种成分,充分混匀倒底层平板。按每皿25mL制备平板,冷凝固化后倒置于37℃培养箱中温孵24h,备用。
(4)顶层培养基 ①顶层琼脂:取6g琼脂粉、5g氯化钠加蒸馏水至1000mL。 ②0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液(诱变试验用):取12.4mgD-生物素(相对分子质量224)和7.8ml组氨酸或9.5mgL-盐酸组氨酸/1000ml顶层培养基 ③顶层培养基:加热融化顶层琼脂,每100mL顶层琼脂中加10mL 0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液,混匀后分装在三角瓶中,灭菌。用时融化分装于小试管,每管2mL,在45℃水浴中保温。
2. 试剂
(1)0.8%氨苄青霉素溶液(鉴定菌株用,无菌配制)称取氨苄青霉素40mg,用0.02mol/L NaOH溶液稀释至5mL,保存于冰箱中。
(2)0.1%结晶紫溶液(鉴定菌株用)称取100mg结晶紫,溶于100mL无菌水中。
(3)L-组氨酸溶液和0.5mmol/L D-生物素溶液(鉴定菌株用)称取77.6mg/L组氨酸或95.9mg/L盐酸组氨酸和124mg D-生物素,分别溶于100mL蒸馏水中,灭菌,保存于4℃冰箱中。临时用时用无菌蒸馏水稀释10倍。
(4)0.8%四环素溶液,称取40mg四环素,用0.02mol/L盐酸稀释至5mL,保存于4℃冰箱中。适用于四环素抗性试验和氨苄青霉素-四环素平板。 (5)二甲基亚砜 光谱纯,103kPa,20min灭菌。 (6)Vogel-Bonner (V-B) 培养基E 成分:枸椽酸(C6H8O7·H2O) 磷酸氢二钾(K2HPO4)
磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 加蒸馏水至
至1000mL。于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。 (7)40%葡萄糖溶液 成分:葡萄糖
400g
加蒸馏水至 1000mL 配制:加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖,再加蒸馏水至1000mL。于0.068MPa下高压灭菌20min。储于4℃冰箱。
(8)S-9辅助因子(10%S-9混合液) ① 0.4mol/L氯化镁(MgCl2)溶液:称取3.8gMgCl2,加蒸馏水稀释至100mL。 ② 1.65mol/L氯化钾(KCl)溶液:称取12.3gMgCl2,加蒸馏水稀释至100mL。 ③ 0.2mol磷酸盐缓冲液(pH7.0):每10mL由437mg磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2
O)溶液和107.64mg磷酸二氢钠(NaH2PO4)溶液混合而成,调pH至7.0,经103kPa,20min灭菌或滤菌。5ml ④ 辅酶-Ⅱ(氧化型)溶液:准确称取辅酶-Ⅱ,用无菌蒸馏水溶解配制成0.02mol/L溶液,-20℃以下低温保存。30.6mg ⑤ 14.105mg 6-磷酸葡萄糖 ⑥ 10%S-9混合液(临用时配制):取5mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)、0.1mL 1.65mol/L氯化钾溶液(12.3mg)、0.1mL 0.4mol/L氯化镁溶液(8.132mg)、14.105mg6-磷酸葡萄糖、
100g 500g 175g 2g 1000mL
配制:先将前三种成分加热溶解后,再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中,加蒸馏水
30.6mg 氧化型辅酶-Ⅱ溶液,3.8ml蒸馏水,微孔滤膜过滤,和1mLS-9液混匀,置冰浴中待用。
3 菌株鉴定用和特殊用途试剂 (1) 组氨酸—生物素平板 成分:琼脂粉 蒸馏水 (V-B)盐溶液 40%葡萄糖
灭菌盐酸组氨酸水溶液(0.5g/100mL) 灭菌0.5mmol/L生物素溶液
15g 914mL 20mL 50mL 10mL 6mL
配制:高压灭菌琼脂和水后,将灭菌40%葡萄糖,V-B盐溶液和组氨酸溶液加进热的琼脂溶液中。待溶液稍为冷却后,加入灭菌生物素,混匀,浇制平板。用于无R因子主平板或测定组氨酸需要。
(2) 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板 成分:琼脂粉 蒸馏水 (V-B)盐溶液 40%葡萄糖
灭菌盐酸组氨酸溶液(0.5g/100mL) 灭菌0.5mmol/L生物素溶液
氨苄青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中) 四环素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中)
15g 910mL 20mL 50mL 10mL 6mL 3.15mL 0.25mL
配制:琼脂和水高压灭菌20min,将无菌的葡萄糖、VB盐溶液和组氨酸—生物素溶液加进热的溶液中去,混匀。冷却至大约50℃,无菌条件下加入氨苄青霉素溶液。应该在倾注琼脂平板后几天内,制备主平板。氨苄青霉素平板用于有R因子的主平板。再加入无菌四环素溶液。氨苄青霉素/四环素平板用于保存TA102菌株的主平板。能在冰箱中保存2个月,当无R因子的菌株生长时,平板不再使用。 (二)菌株的鉴定与保存
采用四株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102。TA97和TA98可检测各种移码型诱变剂,TA100可检测引起碱基对置换的诱变剂。TA102能检出其他测试菌株不能检出或极少检出的某些诱变剂,如甲醛、各过种氧化氢化合物和丝裂霉素C等交联剂。一般用来测试受试物诱变性时,必须通过四个菌株的检测,必要时可增加TA1535、TA1537、和TA104任一菌株。 菌株 TA100 TA98 TA97 TA102
组氨酸突变 hisG hisD hisD hisO hisG
LPS rfa rfa rfa rfa rfa
修复
R因子(pkM101) + + + +
检测突变 碱基置换 碱基置换 移码 碱基置换
菌株特性应与Ames试验标准相符。突变性菌的某些特性易丢失或变异,遇到下列情况应鉴定菌株的基因型。 ① 在收到培养菌株后。
② 当制备一套新的冷冻保存株或冷冻干燥菌株时。 ③ 当每皿自发回变数不在正常范围时。 ④ 当对标准诱变剂丧失敏感性时。 ⑤ 使用主平板传代时。 ⑥ 投入使用前。
1.菌株活化 生长 保存与使用
(1)从-70℃超低温冰箱中取出保藏管,置37℃水浴中速溶,将菌液划线接种于氨苄青霉素平板,置37℃培养24小时。
从平板上选择5个生长良好的菌落,将每一个菌落的一半分别接种于5支盛有完全培养液试管中,经37℃振荡培养24小时。
进行菌株基因型和生物学特性鉴定。菌株鉴定合格后方能使用。
菌株鉴定合格后予以保藏,每支安瓿瓶分装0.8ml菌液和二甲亚砜0.07ml火焰封口后保存于超低温冰箱。
若以主平板保存菌种时,对带有质粒的pkM101的菌株,其主平板中可加入氨苄青霉素25μg/ml,对TA102菌株(另带PAQ1),还需加四环素2μg/ml。划线接种的主平板可保存于4℃冰箱中,一般可保存两个月。
(2)按上述方法将菌株用平板活化,取菌振荡培养(37℃,210r/min,10小时)过夜。菌液在3000r/min离心20min,弃上清,将沉淀混悬于生理盐水中,供菌株鉴定用。 2.菌株鉴定
表1 试验菌株鉴定的判断标准 菌株 TA97 TA98 TA100 TA102 注 组氨酸 缺陷 + + + + “+”表示需要组氨酸 脂多糖屏障缺损 + + + + “+”表示具有rfa突变 氨苄青霉素抗性 + + + + “+”表示具有R因子 切除修复缺损 + + + - 四环素 抗性 - - - + 自发回变菌落数* 90-180 30-50 100-200 240-320 *在体外代谢活化条件下自发回变菌落数略增 “+”表示“+”表示具有△具有pAQ1uvrB突变 质粒
2.1. 组氨酸需求试验
原理:组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸,只能在补充组氨酸的培养基上生长,而在缺乏组氨酸的培养基上,则不能生长。
鉴定方法:用0.1ml吸管将测试菌株增菌液分别于含生物素的最低葡萄糖平板和含组氨
酸/生物素平板上划线接种,于37℃下倒置培养48h后观察结果。
结果判断:组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长,而在无组氨酸平板上则不能生长。 试验时,每株菌的5个菌落划与同一块平板上,每菌划完上述两种平板后,再划3块完全培养基平板(供Apr、Tcr、△uvrB试验)。
2.2. 结晶紫敏感试验(rfa突变)
原理:具有深粗糙(rfa)的菌株,其表面一层脂多糖屏障缺损,因此一些大分子物质如结晶紫能穿透菌膜进入菌体,从而抑制其生长,而野生型菌株则不受其影响。
鉴定方法:吸取待测菌株增菌液0.1mL涂布于完全培养基平板上,用一直径6mm的圆过滤纸片,以结晶紫溶液(1mg/ml,无菌蒸馏水配制)浸湿,放在平皿中央。37℃下培养12-24h后观察结果。
结果判断:假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌带,说明该待测菌株具有rfa突变。阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带,说明存在rfa(深粗型)突变。这种变化允许某些大分子物质进入细菌体内并抑制其生长。TA97、TA98、TA100和TA102均有抑制带,野生型鼠伤寒沙门氏菌没有抑制带。
2.3. 抗氨苄青霉素(Apr)试验
原理:含R因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。因为R因子不太稳定,容易丢失,故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否。
鉴定方法:取2.1中划好的完全培养基板,将一滤纸条(约1.5×8.5mm)用氨苄青霉素浸湿,交叉放置于细菌接种线上。37℃下培养12-24h后观察结果。
氨苄青霉素溶液(8mg/ml,0.02mol/l NaOH配)新鲜配制,4℃保存。
结果判断;假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长,说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作用,表示含R因子,否则,表示测试菌不含R因子或R因子丢失。4个菌株经过24h培养,在氨苄青霉素带的周围依然生长不受抑制,即有抗氨苄青霉素效应,证明它们都带有R因子。
2.4. uvrB突变实验(紫外线敏感试验)
原理:具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感,当受到紫外线照射后,不能生长,而具有野生型切除修复酶的菌株,则能照常生长。
鉴定方法:取2.1中已划好菌的完全培养基平板,用黑纸盖住平板的一半,置紫外灯下照射(15W,距离33cm)8秒钟。置37℃下孵育12-24h后观察结果。
结果判断:具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感,经辐射后细菌不生长,而具有完整的切除修复系统的菌株,则照常生长。对紫外线敏感的三个菌株(TA97、TA98、TA100)仅在平皿没有照射过的一半生长,具有野生型切除修复酶的菌株TA102仍能生长。
2.5. 四环素抗性试验(Tcr)
原理:具有pAQI的菌株对四环素有抗性。
鉴定方法:取2.1中划好的完全培养基板,将一滤纸条(约1.5×8.5mm)用四环素溶液浸湿,交叉放置于细菌接种线上。37℃下培养12-24h后观察结果。
结果判断:假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环素平板上生长,表明该测试菌株对氨苄青霉素和四环素两者有抗性,具有pAQI质粒,否则,说明测试菌株不含pAQI质粒。TA102菌株生长不受抑制,对照菌株有一段生长抑制区,表明TA102菌株有抗四环素效应。
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