SRAP分子标记在园林植物遗传育种中的应用

生物技术通报

··技术与方法

BIOTECHNOLOGYBULLETIN

2011年第11期

SRAP分子标记在园林植物遗传育种中的应用

史倩倩

摘

要：

王雁周琳任磊

（中国林业科学研究院林业研究所国家林业局林木培育重点实验室，北京100091）

relatedamplifiedpolymorphism，SRAP）分子标记作为一种新型的分子标记技术，相关序列扩增多态性（sequence-

以其多态性高、稳定性高、重复性好、操作简便、效率高及成本低等优点，已经在园林植物中广泛应用。简单介绍SRAP标记的原理和特点，综述其目前在遗传多样性评析、亲缘关系分析、遗传图谱构建、种质资源鉴定及基因克隆与基因定位等方面的研究进展，并对该标记在园林植物的遗传育种的应用前景进行了展望。

关键词：

SRAP

分子标记

园林植物

遗传育种

ApplicationofSRAPMarkerinGeneticBreedingofOrnamentalPlants

ShiQianqian

WangYan

ZhouLin

RenLei

（LaboratoryofTreeBreedingandCultivation，StateForestryAdministration，ReserchInstituteofForestry，

ChineseAcademyofForestry，CAF，Beijing100091）

Abstract：

Sequence-relatedamplifiedpolymorphism（SRAP），asakindofnewlydevelopedmolecularmarker，hasbeenwidelya-

doptedinforesttree，crops，flowerswiththeadvantagesofhighpolymorphism，stabilization，repeatability，simplicity，highefficiencyandlowcost．TheprinciplesandcharacteristicsofSRAPmarkerwereintroducedinthispaper，andtheapplicationsofSRAPmarkeringe-neticdiversityandrelationshipanalysis，geneticsmapping，germplasmidentification，genecloneandgenelocationwereoverviewed．Fi-nally，thepaperforecastedtheprospectoftheapplicationofSRAPmarkeringeneticbreedingofornamentalplants．

Keywords：

SRAPMolecularmarkerOrnamentalplantsGeneticbreeding

分子标记技术以能直接研究DNA水平上的遗

不受组织器官、环境及基因是否表达的限传变异，

制，其多态性高，遗传稳定等优点广泛应用于植物的遗传育种研究

［1］

SRAP）以其多quence-relatedamplifiedpolymorphism，

态性高、非等位检测，样品信息量大，操作简便，重复、稳定、可靠性高和费用低等优点，广泛应用于园

图谱构建、种林植物的遗传多样性和亲缘关系分析、

质资源鉴定、基因克隆和基因定位的研究中，为园林

植物的遗传育种提供更确切，更充分的理论依据。

。在近30年中，分子标记技术得到

了快速发展，目前DNA分子标记已达几十种，大致可以分为4类：以分子杂交技术为基础的标记，如RFLP；基于PCR技术的标记，SSR、ISSR、如RAPD、

AFLP和SCAR等；基于DNA序列的标记，如cSSR、ITS测序分析技术等；以DNA芯片技术为基础的标记，如SNP等。

随着园林绿化的发展，对园林植物的需求度也越来越高，如要求物种丰富，品种多样化，观赏性状特异性高，可以周年生产，抗逆性强等。而近几年一——相关序列扩增多态性（Se-种新的分子标记方法—

1SRAP技术的原理与特点

relatedampli-相关序列扩增多态性（sequence-fiedpolymorphism，SRAP）分子标记技术最初是由美

［2］

国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士于2001年在研究芸薹属作物时创立的，又称为基于序列扩

basedamplifiedpolymorphism，增多态性（sequence-SBAP）。它是通过一对独特的引物对开放阅读框（ORF）进行PCR扩增，由于物种及个体间的差异导

13收稿日期：2011-06-基金项目：国家林业局林业公益性行业科研专项（200904050）部分内容

mail：shiqianqian2005@163．com作者简介：史倩倩，硕士研究生，研究方向：园林植物应用研究；E-mail：wangyan@caf．ac．cn通讯作者：王雁，研究员，研究方向：花卉栽培与育种；E-

致内含子、启动子和间隔序列不同进而产生多态性。1.1SRAP的引物特点

SRAP技术的基本原理是通过一对引物对ORFprimer）长17bp，5'端进行扩增。其中正向引物（F-的核心序列为14bp，由10bp无任何特异的填充序

［3］

列（一般是TGAGTCCAAA，少数为TGAGTCCTTT）和CCGG组成，随后为3'端的3个选择性碱基，选择

RAPD、AFLP和SSR等标记技术比较，的RFLP、

SRAP具有适用范围广泛、多数显性、多态性高、非等位检测及能检测20－100个位点，提供较高的样品信息量，可以对整个基因组进行检测，操作简便，重复、稳定、可靠性高及费用低等优点

［10］

。

2

2.1

SRAP技术在园林植物遗传育种中的研

究进展

遗传多样性分析及亲缘关系的研究

性碱基的变化与相同核心序列组合成一套正向引

primer）长18bp，物。而反向引物（R-其中核心序列由11bp填充序列（GACTGCGTACG）和特异序列

AATT组成，3'端仍为3个选择性碱基。正向引物中的CCGG序列可与ORF区域中的外显子特异性结合，反向引物中的AATT序列特异结合于富含AT区的内含子和启动子。这样正反向引物结合可以同时对外显子、内含子和启动子区域进行特异性扩增，并且因为个体不同及物种的内含子、启动子和间隔序

［4］列不同而产生多态性。

1.2SRAP扩增程序及检测方法

遗传多样性反映了种内不同种群之间或一个种

［11］

群内不同个体间的遗传变异。遗传多样性分析可以为研究物种起源、品种分类、亲本选配和品种保护等提供重要的科学依据，是收集、保护和有效利用有利于培育出更优良的品种。种质资源的技术基础，

SRAP分子标记技术可以有效地分大量证据表明，

［12］

析园林植物遗传多样性。蹇黎等利用SRAP技

37个中国术对51个寒兰品种类型（14个日本寒兰、

寒兰）进行了亲缘关系分析，用11个SRAP引物组

SRAP技术采用复性变温法扩增，扩增程序一

［2］

般有两种：一种是由Li等创立，即：94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃复性1min（也有用33℃［5］），72℃延伸1min，5个循环；94℃变性1min，50℃复性1min（也有用53℃），72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5－10min；4℃保存。前5个循环采用35℃退火温度有利于引物与靶序列更好的结合，随后的35个循环采用50℃退火温度以保证扩增产物以指数方式扩增。另一种由Budak等［6］提出，其他条件不变，只是整个反应过程退火温度一直是47℃。这两种方法都能得到重复、稳定性较好的扩增产物，因此可根据不同试验材料和不同试验目的，进行适当调整和优化，以期达到最好的试验效果。SRAP的扩增产物一般用4%－6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，可以用同位素或银染技术检测，也可以用1.8%－2.0%的琼脂糖凝胶

［2，3，8］

。分析多态性，但分辨率较低

SRAP操作简单，采用含17－18个碱基的正反向引物及50℃的退火温度，确保了扩增产物的稳定

［2］

［5］

合共扩增出586条带纹，其中504条多态性带纹，多

态率为86.01%，有效揭示了材料间的遗传关系。用19个SRAP引物组合对文心兰的33个品种基因组DNA进行扩增，结果显示，文心兰种周艳霞等

质具有丰富的遗传多样性，同时也说明了SRAP标记可有效应用于文心兰种质资源的遗传多样性研

［14］

究。李梅等利用SRAP分子标记研究了桂花（OsmanthusfragransLour．）88个品种和1个野生种间的亲缘关系，得出品种群体间遗传分化程度高的结论。SRAP技术在开发野生种质资源方面也起到

［15］

了重要的作用。袁菊红等对中国13个省24份野生石蒜（Lycorisradiata）94个样品进行了SRAP扩增，发现石蒜的野生种质资源遗传多样性非常丰富，种源间遗传分化显著。樊洪泓等利用SRAP和RAPD两种分子标记技术对石斛的9个品种进行了遗传多样性研究，表明SRAP聚类结果与传统的基于形态特征建立的分类结果较为一致，同时说明SRAP标记在石斛的遗传多样性与亲缘关系的研究

［17］

中，表现出了极大的优越性。Han等利用25对SRAP引物对发生芽突变的两个牡丹中国栽培品种

［16］

［13］

电泳

［7］

性

，并且还可以通过改变引物3'端的3个碱基得

到更多的引物，加上正反向引物可以自由组合，提高了引物的使用率，大大降低成本。与目前广泛应用

［9］

和两个牡丹日本栽培品种的亲缘关系进行了分析，

结果证明，中国栽培品种和日本栽培品种在遗传性上差别很大，并且表明了SRAP标记在分子水平上

探测牡丹的亲缘关系较有效。这进一步说明SRAP技术的多态性高，较适用于种质资源遗传多样性分析和亲缘关系的鉴定。

此外，前人还利用SRAP分析了其他园林植物的遗传多样性和种质间的亲缘关系，如杂花苜

［19］［7］［20，21］［22］

、、构树、湖北海棠、牡丹白木香、［23］［24］［25］［26］

早熟禾、狗牙根、石榴、矮牵牛、羽衣甘

麻栎天然群体间具有较丰富的遗传变异，同时也说

明SRAP技术可以作为麻栎种质资源材料鉴定、种质资源保护，以及重要性状分子标记辅助育种的重要手段。2.4

基因克隆与基因定位

获得与重要性状基因链锁的标记有利于植物分子标记辅助育种的进行，可进一步提高植物改良育种的选择效率，提高新品种的选育速度。SRAP技

［43］

术逐渐在基因标记方面广泛应用。薛华柏等用2个SRAP引物组合将4个石榴基因型分开并建立

［44］

用了石榴品种分子身份识别系统。张四普等SRAP引物组合Me30（TGAGTCCAAACCGGACG）/

Em7（GACTGCGTACGAATTCGA）对红花石榴母株母株和白花变异枝条间扩增出1条长度为78bp的稳定差异条带，说明白花变异枝条的产生可能与母用5对SRAP引物组合对小菊粉色芽和正常芽基因组DNA进行扩增，获得8条特异条带，并推测这8条特异位点上包含着形成花色芽变的突变基因。这进一步说明SRAP技术是一种简单有效的分子标记系统，可在小菊芽变基因标记及基因克隆研究中应用。众多实

可靠、有效的基践说明SRAP标记技术是一个高速、

因标记方法。

2.5SRAP结合其他标记技术在园林植物遗传育

种研究中的应用

鉴于SRAP的独特的引物设计方法导致其只能扩增开放阅读框（ORF）区域，因而难以涉及到着丝粒及端粒附近的区域。因此，如果SRAP标记与其他分子标记结合起来，研究结果就更全面、更可靠。Shao等［46］以药用菊属的31个种为材料，进行了形ISSR标记、SRAP标记3种标记方法的比态标记、较，得出了ISSR+SRAP标记更有效，而SRAP标记

［47］

次之的结论。Wu等用ISSR和SRAP标记对广藿香16个中国种群进行了遗传多样性和亲缘关系

结果发现，两种方法均表明广藿香种群间的多研究，

态性比种群内丰富，使得结论更有说服力。Fu［48］

ISSR标记和形态学标记对22个等采用SRAP、

中国石竹自交系、小叶龙竹1个品种和瞿麦1个品

种进行了遗传多样性评析，结果表明3种标记方法综合分析结果比单独分析结果可靠。因此，可以看株DNA片段缺失有关。秦贺兰等

［45］

蓿

［18］

［27］［28］［29］

蓝、万寿菊、木兰科、鸭茅（Dactylisglomera-ta）［30］和石竹［31］等。

2.2遗传图谱构建

遗传图谱是通过遗传重组交换结果进行连锁分

是析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图，植物遗传育种及分子克隆等应用研究的理论依据和

［32］

基础。目前用于遗传图谱构建的分子标记主要RAPD、AFLP及SSR等。但研究结果表有RFLP、

明，用RFLP技术作图其图谱密度较低；RAPD技术重复性差；AFLP技术难度较大、费用高；SSR技术费用高且图谱密度低；而SRAP技术简单快速，稳定性、多态性好，在遗传作图研究中具有一定优势。Gao等［33］用92对SRAP引物对白姜花×圆瓣姜花的F1系87个单株建立了两张中等密度的父母本连

其中母本连锁图有18个连锁群，包含139个锁图，

标记，总长917.1cM；父本的连锁图有23个连锁群，包含203个标记，总长1386.8cM，并伴有一些三联体和二联体。这说明SRAP技术在遗传图谱构建方面是可行的。

SRAP技术在农作物的遗传图谱构建应用较

［34，35］［9］［36］

、多，如黄瓜棉花、甘蓝型油菜、不结球白

［37］［2，38］［39］［40］

、菜、甘蓝红麻及甘蔗等植物的遗传

图谱构建。今后可以尝试利用SRAP技术构建园林

植物的遗传图谱，为培育新品种提供理论依据。2.3

种质资源鉴定

SRAP技术因其具有较高的多态性可以更好地

［41］

应用于种质资源鉴定。郑轶琦等采用SRAP技

术从假俭草（Eremochloaophiuroides）两个杂交组合的4个亲本及其杂交后代中鉴定出（E102×E092（1））组合中真杂种有89个；（E142×E022）组合的杂交后代中真杂种83个，此试验也证明了SRAP可

［42］

用于检测后代纯度。叶青雷等利用8对SRAP引物建立了8个地区的麻栎亲缘关系树状图，表明

2011年第11期

史倩倩等：SRAP分子标记在园林植物遗传育种中的应用

参考文献

77

出采用多种标记方法相结合的方法进行研究更系统化，更科学。

SRAP标记结合其他标记方法在多种植物中得

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［57］

、油菜遗传多样分析、红麻遗传连锁图谱构［58］［59］

甜菜遗传多样性分析、石斛亲缘关系分建、

［51，52］［53］

析

［56］

析

［60］、桃遗传多样性分析、烟草遗传图谱构［61］［31］［62］

石竹、杨树遗传多样性分析、鹅掌楸遗建、

［16］

、簸箕柳―绵毛柳遗传图谱构建、

［65］

芝麻遗传多样性分析、枣属植物亲缘关系分传图谱构建

［66］

［63］［64］

析及荔枝遗传图谱构建

［67］

等。

3

SRAP标记技术在园林植物遗传育种的

应用前景

SRAP标记用独特的引物组合，针对基因组

DNA开放阅读框进行PCR扩增，由于物种及个体间的差异导致内含子、启动子和间隔序列不同而产生

SRAP多态性。由在不同研究领域应用的结果发现，SSR和AFLP等常用分子标标记不但集中了RAPD、

记各自的优点，而且还弥补了这些标记所没有的优稳定性高，重复性好，操作简便，在基点：多态性高，因组中分布均匀，有一定比例的共显性标记，效率SRAP标记在园林植物的遗传育高，成本低。因此，

［68］

种研究中具有广阔的应用前景。任羽等认为若将可扩增这些区域的SSR标记与SRAP标记相结合，将可得到覆盖整个基因组的高饱和度遗传连锁图。吴建明等认为若将AFLP与SRAP技术结合起来，可得到更全面、更丰富的差异片段，从而在植新基因发现、抗逆性分子机理研究物基因差异表达、

等方面发挥更大的作用。因此，结合其他的分子标记技术更能充分有效地应用于研究中。

SRAP技术在园林植物遗传育种研究中总之，

已经步入了广泛使用的阶段，应适当结合其他分子标记技术，更快速构建园林植物高密度遗传图谱，更好地运用于遗传多样性分析，亲缘关系鉴定，种质资源鉴定，基因表达调控研究，基因的分离鉴定等，在分子水平上为新品种选育提供充分的科学理论依据。

［69］

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