棉花SUPERMAN类锌指蛋白基因GZFP的启动子及功能分析

棉花SUPERMAN类锌指蛋白基因GZFP的启动子及功能分析

棉花学报CottonScience2011，23（6）：483~489

研究与进展

棉花SUPERMAN类锌指蛋白基因GZFP的

启动子及功能分析

杨郁文1，周建武2，张保龙1*，范晓慧1，任永哲1，陈天子1

（1.江苏省农业科学院农业生物技术研究所/江苏省农业生物学重点实验室,江苏南京210014；2.扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州225009）

摘要：GZFP是来源于陆地棉的一个SUPERMAN类锌指蛋白基因。为了进一步了解该基因功能，本研究通过染色体步移（Genomewalking）获得其启动子区域，并构建该片段与GUS连接的重组载体pBI-pGZFP-5::GUS，通过花浸染法转化拟南芥。转基因植株的GUS染色结果表明GUS基因主要在根部以及花器官表达，而叶片中的表达量很低，并且根部的表达量在整个生育期都很强。通过半定量RT-PCR分析不同诱导下GZFP基因的表达变化，发现ABA、干旱、盐胁迫诱导可以提高其表达量。构建GZFP过量表达载体并通过叶盘法转化烟草，烟草转化株的表型无明显变化，但是转化株中NtOPBP1和NtERD10的表达量较未转化株明显增强，而这两个基因都参与了植物的抗逆反应，说明GZFP基因可能与植物抗逆相关。关键词：锌指蛋白；陆地棉；启动子；抗逆中图分类号：S562.035.3

文献标志码：A

文章编号：1002-7807(2011)06-0483-07

FunctionalAnalysisoftheSUPERMAN-likeZincFingerProteinGeneGZFPandItsPromoter

YANGYu-wen1,ZHOUJian-wu2,ZHANGBao-long1*,FANXiao-hui1,RENYong-zhe1,CHENTian-zi1

(1.InstituteofAgrobiologyGeneticsandPhysiology,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing,Jiangsu210014,Chi-

na;2.CollegeofBioscienceandBiotechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225009,China)

Abstract:GZFP,derivedfromGossypiumhirsutumL,belongstotheSUPERMAN-likezincfingerprotein.TofurtheranalyzethefunctionofGZFP,thepromoterregionofGZFPwasobtainedbygenomewalking.TherecombinationvectorpBI-pGZFP-5::GUScontainingthepromoterwasconstructedandtransformedtoArabidopsisbyAgrobacterium-mediatedmethod.GUSstaining

showedGZFPpromoterdrivenGUSactivitywasspecificallydetectedinrootsandflowersandtheactivitywasverylowinleaves.Inaddition,theGUSactivityinrootswasverystrongthroughoutthewholegrowthperiod.Bysemi-quantitativeRT-PCR,wehavefoundtheexpressionofGZFPwasinducedbyABA,droughtandsalt.Theoverexpressionvectorwascon-structedbyinsertingGZFPintothepCAMBIA2301,tobaccoplantsweretransformedbyco-cultivatingleavesmethodviaA-

grobacteriummediation．TheobjectgenewasverifiedtohavebeenintegratedintothegenomeoftobaccobyPCR.Thepheno-typeoftransgenicplantswasnormalcomparedtothewildtype,buttheexpressionofNtOPBP1andNtERD10wasrelativelyhigherthanthewildtype.Asthetwogenesinvolvedinthestressreaction,GZFPmayhavesomerelevancetotheplantstressre-action.

Keywords:zincfingerprotein；uplandcotton（GossypiumhirsutumL.）;promoter;stressreaction

SUPERMAN类锌指蛋白具有N端QALGGH

录调控因子，可能同时控制着数个信号通路[1]。对

和C端富含亮氨酸L(I)DLXLR(K)L的保守结构SUPERMAN类锌指蛋白的功能进行分析，发现

域，是属于C2H2型锌指蛋白中的单锌指蛋白。这这类基因的生物功能具有多样性。如矮牵牛的

类锌指蛋白基因的表达量都很低，并且在不同物PhSUP1，玉米的ramosa1，拟南芥的SUPERMAN，种中的同源性也很低，说明它们是一类重要的转

RBE，KNU等，参与调控花器官的发育；LIF调控

收稿日期：2011-05-24

作者简介：杨郁文（1979-），女，硕士，ywyang92@；*通讯作者，zhbl2248@

基金项目：转基因生物新品种培育重大专项（2009ZX08005-003B）；江苏省自主创新项目（2009ZX08005-003B）

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植株的形态建成；拟南芥SAZ与抗逆相关[2-8]。

对基因启动子进行相关分析可以更好地了解该基因的功能。对拟南芥SUPERMAN启动子进行分析，发现其使GUS基因主要在花器官中表达，并且表达部位随着花器官的不同发育阶段而发生变化[9]；SAZ基因的启动子使GUS基因主要在叶片和幼蕾的雌蕊中表达[8]；AtZFP12主要在器官的边界处表达，如腋芽的基部，花柄的基部，根分生区与伸长区边界处等[10]。

GenomeWalkerTM试剂盒并按试剂盒说明书进行

操作。

1.2.2半定量RT-PCR。用CTAB法提取各器官

的总RNA，用DNaseⅠ（Takara公司）处理总

RNA，去除样品中的DNA污染。RT-PCR模板制

备参照cDNA第一链合成试剂盒（北京全式金）进行。用于半定量RT-PCR的基因特异引物为

Zf141，Zr401。根据陆地棉持家基因（索取号：AF024716）设计的引物HF和HR作为棉花内参

引物；根据烟草组成表达基因Actin(EU938079.

GZFP是来源于陆地棉的一个SUPERMAN

类锌指蛋白基因，在棉花花器官和根部的表达量较高[11]。本研究通过分析该基因的启动子，同时对其过量表达转化株进行相关研究，旨在初步了解该基因功能。

1)设计的引物AF和AR作为烟草内参引物。

1.2.3GZFP启动子载体和过量表达载体的构

建。用于构建启动子载体的引物为Zp9和

Zp1498，PCR扩增片段两端分别引入Sal1和

Bamh1酶切位点，PCR产物用这两种酶进行酶

1

1.1

材料与方法

实验材料

本研究所用的植物材料为常抗棉(Gossypium

切，与经相同酶双酶切的植物表达载体pBI101.1（Clontech公司）连接。将以上获得的启动子片段连接在β-葡聚醛酸酶(GUS)基因的上游5'端获得重组载体，命名为pBI-pGZFP-5::GUS（图1）。用于构建植物过量表达载体的引物为Zf9-Xba1和Zr705-Sac1。以常抗棉cDNA为模板进行PCR扩增，用PCR清洁试剂盒（AXYGEN公司）对扩增产物进行清洁。用XbaⅠ和SacⅠ同时对PCR产物以及植物表达载体pCAMBIA2301进行酶切，分别回收它们的酶切产物并连接，将连接产物转化大肠杆菌JM1090感受态细胞（图2）。挑选阳性克隆并提取质粒，对这些质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定，将鉴定正确的克隆转化到农杆菌

hirsutumL.)。该品种属中熟陆地棉类型，通过多

年的抗性鉴定，该品种抗枯萎病，高耐落叶型黄萎病[12]。盐胁迫处理条件为用14.6g·L-1NaCl溶液直接浇灌棉株；冷胁迫处理为将棉株置于4℃下生长；干旱处理为用20%的PEG8000直接浇灌棉株；重金属处理为用1.6g·L-1CuSO4溶液直接浇灌棉株；脱落酸（ABA）处理为用15mg·L-1的ABA溶液直接喷洒植株，同时设置清水处理对照株。分别取不同诱导和水处理的植物叶片，迅速置于液氮中，-70℃存放备用。

1.21.2.1

实验方法

LBA4404中。

启动子获得。根据GZFP基因设计了2个

1.2.4植物转化。用花浸染方法转化拟南芥，分

棉花学报

反向引物Zp347,Zp270用来获得基因的5'末端。参照Paterson等的方法提取常抗棉叶片的基因组DNA[13]，染色体步移法参照Clontech公司的

单株收获拟南芥种子[14]。采用叶盘共培养法进行烟草转化，将消毒好的外植体烟草叶片剪成1cm2大小，置于含有重组质粒的农杆菌侵染液中浸泡

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图1GZFP启动子表达载体pBI-pGZFP-5::GUS

Fig.1PlantexpressionvectorpBI-pGZFP-5::GUScontainingthepromoterofGZFP

图2GZFP过量表达载体构建

Fig.2TheoverexpressionvectorofGZFP

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3min，放滤纸上吸干后，于MS培养基上暗培养pBI-pGZFP-5::GUS拟南芥转基因幼苗全株，将植

2d，以未浸泡处理为对照。将上述共培养叶片转

株根部洗净。参考Jefferson等的荧光组织化学定移至含有激素IAA（0.2mg·L-1）和6-BA（0.2mg

·位法[15]。

L-1）的分化培养基上，25℃培养。当愈伤组织长出

1.2.6引物设计和序列比较分析。根据参与烟草

新生芽时，切下小芽转入含有硫酸卡那霉素（100应答反应的相关基因设计14对引物，用于检测

mg

·L-1）及头孢霉素（200mg·L-1）的筛选培养基，GZFP过量表达转基因烟草中相应基因的表达量

每隔10d左右换1次培养基，再将筛选到的抗性变化（表1）。

绿苗转入生根培养基中生长。当生根苗长至2～3周时，移栽于土壤中。选取非转基因和抗性烟草2结果与分析

株，用CTAB法提取叶片基因组总DNA，用引物

2.1GZFP基因启动子分离与特征分析

Zf9-xba1和Zr-705-sac1进行PCR扩增。从筛选

通过染色体步移获得GZFP基因的启动子区

到的烟草转化株中提取RNA，并反转录为cD-

域（图3），用PLACE数据库（http://www.dna.af-

NA，用相同的引物在转录水平上进行检测。

frc.go.jp/htdocs/PLACE/）分析该序列，发现多个

1.2.5GUS染色。取在培养箱中生长的

器官特异的元件，如5个花粉特异表达元件

表1

用于PCR扩增的引物序列

Table1

sequencesofprimersusedforPCR

引物名称索取号引物序列PR-1aF

EU104742.1GGATGCCCATAACACAGCTCPR-1aRGCTAGGTTTTCGCCGTATTGPR-1gFX14065.1TCCCTCAACTTAACGCTGCTPR-1gRGCTTCGAACCCTAGCACAACPR-2FAF141654.1AGCAGCATCAGGGTTGCAAGAPR-2RGGCCAGCCACTTTCAGATACPR-4FX60282.1AGTTAATAATTATAAGTTGTGPR-4RTTGCAGTTGACAAATTCATAGNPR3FX64519.1GCTGGCTTAGAGAACAAGNPR3RTGTCACCAGGACTAACANPR5FX95308.1TGGTGGAGTCCTACAATGNPR5R

TGTAGGATCATCTTGTGGNtERD10AFAB049335.1TGAGAAGAAGGGAATTATNtERD10ARTGTAAGACACTGCTTCCANtERD10CFAB049337.1CGGTCTTTGAGTGATATCCNtERD10CRAGAAGAAAGAGGAGCACA

NtOPBP1FU81157.1ACGAGGAAAAACAAAATGGATTCTNtOPBP1RACTAAAGAACAAAGAGATGGAATTCCNtSAR8.2FAY644732.1CTTTGCCTTTCTTTGGCT

NtSAR8.2RGACATTTAGGACATTTGCTGCNtHIN1FAB091429.1GAGCCATGCCGGAATCCAATNtHIN1RCTACCAATCAAGATGGCATCTGGNtHSR203JFX77136.1TAGCCACGCAGATGCAAACCNtHSR203JRGTGACAATCAAGACGGTAC

NtC7FAB087235.1GAAGCTTACGTTCCGATGCAAAGTCNtC7RAGAAAGTACAAATATCCATTC

NtdinFAB026439.2GAATTTAGTGATGGGCATGCTCCTGNtdinRAGTAATCTTATCAGATTCACCACAFEU938079.1AGGGTTTGCTGGAGATGATGARCGGGTTAAGAGGTGCTTCAGHFAF024716GAAGCCTCATCGATACCGTCHRCTACCACTACCATCATGGC

Zp347DQ109816GTGTGTGGGTCCTTAATGGTTTGAGTZp270TACAAACTGTGAGCCTCTGACTGAAZf141DQ109816TCCGTGCCAGCCTGATGAGGTTTGZr401CGAGGAAGAATGGTAATAAGGTCATG

Zp9DQ109816AGGTCGACAATCTTAAACACCTAATTGATCATAAAGZp1498AGGGATCCATAGGGGGTGAAAAGAAAAGGGATTZf9-Xba1DQ109816

AGTCTAGATTTCACCCCGTATTGTAATGGAGCAZf705-Sac1

AGGAGCTCCCCAAGCCGGAGTTCCAGATCTATG

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POLLEN1LELAT52（AGAAA），6个根特异表达

相关元件ROOTMOTIFTAPOX1（ATATT），1个根毛特异元件RHERPATEXPA7（KCACGW）；除此之外，还含有一些与胁迫相关元件，如无氧胁迫元件ANAERO1CONSENSUS（AAACAAA），

干旱胁迫元件CBFHV（RYCGAC），MYB1AT（WAACCA），ABA响应元件DPBFCOREDCDC3（ACACNNG），MYCCONSENSUSAT（CANNTG），伤害诱导元件WBOXNTERF3（TGACY）等。

图3GZFP基因的启动子序列

棉

为了进一步了解GZFP的启动子特征，对

花

学GZFP启动子转化株的幼苗和成熟苗分别进行报GUS染色。只有2片子叶幼苗的GUS染色结果

在两片子叶中间的胚芽位置也有稍许显色，这个位置存在一个生长点，主要为分生组织（图4）。对植株全株染色后发现，根部仍然显色最深，说明在整个生育期GZFP基因都在根部表达，并且表

Fig.3ThepromotersequenceofGZFP

顶部和与果柄连接处也有显色，但在叶片中着色最浅（图5）。

2.2GZFP基因的诱导表达

棉花幼苗不同处理结果显示，与对照相比，

显示：在幼苗期，只有植株根尖部分显色最明显，

ABA，PEG，NaCl处理均使GZFP的表达量增高，

特别是ABA处理后表达量增加最为明显（图6）。

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2.3GZFP过量表达转基因植株的获得与相关

通过抗生素筛选和PCR鉴定，共获得22个

防卫反应基因的表达量变化

转基因植株（图7）。同时，提取这些转基因植株的

达量最强。另外，花器官的部分组织中也有显色，主要表达部位为花柱和雄蕊。除此之外，果荚的

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RNA，通过RT-PCR检测发现目的基因可以正常

表达。为了分析GZFP过表达对植株造成的影响，随机选择8个转基因植株，检测这些转基因株系

（Osmotinpromoterbindingprotein1）属于

AP2/ERF类转录因子，参与植物的抗病和耐盐反

应[16-17]。NtERD10为脱水素基因（Dehydrin），也被称为Lea基因的D-11类型，特点是受干旱、盐以及冰冻处理后表达量大幅提高[18-19]。

14个防卫反应相关基因的表达变化，发现在14

个基因中，NtOPBP1和NtERD10的表达量都有明显增加，其余变化均不明显（图8）。NtOPBP1

A.Wholeseedling;B.Rootsoftransformedseedling;C.Plantuleandleavesoftransformedseedling.

图4

GZFP基因启动子转化株幼苗的GUS染色

Fig.4GUSstainingofthepromoterofGZFPtransformedArabidopsisseedlings

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A.Wholematuretransformedplant;B.Rootsofmaturetransformedplant;C.Floralorganofmaturetransformedplant;D.Podofmaturetransformedplant.

图5

GZFP基因启动子转化株成熟株的GUS染色

Fig.5GUSstainingofthepromoterofGZFPtransformedArabidopsismatureplants

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CK.treatmentwithwater;1.treatmentwithCuSO4for24h;2.treatmentwithCuSO4for48h;3.treatmentwithPEGfor24h;4.treatmentwithPEGfor48h;5.treatmentwithABAfor24h;6.treatmentwithABAfor48h;7.treatmentwithNaClfor24h;8.treatmentwithNaClfor48h.

图6

不同处理常抗棉中GZFP的表达

Fig.6TheexpressionanalysisofGZFPafterdifferenttreatments

CK1,CK2:untransformedplants;1-22:transformedplants.

图7

转基因植株的PCR检测

Fig.7PCRanalysisofthetransformedplants

CK1:untransformedplant;1-8:transformedplants.

图8

NtERD10和NtOPBP1基因表达量在GZFP过表达植株中显著增加

Fig.8TheexpressionofNtERD10andNtOPBP1wasinduceddramaticallyinGZFPoverexpressionplants

3讨论

转录因子通过特定的结构域与相应的顺式

NIP2启动子为根特异启动子[21]。棉花抗病相关基

因GHNBS基因的启动子使GUS基因在根部和韧皮部优势表达[22]。燕麦AsCYP51H10基因参与合成杀菌化合物（Avenacins），该基因的启动子也为根特异启动子[23]。

脱落酸（ABA）是一种重要的植物激素，其在植物干旱、低温、高盐等逆境胁迫中都发挥了重要作用。GZFP在受ABA诱导后表达量迅速上升，进一步说明该基因可能参与了植物的胁迫反应。而GZFP的过表达可以诱导NtOPBP1和

元件相互作用调控基因的表达，在植物的生长发育及其对外界环境的胁迫反应中起着重要的调控作用[20]。不同SUPERMAN类锌指蛋白基因之间的同源性都较低，而且它们的生物功能具有多样性。目前从拟南芥、矮牵牛等植物中获得的该类基因一般都参与植株发育与抗逆胁迫。

GZFP是来源于陆地棉中的一个SUPER-

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MAN类锌指蛋白基因，半定量RT-PCR显示该

基因表达量最高的是花器官和根部[11]。本研究通过进一步分离GZFP启动子，通过GUS染色确认该基因的表达特征，发现在整个生育期GUS基因都在根部表达，并且表达量最强。另外，花器官的部分组织中也有显色，主要表达部位为花柱和雄蕊。这些结果与RT-PCR的结果是一致的。根是植物体吸收水分和营养物质的重要器官，也是与根际微生物最先接触并互作的地方，所以根部优势表达启动子多为抗逆相关基因和调控植株生长发育的启动子。如抗逆相关的水通道蛋白

NtERD10的上调表达更加验证了这一猜想。NtOPBP1属于AP2/ERF类转录因子，有相关报

道称将该基因转化水稻，可以提高水稻的耐盐性以及对稻瘟病（Magnaportheoryzae），立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）的抗性[16]。同样，NtOPBP1在烟草中过量表达可以提高烟草的耐盐性以及对烟草假单胞杆菌（Pseudomonassyringaepv

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tabaci），烟草黑胫病菌（Phytophthoraparasiticavarnicotianae）的抗性[17]。NtERD10为脱水素基因

（Dehydrin），大量研究证明该基因可以提高植株

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的耐寒性、抗盐性和抗旱性[18-19]。同时，也有报道443-448.

称Dehydrin基因参与了ABA调控的休眠性状的[12]王红梅，张献龙，李运海，等．陆地棉黄萎病抗性遗传分析

表达[24]。通过本研究，可以确认GZFP参与了A-

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WANGHong-mei,ZhangXian-long,LiYun-hai,etal.AnalysisBA的信号传导，其作用位置在NtERD10和

ontheinheritanceofVerticilliumdahliaeresistanceinG.hirsu-

NtOPBP1的上游，并可能通过这2个基因参与抗

tum[J].CottonScience,2004,16(2):84-88.

逆反应。

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