高效液相色谱-电化学检测多胺的研究

高效液相色谱-电化学检测多胺的研究

研究简报 qC hoaor高效液相色谱-缁庄韬剑L魄倜沸煨奕 (

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蒲г上 R┪镅荷海药研究所，203)虾物 胺(oymn)侵干锾迥诠惴多

国产分析纯试剂，水为超纯水。

118

(二)标准溶液和衍生约恋制精艹苌剂呐渲凭

存在有两或两个陨氨的肪胺的带个鲆上被闹景以习基取多胺，其溶于 00 o HI校淙苡的总啤主S脒 (em de S)配制 1μ l m的月贮存液，再稀释艹。饕有称V要芯 s i, n P D成 0m/胺 (prsi e PT,ò( p rie u, )精胺 s e U成μo 的周贮存液， 1 l闹蘭/ m使用时再稀SM,和尸胺(aaeie A)6喟吩核酸，蛋白质代谢及细胞繁殖分化中起调释成1 ml

中保存妗 4 OA苡谖匏将

!掖汲 1m/m醇 0

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节和刂谱茫为颂ぃ赴控作用，H迳制人

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需。17年Rsel1紫缺ǖ懒税┲⒉人尿中多胺浓度增加，引起了人们广泛的

溶液硼酸缓芤，峄撼冲液为 . l 1/L鹚嵋 ml aO调到p .。衍试劣由 o/ N苌剂重视。为此，人们建立了许嗖舛胺的 1 2μ多定多返测姆方 0蘬OA匏掖既芤海 0 0法，其中主要是色谱方法，18年，Siμ l鹚峄撼逡夯旌献成 i,tr组槌对测定多胺的各种色谱方法进行了综述， ㄈ┭苌从 0μl苌约梁 和其中电化学检测法是个空缺。鉴于电化学 5μ l喟混合，在涡混合器上多胺振荡6 s,检测法具有很高的灵敏度和选择性，及其静 0,加 0μl宜嵋阴再旋混仓尤酯在检测儿茶酚胺中的成功应的工作。

仓 0后取乙酸

乙酯层 2μl样蘬

(四)色谱跫柱 0 0 c滋件：× . m条 I.盍衔狶ihoob -8 R ( 1Bo hμ)杀舅装填。O赐岩疤睢液为甲醇-磷酸缓冲逡 (A)槌内含离子 p撼 T组胱试剂CA . o E )髁 l L。流 TA梯度：起始流量 1. ml mn 2课 /为 m时瞬间上升至20 m并⒈3种练治 m i保结束，整个分析时间 0湓 i。电化学检约测器的氧电缥趸设定为1

实验部分

(ㄒ )瞧器和试约粮咝效液一┮骱褪唬б合嘞低呈怯Wa tes 00泵、M6梯度程序仪， M A谩 0

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K进器，C B 1偷缁学检样鳎 L4

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器( o ay c l se N.及 B a li a S inCrmt成。伞 a 0 o! !

S、S、U CD苯二 M P P、 A傲诒蕉 P D T甲醛 o t l l hyd跣OA ( -hh ad a e e缩写 P碠 )自S ga t oi O U A )乙 9 m ( . usM, S S L,

与讨论 Lol,n l! !设定

硫醇 ea hl虼 (t n i, h et o ET.来自EMr(amtd atGFR)磷帷三乙贰姿、野、酸⑷胺

一)流动 (相的选择实验中通过研究笛流动嘧槌扇缂醇比例、p、离子对试鞫状急CA叭野罚═E)的浓度来模索分离，的最佳条件，下面分别

甲醇 d-脑撬钠 s d状肌 l聊磺酸 (o iu lcm、樟曰崮po-0sloae S)硼酸

高效液相色谱-电化学检测多胺的研究

甲醇浓度对多胺衍生物容量因子 (' k)的影响：甲醇浓度增加，k减小，符合反相 '色谱的一般规律，考虑到四种多胺的保留时间和分离情况，最后选定甲醇浓度为

61 . )流动相中若不加 C A就会出现 S M S P峰消失的现象，而 C A浓度增大时， S

SM峰的对称性变好。Sadn曾指 P kae[ 3]出 S M上仲胺基的存在会诱导分子内亲 P核取代反应的发生，使 S M衍生物分 P

8%。 . 0 2流动相p H对多胺衍生物k '及分离因子的影响：流动相 p H增高，k '略有上升，这是因为多胺衍生物在酸性流动相中与氢离子结合而体现出部分阳离子交

解。在流动相中加入C A后，由于C A S S是阴离子离子对试剂，它能与带正电的

- H- N 2形成离子对，从而限制了SM上 P仲胺基的活性，减缓了 S M衍生物的分 P解，故能改善 S M的峰形。4三乙胺浓 P .度的影响：三乙胺浓度对四种多胺衍生物 k的影响如图 1 '所示，从图中可看出，三乙胺浓度从01 l L增加到0 mo/ .mo/ . lL 5

换色质的故， H对SM、 P谱性缘但p P SD的分离影响较大，当 p H从 5增至 6 . 3 . 1

时，从1降 .。虑 H太α .至12考到p低易 8 5引起多胺衍生物的分解，p H定为 5 0 .。 93 C A浓度的影响：C A浓度从零增加 . S S

到 1m o/L运闹侄 2 l m喟费苌锏膋 k '响不大，但发现 C A浓度的变化对 S M S P衍生物的稳定性及峰的对称性有很大影

时，SM、SD的出峰顺序发生了交换。 P P在反相色谱中，一般认为洗脱次序由样品的疏水性

决定，疏水性越大，保留时间越

响，在 8%甲醇-.m l三乙胺 ( 0 0 o/ 1 L p H

长。计算四种多胺的l P o值： g

l PP= (19 1 (0 )2 (0 7= 8 o S 2 -. ) 0+.+ -.) 2 g M 1+ 5 1 2 . l PP= (19 7 (0 )1 (0 7= . o S 2 -. )+.+ -.) 0 5 g D 1+ 5 1 9 1 PU= (19 o P 2 -.)4 (0 ) - . g T 1+.= 0 8 5 31gCD (1 9+ (0 ) . oPA= - . )5+ .=0 2 2 1 5 1性，所以 S D、S M较 P、C D先 P P UT A洗脱。就 S D、S M而言，一方面 S M P P P的疏水性大于 S D P,另一方面 SM的极 P性基团比 SD多。在 01 l P .mo/ L三乙胺洗脱液中，离子强度较小，疏水性占主导地

出峰顺序应为 P T C D、 SD、 U、 A P

SM。但考虑到四种多胺的伯胺基都被 PO A结合， SM、 S D上的仲胺基 P P P

(P两个，SD一个)在酸性洗脱液中 SM P与氢离子结合成带电阳离子而增大了其极位，疏水性大的后洗脱，出峰顺序为

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SD、S M。在 0 mo/ P P . l 5 L三乙胺洗脱液中，离子强度较大，极性基团的影响占主导地位，故出峰顺序是 S M、SD。三乙 P P胺浓度增大还能进一步改善 S M的峰 P形，这可能是因为固定相 LC rsr ihoob

R -8 P 1上未被封闭的，常是诱发样品分解的活性中心的自由硅羟基被高浓度的三乙胺形成氢键的形式所饱和，不再对多胺衍生物产生影响的缘故。5最佳流动相的组 .成：8%甲醇与05 l 0 .mo/ L三乙胺磷酸缓

10 0%计算的。从表中可以看出，四种多胺的衍生物在前 6 h内含量略有增加，第 7 h含量才略有下降。这可能是由于乙酸乙酯在萃取多胺衍生物的同时，也萃取了少量游离多胺、O A及 E,这些化合物在乙酸乙酯 P T中进一步合成少量多胺衍生物，故开始时含量略有上升。7后多胺分解成没有电化 h学活性的物质。其中 S M的分解略大于 P

其它三种多 2h胺， 4时更为明显。kae[ Sadd曾报道 S M衍生物在 2 h内分解 2%。 P . 5 0从我们的实验结果看，四种多胺衍生物在 6 h内都很稳定，故已满足分析要求。 ( )精密度试验日内精密度四

冲液的混合液 (内含9 o/ S m l C A和 m L 0 1 m l L T,为 59, . o

/ E A p m D H . 0 V/ ) V。四种多胺衍生物在5 mn 0内达到 i完全分离，见图2。 (二)工作电位的选择当工作电极的氧化电位增高时，多胺衍生物峰高增加。 SM、P T A P U、C D的峰高在 0 5 . V时达 6

(= C s n 4 Vp ) m为 006 C S .3, P V D为

000 C P .4, U V T为 006 C C .2, A V D为

002 .。日间 2渚精密度 (= VP n 8 )C S M为到最大值，以后略有下降。SD在0 5 0 6, S P .V 6 . 3 C P为 0 4, PT . 5 0 V . 2 C U为0 5, 0 V 0时峰高仍有上升趋势，但氧化电位超过 C CD . 8 VA为0 5。 0 (五)线性关系 SM在510 o P -0 p l m 0 0 . V后基线电流很大，无法进行实验， 7所以实验中采用的工作电位为 0 5 .V 6表 1多胺衍生物的稳定性试验结果

范围内色谱峰面积与样品浓度有良好线性

关系，其余三种多胺浓度在 1 1 p o -0 m l 0范围内与峰面积有良好的线性关系，其标准曲线见图 3。

(三)多胺衍生物的稳定性多胺衍生物用乙酸乙酯萃取后取一定量即刻进样，测定其峰高，剩余的乙酸乙酯萃取液于冰壶中保存，每隔 1测定一次峰高，与即 h刻进样时的峰高进行比较以检验其稳定性，结果列于表 1。表中多胺的百分数是以衍生后立即进样的多胺峰的峰高为

(六)检测极限 S M的检测极限为 P

2 l SD U和C D的 p o P、P T A检测极 m,限为 1 l po m。参考文献

[] D. R s lNa r(od n,,4 (91 1 l t e n o)2314 7) e, u L 3 1 .

[] .ir . r a g.7, 7 8 . 2 NSl, o t r 3 1 ( 6 e J h m o, 5 1 ) e C 9 9

高效液相色谱-电化学检测多胺的研究

[] T.k a e a d G rir k JCh o aog .2 7 3 S a d n n T. eb ok . rm t r 4,

wi i une t s bi ad eaa o o h h f ecd e ait n sprt n f c n l h t ly i pl mi - P adc w r ea nd n te o a n O A d ut ee mi y e s x e ad h

11 18) 1 (92 . (收稿日：18年 9月 1期 99 9日)

o ia cni n t s a t se i ( M) pm l di s e r e r n S, t o t o o p a p

m e P s rin ( D ptsn ( T Cdv i (A ) p md e ) u e i P ) aa re D e i S P rc e U en C

D t mnt n P l mns Hg Pr r ac eri i o o a i b i e a o f y e h f m ne eo L u C rm t rpy t Eet ce i l t tn i i ho a gah w h c ohmc D e i q d o i lr a e co

wrpo oe h dt t n top l m ns e ee psdT e e i l s o a iew r2 r e co i mi f y e p l S M, he o fr D P T d D mo fr w i l m l S, U a C o P l p o P n A Te er t nhp ten a aes cne- h l a rai si b w e p k a ad cn i n e o l e e r n o tt n o S M a prc wtn 10 l g, r i s P w s f t h 5 0 p a o f ee ii - mo rne a ad ler g o S D P ad D a 1 10 n te a rne P h i n a f UT C n A w s 0 - p l mo .

Z a Ln ag ag mi X Xu n hnhi h n ihn, n Qn ead iogSaga u g g T i n u rI tu oMa r M ei cdma i 001 n i t f t i d aAa e iSn a203 st e e a c ic A nvl r cl oe pe o mn O A dr ai t n - u P evtai z o ( p ta l hd e ae i dr azt n L E o h l d ye hnt o ei tao ) C - h ae t h l v i i Cmeh d asy la ns pee td T e co s to t sa p y mie i rsne o o s h f tr a

用高效液相色谱-固定化碱性磷酸酶柱后水解分析三磷酸肌醇 *叶惟泠陈克樱朱培闳(中国科学院上海生理研究所，00 1 203)

李士云袁中一(中国科学院上海生物化学研究所，20 3) 00 1

D m o肌醇-1 4 5 - - y -三磷酸 ( 3是许多 I ) P动物细胞内重要的第二信使之一。分离和检测 I3 P对研究多种递质或激素的作用机制和生理功能都有重要的意

3℃、p 1. Ti bfr每分钟水解 7妗 H 2 r- ue中 0 5 s f 1 o对硝基酚磷酸二钠的酶量 (科院μ l m中

东风生化试刘厂产)。标样 I3 P,异构纯，西德柏林格尔曼海姆公司产；5一磷酸腺 ' -

苷 (- AMP )和三磷酸腺苷 (T )购 AP物，没有生色团、荧光团或电活性基团，自S m公司。其余试剂均为分析纯和优 i a g因而不能直接用高效液相色谱 ( P C H L )-级纯。实验用超纯水购自上海测试技术研紫外、荧光或电化学检测法来分析。然而究所，使用前再经双蒸处理。 (二)固定化碱性磷酸酶柱的制备按在一定条件下，I3 P可被碱性磷酸酶水解产生无机磷酸、磷酸又迅速与酸性钼酸铵前述方法将酶偶联在 A S - B E交联琼脂载体上〔,固定化酶活力为 5 5〕单位/克湿反应，可在紫外-可见光波段检测其反应产物[。据此，我们制作了固定化碱性 3]填料。用注射器将填料注入自制的聚四氟磷酸酶柱，尝试了在联机的情况下经阴离乙烯短柱，3 2 m ( 0 m内径)。子交换色谱-碱性磷酸酶水解-酸性钼酸铵 (三)配制酸性钼酸铵每次实验按下反应- 30m检测 I3在 8n P的方法。列体积比，1%钼酸铵：浓硝酸：1% 0 0 Ti n 10: ro X 0水=1 1: 1,配制新 t -: 2: 6材料和方法鲜的酸性钼酸铵溶液。为去掉 Ti n ro t (一)试剂固定化酶的载体对氨 X 0 -10中的磷酸根，每 10 1% 0m 0 l基苯砜乙基 ( B E交联琼脂 ( A S )- 8 T t X 10 5 o e 1 8树脂 i n ro - 0加 g wx D

义〔2。由 P是种醇水合 1〕于I一环碳化， 3

目 )系自 4。制[碱性磷酸]单脂酶，规格20单位/毫克蛋白，1 00单位定义是：在*本课题为国家自然科学基金资助项目

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