基因工程实验

1.动物细胞DNA提取原理是什么?

答：先用SDS裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。然后用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提，使蛋白质变性沉降到酚与水相的界面，DNA则留在水相中，离心后在上清液中加入醋酸钠和两倍体积无水乙醇，除去多糖物质和沉淀DNA，然后离心后沉淀用70%乙醇洗涤，最后用ddH2O溶解沉淀DNA，－20℃保存。 2.DNA提取中用到了哪些试剂？有什么作用？

EDTA:二价金属离子螯合剂，螯合Mg2+，抑制DNA酶活性。因为Mg离子是DNA酶的辅因子。

SDS:一种阴离子去污剂，在高温（55℃—65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。 酚:使蛋白质变性。

氯仿:作为除杂剂，除去糖、脂等杂质；加速有机相与液相分离；抽提核酸溶液中残留的酚。 乙丙醇:作为消泡剂；降低DNA的水溶性，让DNA从溶液中析出；有利于分层，使离心后的上层含DNA水相，中间的蛋白质相及下层有机溶液相维持稳定。 无水乙醇:降低DNA的水溶性，沉淀DNA。

醋酸纳:调PH，中和Tris-Buffer，形成中性环境，利于DNA沉淀。 Tris-Buffer（PH8.0）:提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。 70％乙醇:清洗溶液中离子及其他杂质。

NaCl:提供高盐环境，使DNA溶解于液相中。 2.有机溶剂使用注意事项？

答：①有机溶剂的容器，不论是否在使用中，都应随手盖紧。 ②尽可能在通风位置工作，以避免吸入有机溶剂的蒸汽。 ③尽可能避免皮肤直接接触。 3.PCR原理？

答：将目的基因DNA在高温（94℃）下解链成为单链模板;人工合成的一对与目的基因两侧序列相互补的寡核苷酸引物在低温（40~60℃）下分别与变性的目的基因片段两侧的两条链的部分序列互补结合；在中等温度（65~75℃）下，由耐热的DNA聚合酶(Taq酶）将dNTP

，，，

中的脱氧单核甘酸加到引物3-OH末端，并以此为起点，沿着模板以5→3方向延伸，合成一条新的互补链。

4.PCR类型？反转录PCR怎么做的?

答：反向PCR、巢式PCR、锚定PCR、数字PCR、RT-PCR、实时荧光定量PCR、免疫捕捉PCR等。

RT-PCR的原理：提取组织或细胞中的总RNA，以ployA（A）+选择性RNA为模板采用oligo(dT)、随机引物或基因特异性的引物GSP经反转录酶的作用从RNA合成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。 5.PCR影响因素？

答：引物；模板；DNA聚合酶；Mg2+；底物；反应缓冲液。 6.PCR体系有什么物质？作用？

答：①引物：是两段与待扩增目的DNA序列侧翼片段具有互补碱基特异性的寡核苷酸，使

，

DNA聚合酶以其3-OH末端为起点合成互补链，决定了特定基因的扩增。

②模板：提供DNA复制的模板，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子。

，

③TaqDNA聚合酶：将dNTP中的脱氧单核甘酸加到引物3-OH末端，并以此为起点，沿

，，

着模板以5-3方向延伸，合成一条新的互补链。

④底物dNTPmix：4种脱氧核苷酸，提供PCR反应的原料和能量。

⑤反应缓冲液：反应缓冲液一般含有Tris-HCl、KCl和适当的Mg2+。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，Tris-HCl起缓冲作用，KCl有利于引物的退火。 7.怎样提高PCR产物的特异性？

引物:a.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 b.选择GC含量为40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。 c.设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 d.避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。e.避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。f.避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 g.避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。

Mg2+:浓度通常为0.5—2.0mmol/l，过高或过低均影响产物的特异性。 模板:模板量应适宜，过量则可能增加非特异性。

延伸时间:应适宜，时间过长会导致产物非特异性增加。

循环次数:一般为30个（25—30个）周期，如果循环次数过高，会增加非特异性产物及其复杂度。

8.PCR都有哪些酶可以用？

答：TaqDNA聚合酶；TthDNA聚合酶；Vent聚合酶；PfuDNA聚合酶。见实验书69页。 9.T4 DNA连接酶连接的原理？ 答：T4 DNA连接酶作用机制：酶先与ATP形成酶-AMP共价复合物，再与DNA作用、AMP

，，，

转移至DNA缺口5-磷酸基上形成焦磷酸键而活化5-磷酸基，然后再与3-羟基形成磷酸酯键，完成连接过程。

10.PCR产物与T载体怎样连接的？

答：PMD18-T质粒0.5uL，PCR产物4.5uL，2×solution（含T4DNA连接酶）5uL，混匀后16℃水浴过夜。

11.DNA用试剂盒是怎么回收纯化得到的？

答：依据吸附柱中的硅胶膜在高盐浓度下特异性吸附DNA，在低盐浓度下可被洗脱的原理。按照100mg胶块加入700uL溶胶液的比例，55℃溶胶。将融化的胶溶液转移到吸附柱中，离心后倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一收集管，加漂洗液离心洗涤，重复漂洗一次，去掉废液后放回吸附柱空转，尽量去除多余溶液。再将吸附柱放入新的收集管中加入洗脱液，静置离心后去掉吸附柱，即为纯化产物。 12.DNA回收的注意事项?

答: ①加入的胶块溶化液的量要足量，保证胶能完全溶解，避免堵塞硅胶模

②确保WB液中已经加入了酒精

③把胶液倒入柱子后要静止2min以后再离心，使DAN完全吸附于膜上 ④洗脱液要滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。 ⑤将离心后的洗脱液倒掉后，要在空离心。 13.连接为何在16℃？

答：因为黏性末端的DNA双键间有氢键的作用，温度过高使氢键不稳定，但连接的最适温度恰为37℃，所以经综合考虑，采用16℃较为合适。 14.载体与目的基因连接时各自的量有什么讲究？

答：连接时外源基因的量要多一些，载体的量要少一些，这样碰撞的机会就会多，否则载体自身环化就严重，一般载体DNA与目的基因连接采用1:(1-3）的比。连接酶的用量不宜过

多。

15.Cacl2制备感受态原理？

答：将细胞培养至OD600为0.4-0.6后放入冰浴中使其停止生长，然后将菌株置于低温预处理的低渗Cacl2 溶液中，即造成细胞膨胀，细胞通透性发生暂时性的改变，从而极易与外源DNA相黏附并在细胞表面形成复合物 16.转化？感受态?以及其的影响因素？

答：转化：是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。

感受态：指宿主细胞最易接受外源DNA片段并实现转化的一种生理状态，它是由宿主菌的遗传性所决定，同时也受菌龄；外界环境因子等的影响。

影响因素：细胞的生长状态和密度、CaCl2处理时间、热击时间、感受态细胞的保存期、质粒DNA的质量和浓度、试剂的质量、防止杂菌和杂DNA的污染、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

17.制备感受态的方法有哪些？(大肠杆菌、农杆菌、酵母） （1） 大肠杆菌感受态制备方法：CaCl2法制备

（2） 农杆菌感受态制备：CaCl法制备，类似于大肠杆菌的方法。将正在生长的农杆菌细

胞加入到低渗的CaCl溶液中，0oC下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于—70oC可保存相当一段时间而不会对其转化率有太大影响。

（3） 酵母感受态制备：

18.热击转化的原理？

答：利用CaCl2处理感受态宿主细胞，然后通过热击法处理，即置于42℃高温60—90s，细胞布朗运动剧烈，膜流动性增强，由于感受态细胞细胞膜有受伤，DNA进入细胞，然后降温在培养基上生长，表达足够的蛋白质，以使能在抗生素的平板上生长菌落。 19.蓝白斑筛选的原理？

答: 许多载体都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，包含β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控区和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），这种载体适合转入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的受体细胞。宿主和质粒单独编码的片段仅是β-半乳糖苷酶的部分序列，单独存在时没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶活性的蛋白质，即为互补。由互补而产生的lacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基-β-D硫代半乳糖苷）的作用下，在无色底物X-Gal存在时产生蓝色沉淀底物，使菌落显蓝色。如果外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，无法实现互补，使得带有重组质粒菌落形成白色菌落。

20.LB的配方

答：LB培养基：1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％Nacl。即10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调至7.2在补足水至1L。固体培养基在LB培养基中添加1.5％~2％琼脂，121℃灭菌20min备用。 21.灭菌的过程？

121℃，灭菌20min。首先往高压蒸汽灭菌锅内添适量水，然后把培养基放入锅内，锅盖对称拧紧。待压力升至0.05MPa时，打开排气阀，排完气后，关闭排气阀。待压力再次升至0.1MPa时，开始计时，直至升至0.15MPa时关闭电源开关。待压力将至0.1MPa时，打开电源开关，升至0.15MPa时关闭电源。如此循环，20分钟后，关闭电源，直到压力降至0时，打开排气阀，最后打开锅盖取出培养基。 22.涂板前在LB上37℃1h？

答：质粒只有在大肠杆菌中跟随其复制，使拷贝数增加，转录翻译出足够的酶，才具有抗性。 23.转化常见方法？

答:大肠杆菌：化学转化法、电击法。动植物细胞：显微注射法、农杆菌转化法、基因抢法。 24.质粒DNA提取原理？

答：基于环状质粒DNA相对分子质量小，易于复性的特点。在热或碱性条件下DNA分子双链解开，若此时将溶液置于复性条件下，变性的质粒分子能在较短的时间内复性而染色体DNA不能复性。经过离心除去变性的染色体DNA和蛋白质杂质沉淀，上清液中的DNA分子则利用无水乙醇与盐凝聚形成沉淀。

25.溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ有什么作用？成分是什么？

答：solutionⅠ：含葡萄糖，Tris-Hcl（PH8.0），RNA酶和EDTA。葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部；Tris-Hcl（PH8.0)提供一个适当的PH环境；EDTA螯合二价金属离子，抑制DNase的活性;RNA酶降解RNA。

solutionⅡ：含NaOH和SDS。NaOH使染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变形形成杂乱无章的片段，同时使质粒DNA的大部分氢键发生断裂；SDS用于溶解细胞膜上的脂肪和蛋白质。

solutionⅢ：含NaAc或KAc（PH4.8），用于中和solutionⅡ中的碱性溶液，使得质粒可以复性，而染色体DNA则不能复性，从而经离心后把质粒分离出来。 26.TAKARA公司都有哪些产品？有什么用途？（酶、载体类型等） 27.限制性内切酶识别、切割有什么特点？

答：识别和切割双链DNA分子内特殊的核苷酸序列。其切口有两种类型：平末端和黏性末端。

28.星号活性的影响因素?

答：甘油体积分数过高（>5%）；酶过量（>100u/uL）；离子浓度低（<25mmoL/L）；PH过高（>8.0）等。

29.T载体的结构？（从大连宝生物下载说明书阅读。)

T载体是一种高效克隆PCR产物(TA的克隆)的专用质粒载体，为线性化载体，线性化后两侧3'端各多出一个脱氧胸苷酸(T)，无需酶切可直接与游离A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。

30.酶切体系有哪些成分？ 答：10uL ddH20；2uL 10×buffer(高盐缓冲液H buffer；中盐缓冲液M buffer；低盐缓冲液L buffer)；7uL质粒DNA；作用于目的基因两端的酶切位点的限制性内切酶两个各0.5uL。 31.为什么胶块能在溶胶液中溶解？

答：实验中所使用到的凝胶回收试剂盒，作用是从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段，采用了独特的凝胶融化液Buffer GM，其具有较强的缓冲性能并含有PH指示剂，方便判断溶液的PH值，是否与DNA制备膜结合，其溶解能力很强，无需加热，在室温(15-25°C)条件下可快速溶解凝胶。 32.影响连接的因素？

答：1.连接酶的用量：酶浓度越高反应速度越快，产量也高，但连接酶是保存在50%的甘油中的，甘油浓度过高会影响连接效果。 2.作用的时间与温度:一般采用16℃，连接12-16h，因为虽然DNA连接酶的最适温度是37℃，但在37℃时，黏性末端之间的氢键结合是不稳定的，它不足以抵御热破裂作用，而反应时间是依据温度而定的，所以综合考虑后采用16℃连接12-16h。 3.底物浓度:一般采用提高DNA的浓度来增加重组的比例，但底物浓度过高。反应体积太小，连接效果也很差。

33.回收DNA中空转有什么作用？

答：去除吸附柱中多余溶液及杂质，保证DNA的纯度。 34.复制型载体有哪些系列？表达型载体分哪些？

复制型载体：质粒载体，粘粒载体，噬菌体载体，人工染色体。

表达型载体：大肠杆菌表达载体，利用T7噬菌体启动子的表达载体，表达融合蛋白的表达载体，分泌型表达载体，大肠杆菌/革兰氏阳性菌穿梭载体，大肠杆菌/酵母菌穿梭载体，随机插入突变载体，基因插入/基因敲除。

35.目的基因鉴定有哪些方法？是如何实现的？

（1）检测转基因生物染色体上的DNA上是否插入了目的基因。

采用DNA分子杂交技术，先将转基因的基因组提取出来；把目的基因的DNA片段用放射性同位素做标记作为探针；使探针与基因组DNA杂交，如果出现杂交带，则表明目的基因已插入染色体DNA中。

（2）检测目的基因是否转录出了mRNA。

采用DNA与RNA杂交技术。从转基因生物中提取mRNA,把目的基因的DNA片段用同位素标记作为探针；使探针与mRNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因转录出了mRNA。 （3）检测目的基因是否翻译出了蛋白质。

从转基因生物中提取蛋白质，用相应抗体（先进行同位素标记）进行抗原—抗体杂交；如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。 （4）个体生物学水平的鉴定

将转基因的产品与天然产品作比较，以确定是否转入目的基因。 36.Amp、Kan筛选的原理？ 答：质粒具有氨苄青霉素抗性或卡那霉素抗性，转化了这些质粒或重组质粒的大肠杆菌寄主可以在含有氨苄青霉素或卡那霉素的培养基上生长，而非转化子则不能生长。从而筛选出含有重组载体的细胞。

37.琼脂、琼脂糖的区别？

答：琼脂是由琼脂糖和琼脂果胶组成的，琼脂是一种固化剂，本身不提供任何营养，是一种高分子的碳水化合物，仅溶于热水，主要用于细胞培养。

琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，由半乳糖及其衍生物构成，不带电荷，主要用于凝胶电泳，凝胶过滤。

38.内切酶不同末端连接形成几种键？分别有几个 答：内切酶酶切产生的粘性末端进行连接形成两个3'-5'磷酸二酯键和若干互补碱基对之间的氢键，若酶切产生的平末端进行连接，形成两个3'-5'磷酸二酯键。 39.怎样研究一个基因的功能？

(1)在基因库中查找该基因的同源基因或同源物种的该类基因，根据他们的功能对欲研究基因的功能作大体的推测。

(2)寻找该基因缺失型的个体，或对生物个体进行该基因的基因敲除，将其与正常含有该基因的个体进行比对，根据对该基因的功能的推测进行相应的性状，生理方面的差异的观察。

(3)利用基因工程技术对生物个体进行该基因的过表达操作，再将其与正常个体和基因缺失型个体进行比照，根据性状或生理功能的差异从而确定该基因的功能。

《基因工程》期末总结

2012级生工（七）班王俊

1.基因漂流：转基因生物的外源基因通过花粉传授等途径扩散到其他物种并转入、整合到其他生物的基因组中，使得其他生物或产品混杂有转基因成分，完成自然界基因库的混杂和污染。

2.基因工程：基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上，通过在分子水平上对基因或基因组进行改造，使物种获得新的生物性状的一种崭新技术。p1

3.质粒：是细菌中独立于染色体外，能进行自我复制的，双链，共价闭合环状DNA分子，少数为线形。p16

4.电泳：带电颗粒在电场作用下，向着与其自身所带电性相反的电极移动。

5.PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）,是一种类似于细胞内DNA的天然复制过程，利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异DNA片段。（实验教材p64）

6.半定量PCR：半定量PCR是通过RT—PCR最终产物电泳后电泳条带的明暗来间接反应出原始模板的丰度的PCR技术。

7.反转录PCR：（RT—PCR）将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链扩增相结合的技术。其原理是提取组织或细胞中的总RNA，以poly(A)+选择性RNA作为模板，采用oligo(dT)，随机引物或基因特异性的引物GSP（gene special primer）经反转录的作用从RNA合成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。

8.实时荧光定量PCR：通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析。P21

9.引物：两段与待扩增目的DNA序列侧翼片段具有互补碱基特异性的寡核苷酸。（实验教材P65）

10.RACE：cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends）。主要通过PCR技术由已知的部分cDNA序列来获取完整的cDNA的5`和3`端序列。最终，从两个有相互重叠序列的3`和5`—RACE产物中获得全长cDNA,或者通过分析RACE产物的3`和5`端序列，合成响应引物扩增出全长cDNA。P43

11.western印迹：即蛋白质印迹杂交，将电泳分离后的组织或细胞总蛋白从凝胶转移到固体支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。

12.基因文库：是指通过克隆方法保存在适当宿主中的某一生物体DNA分子的总和，这些插入分子片段和载体连接在一起，代表某种生物的全部基因组序列或全部mRNA序列。P44

13.分子杂交：不同的DNA 片段之间，DNA 片段与RNA 片段之间，RNA片段之间，如果彼此间的核苷酸排列顺序互补也可以复性，形成新的双螺旋结构。这种按照互补碱基配对而使不完全互补的两条多核苷酸相互结合的过程称为分子杂交。 14.星号活性：在某些条件下，一种特异性识别顺序的限制性性内切酶在酶切同一种DNA片段时会产生新的酶切位点而得到不同的酶切片段的酶活性叫做星号活性。 15.蓝白辬筛选：许多载体都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，包含β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控区和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），这种载体适合转入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的受体细胞。宿主和质粒单独编码的片段仅是β-半乳糖苷酶的部分序列，单独存在时没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶活性的蛋白质，即为互补。由互补而产生的lacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基-β-D硫代半乳糖苷）的作用下，在白色底物X-Gal存在时产生蓝色沉淀底物，使菌落显蓝色。如果外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，无法实现互补，使得带有重组质粒菌落形成白色菌落。 16.目的基因：在基因工程实践中，研究者所感兴趣和想研究的基因就是目的基因。 17.Taq聚合酶：从温泉中的水生栖热菌中分离出TaqDNA聚合酶。该酶具有5`→3`聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性，不存在3`→5`外切酶活性，是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。P55

18. 转化：重组质粒DNA分子导入受体细胞的过程称为转化。P69

19.启动子：启动子是一段位于结构基因5`端上游区，基因转录起始所必须的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。 20.限制酶：（限制性内切酶）是能够识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。（限制：限制外源DNA进入；内切：切DNA内 碱基）

21.限制性内切酶：一类能够针对特定核苷酸序列进行特定位点的切割，产生特定的粘性末端或平末端的酶。P51

22.载体：把携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体。在基因工程中，最常用到的是质粒载体。P57

23.感受态细胞：是指最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态的细胞。（实验教材P153）

24.转基因技术：转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。

25.转基因食品：又称基因改良食品或基因工程食品，是利用基因工程技术将一些微生物、动物或植物的基因植入另一种微生物、动物或植物中，接受的一方面由此获得了一种它所不能自然拥有的品质。P138

26.粘性末端：经酶切后，切口处留下没有配对的单链尾巴即为粘性末端。粘性末端可以分为5`磷酸突出的末端，3`羟基突出的末端。(实验教材P136)

27.DNA连杆：连杆又叫衔接物，是指用化学法合成的由10～12个核苷酸组成，具有一个或数个限制性酶识别位点的寡核苷酸片段。P68 28.基因药物：基因工程药物是指用现代基因重组技术对基因进行克隆，通过重组DNA导入大肠杆菌、酵母或动物细胞成功构建工程菌株或细胞株，在工程菌株、细胞中所表达产生的新型药物包括细胞因子、激素、溶血栓药物、疫苗、抗体、反义RNA及基因治疗药物等多种难治疾病的基因工程药物。P148 29.基因诊断：基因诊断即DNA诊断或分子遗传学诊断，是指利用标本中的DNA或RNA作为检测

对象进行疾病诊断的方法。P161

30.基因治疗：基因治疗是指通过基因水平的改变来治疗疾病的方法。P168

31.T-DNA：它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，与肿瘤形成有关，包括左边界和右边界。

32.农杆菌：从土壤中分离出来的革兰氏阴性菌，主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌，其中研究最多也最彻底的是根癌农杆菌，他能将自身Ti质粒的一段DNA（T-DNA）转移到植物细胞中，从而使至于受伤部位形成冠瘿瘤。

1.基因工程在各领域中的应用(举例说明) (教材P6～P11)

(1)在农业生产中的应用：在大田作物、园艺作物中应用，如培育作物新品种、品质改良、作物增产、防除杂草、防治病虫害等。

(2)在林木花卉中的应用：在花卉产业中为定向育种提供了技术保障。 (3)在畜牧业、养殖业中的应用：转基因牛，猪，鱼等动物获得优良性状。

(4)工业领域中的应用：影响最为深远的为食品工业，基因工程技术涉及在食品领域中的作用目前涉及对食品资源的改造、新产品的开发、食品添加剂的生产以及食品卫生检测等方面。 (5)在医药卫生领域中的应用：通过基因工程技术生产制造基因工程药物，现已成功开发了人血球蛋白、干扰素、乙肝疫苗等令人鼓舞的新药。

(6)在环境保护领域中的应用：采用基因工程的方法可对不同菌株中的特异性降解基因进行修饰、累加、转移，提高微生物净化环境的能力，吞噬和分解多种污染环境的物质。

2.基因工程中研究一个基因能有哪些技术运用到其中？ (1)DNA的提取技术

a.基因组DNA提取：CTAB法，SDS法等 b.质粒DNA提取：碱裂解法、煮沸法

c.线粒体、叶绿体DNA的提取：差速离心结合SDS裂解法

(2)DNA的凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (3)基因扩增技术：PCR（聚合酶链式反应）

LP-PCR、锚定PCR、RT-PCR、荧光实时定量PCR技术等 (4)DNA印迹杂交技术：Southern杂交

(5)DNA核苷酸序列的测定技术：Sanger法测序—双脱氧链末端终止法等 3.给予一个基因，如何构建一个载体：

(1)根据该基因序列设计特异引物，通过PCR进行该基因的大量扩增。

(2)选择合适的内切酶对质粒进行酶切，用同样的酶对目的基因进行酶切，使之产生与质粒相同的粘性末端。

(3)在体外环境下应用DNA连接酶构建重组质粒。 4.农杆菌介导的转基因植物是如何实现的？

植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮，农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌vir区各种基因的激活和表达。首先是virA和virG基因的活化，磷酸化的virG蛋白激活一系列vir基因的表达，导致T-DNA被剪切、加工，形成T-链蛋白复合体，通过农杆菌和植物细胞膜，细胞壁进入细胞内，T-复合物上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基因组。

5.转基因动物是如何实现的？ P107、108 转基因动物技术是指利用DNA重组技术、基因突变技术、基因导入技术和基因表达技术等基因工程方法，将人工提取的DNA在体外切割、拼接和重组，然后通过适当载体导入动物细胞内，使这种外源基因与动物本身的染色体整合在一起，随着细胞的分裂而复制和表达，从而定向地产生人类所需的生物产品或得到能够稳定遗传的具有优良新性状的动物。 转基因动物操作流程

载体的选择 目的基因的分离 供体的培养

重组载体的构建 受体细胞的制备

外源基因导入受体细胞

转基因胚胎的获得，培养与检验 受体动物的选择

转基因胚胎的移植

转基因动转基因动获得子代

物的传代 物的鉴定

目的基因的获取→转基因的动物受体细胞系统→目的基因的导入→重组胚的检测→转基因重组胚胎的移植→转基因动物的鉴定 6.谈谈你对转基因技术的未来和前景。 未来，转基因技术将更加普遍更加寻常的出现在人们的视野和生活中，人们不在“谈转色变”。转基因技术也可以为人类做出很多贡献。比如在环境保护方面，利用转基因技术改造出了专喝污水的植物，专吃有毒废弃物的细菌，专门降解农药的微生物等。在食品方面，人们不在担心粮食不够吃，可以通过转基因技术生产营养价值高，产量高，抗病虫害，抗自然灾害的农作物。在疾病方面，可以通过转基因的手段生产许多疑难杂症的药物。在能源方面，人们不再过多的依赖石油、煤炭、天然气等传统能源，而可以通过转基因技术改造工程菌，利用秸秆等木质纤维发酵生产酒精。总之，转基因技术有很好的未来和前景，我们更多的不是一味的去抵触它，而是应该更加了解它，把它作为一项为人类服务的技术，通过它来为人来做更多的贡献。

7.转基因食品与转基因技术的区别和联系。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/e7pa.html