植物总RNA的提取及RT-PCR

生物学实验技术

植物总RNA的提取及RT-PCR

一、实验目的

1. 学习从植物组织中提取总RNA的方法

2. 了解RT-PCR的基本原理和实验方法

二、实验原理

1. RNA提取的原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

2. RT-PCR的原理

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。

三、仪器、药品与试剂配方

(一) 仪器及器皿

1． 低温离心机； 2．琼脂糖凝胶电泳系统； 3． 高压灭菌锅；

4. PCR仪； 5． 研钵； 6. 一次性手套等；

7. 离心管； 8. 培养皿； 9. 烧杯及试剂瓶等。

(二) 药品

1. 焦碳酸二乙酯(DEPC) 2. 异硫氰酸胍 (GT) 3. 醋酸钠(NaAc)

4. 苯酚 5. 异丙醇 6. 氯仿

7. 乙醇 8. β－巯基乙醇 9. 琼脂糖

10. MLV反转录试剂盒 11. Taq DNA聚合酶 12. 引物

(三) 试剂配制

1． 0.1% DEPC水 灭菌

2. 4 mol/L异硫氰酸胍

3. 2 mol/L NaAc （pH 4.8） 灭菌

4. 3 mol/L NaAc （pH 4.8） 灭菌

5. 4 mol/L LiCl 灭菌

6. 1×TE缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH8.0），1 mM EDTA（pH8.0）, 灭菌。

四、实验步骤

（一） 总RNA的提取

（1） 研钵冷却后，倒入2/3液氮，加入0.2 g植物材料，充分研磨后转入一个含有300

l的4M GT的1.5 ml的聚丙烯管中，摇匀。

（2） 加入30 l 2 M NaAc（pH4.9-5.2）摇匀，加入300 l酸酚（水饱和酚pH<5.0），

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摇匀，加入100 l三氯甲烷，摇匀。

（3） 12000 rpm 4℃离心20 min，吸取上清，加入等体积异丙醇，于冰上放置15 min。

（4） 12000 rpm 4℃离心10 min，将沉淀悬浮于含100 l 4M氯化锂的1.5 ml EP管

中，于-20℃放置1小时或更长时间。

（5） 12000 rpm 4℃离心10-15 min，将沉淀溶于0.4 ml DEPC水中，加入1/2体积

氯仿和1/2体积酸酚，摇匀，进行抽提，12000 rpm 4℃离心5 min；上清加入等体积氯仿，摇匀，进行抽提，12000 rpm 4℃离心5 min。

（6） 上清液加入1/10体积的3 M乙酸钠和两倍体积的无水乙醇于-20℃放置1小时或

更长时间。

（7） 12000 rpm 4℃离心15 min，超净台吹干，沉淀溶于10 l b灭菌的DEPC水中。

（8） RNA贮于-80℃。

（二）RNA反转录产生cDNA

在DEPC处理过的离心管中冰上按下表加入：

模板RNA

Olig(dT)18

DEPC 水 2 µl 1 µl 2 µl

混匀，70℃水浴中放置2 min，立即放置到冰上2 min。然后在冰上依次加入：

RNasin

M－MLV

5×buffer

10 mM dNTP 0.5 µl 1 µl 2 µl 1.5 µl

42℃，水浴中反应90 min。72℃，10 min，终止反应。

加入15 µl的DEPC灭菌水，使总体积达到25 µl。

(三) PCR

1. 在灭菌的PCR管中加入以下成分，形成PCR反应体系

10 X buffer 2.5 µl

dNTP (2.5 mmol) 2 µl

RT-PCR产物 5 µl

Taq酶 0.5 µl

上游引物（10 µmol/l） 0.5 µl

下游引物（10 µmol/l） 0.5 µl

灭菌ddH2O加到25 µl

2. 按照下列条件进行PCR反应

94℃ 5 min

94℃ 30 s

55℃ 30 s

72℃ 1 min

30个循环

72℃ 7 min

4℃

（四）电泳检测

将加EB的1 %变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1×TE电泳缓冲液，覆盖凝胶约1 mm。将RNA及DNA样品加到凝胶点样孔中， 85 V条件下电泳30 min，在紫

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外灯下观察结果。

五、注意事项

1．在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。

2．RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套。

3. 使用DEPC时，应在通风橱中戴手套操作。

4．RNA提取用品准备：

1）普通的玻璃器皿：180℃烘干8小时（玻璃），研钵，小勺，试剂瓶若干个。

2）一次性使用的塑料制品：枪头、EP管等先用DEPC水处理然后高压灭菌，烘干。

3）电泳槽：去污剂洗干净，水冲洗，3%H2O，0.1%DEPC水彻底冲洗。

4）用烘烤过的药勺称取试剂。

5）用DEPC水配制试剂：0.1%DEPC水：37℃至少处理12小时，高压灭菌15min。

6）含有Tris一类的缓冲液，不可用DEPC处理。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/e7mj.html