测定各生理指标的试验方法

测定各生理指标的试验方法

1.4.1 电导率的测量(浸泡法)[5]

取大小相当的植物叶片（尽量保证叶片的完整性，少含茎节），用自来水洗净后再用蒸馏水冲洗3次，用滤纸吸干表面水分，将叶片剪成适宜长度的长条（避开主脉），快速称取鲜样，每份0.1g,分别置于10ml去离子水的刻度试管中，盖上玻璃塞置于室温下浸泡处理12h,用电导仪测定浸提液电导（R1），然后沸水浴加热30min,冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导（R2）。根据公式：相对电导率=R1/R2×100% 算出电导率。

1.4.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定（氮蓝四唑法）[5]

取各株植物相同部位的叶片（去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使最终体积为5ml。取1.5~2ml于4000r/min

下离心10min，上清液即为SOD粗提取液。取32支试管（30支测定管，2支对照管），分别加入1.5ml0.05mol/l磷酸缓冲液、0.3ml130nmolMet溶液、0.3ml750μmol/l NBT溶液、0.3mol100μmol/l EDTA液、0.3ml20μmol/l核黄素、0.05ml酶液（其中2支对照管以缓冲液代替酶液）、0.25ml蒸馏水，混匀，将一支对照管置于暗处，其他各管于4000lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时缩短，低时延长）。反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其他各管的吸光度。

计算公式：SOD总活性（U/g)=[(ACK-AE)×V]/(0.5×ACK×W×Vt)

注：SOD总活性以每克样品鲜质量的酶单位表示（U/g）；ACK为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜质量（g）。

1.4.3 过氧化物酶(POD)活性的测定（愈创木酚法) [5]

酶液提取：取5.0g植物叶片，洗净，剪碎，放入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000rmp离心10min，上清液转入25ml容量瓶中。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取2次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。分别在各试管中加入0.05mol/l磷酸缓冲液2.9ml,2%H2O21.0ml，0.05mol/l愈创木酚1.0ml和0.1ml酶液来制备酶活性测定

的反应体系。用加热煮沸5min的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于37℃水浴中保温15min，然后迅速转入冰浴中，并加入20%三氯乙酸2.0ml终止反应，然后过滤（或5000r/min离心10min），适当稀释，470nm波长下测定吸光度。依据公式：过氧化物酶活性[（U/(g·min)]=(△A470×VT)/(W×VS×0.01×t)

注：△A470为反应时间内吸光度的变化；W为植物叶片的鲜质量（g）；t为反应时间（min）；

VT为提取酶液总体积（ml）；VS为测定时取用酶液体积（ml）。 1.4.4 叶绿素含量的测定[5]

取新鲜的植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀，称取0.2g,共30份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及95%乙醇2~3ml，研磨成匀浆，再加95%乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3~5min。取一张滤纸，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量95%乙醇冲洗研钵、玻棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣中无绿色为止，最后用乙醇定容至25ml，摇匀。把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度。 计算公式：Ca=13.95A665-6.88A649 Cb=24.96A649-7.32A665

Cx.c=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245

叶绿体色素的含量（mg/g）=（C×V×N)/(W×1000)

注：C为色素含量（mg/l);V为提取液体积（ml）；N为稀释倍数；W为样品鲜质量（g）；1000即1l=1000ml。

1.4.5 可溶性糖含量的测定（蒽酮比色法）[5]

取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.2g。分别放入刻度试管中，加入10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶中，用蒸馏水反复漂洗试管及残渣并定容至刻度。吸取样本提取液0.5ml于20ml刻度试管中，加蒸馏水1.5ml，然后按顺序向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm

波长下测定样品吸光度，依据公式：可溶性糖含量（%）=[(C×VT×N)/(W×VS×106)]×100,计算可溶性糖的含量。

注：C是从标准曲线查得的糖量（μg)；VT为提取液总体积（ml）；VS为测定时取用的样品提取液体积（ml）；W为样品质量（g)。 1.4.6 脯氨酸含量的测定[5]

称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入3%的磺基水杨酸溶液5ml，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2ml提取液于干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30s，静置片刻，去上层液至10ml离心管中，在3000r/min下离心5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。依据公式：单位鲜质量样品的脯氨酸含量（%）=（X×VT）/(W×VS×106) ×100，计算脯氨酸的含量。 1.4.7 丙二醛含量的测定[5]

取0.5g植物叶片，加5%TCA5ml，研磨后所得匀浆在3000r/min下离心10min。取上清液2ml，加入TBA2ml，混合后在100℃水浴上煮沸30min，冷却后再离心一次。分别测定上清液在450nm，532nm和600nm处的吸光度值。依据公式：C(μmol/l)=6.45(A532-A600)-0.56A450,计算出MDA浓度。

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