细胞培养专题讨论

【专题讨论】各种细胞传代的方法＆操作

我们实验室饲养层细胞STO的传代

1.当细胞铺满整个平皿(100mm)后,吸弃旧培养液，10mLPBS洗一遍

2.0.25%胰酶（预热20分钟左右）2ml消化，轻轻摇晃，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落（或在显微镜下观察细胞之间分离），立刻加5ml(DMEM+10?S)终止消化，轻柔吹打8-10次成单细胞。

3.离心1000rpm*5min,弃上清，加DMEM+10?S轻柔吹打。 4.将细胞悬液1:4传到100mm细胞培养皿中，每个皿加10ml(DMEM+10?S)培养液，正常情况下2-3天就可以长满，期间不用换液。 小鼠ES-R1细胞系传代。

因为我们用饲养层细胞铺皿而不是明胶包被，所以传代之前必须处理饲养层细胞。 1.饲养层细胞STO处理：当STO铺满平皿后，向培养液中加入100ul 1mg/mlmitomycinC(toxic, 操作时不要接触，作用是抑制STO增殖)，轻轻摇晃平皿，保证丝裂霉素分布均匀，放置于培养箱中处理2h后，吸弃培养液，10mlPBS洗两遍（目的是把mitomycinC洗净），0.25%胰酶消化，5ml(DMEM+10?S)终止，离心1000rpm*5min弃上清，加DMEM+10?S后吹打均匀，种到新的100mm细胞培养皿，补齐培养液至10ml。置于培养箱中过夜。 2.第二天早上传干细胞：

（1）吸弃旧培养液，10mlPBS洗一遍，2ml 0.25%胰酶消化，边消化边轻轻晃动培养皿，4-5min后镜下观察发现发部分细胞脱落，成小的细胞团块，加8ml DMEM+10?S终止消化，轻柔吹打。 （2）然后将液体转移到15ml塑料离心管中，静置10-15min，吸弃上清，加2mlES培养液。 （3）将滴管在酒精灯下拉成非常细的玻璃管，吹打1－2次，尽量将ES吹散

（4）将前一天铺好的STO的培养液吸弃，换成10ml的ES培养液（操作要小心，不然STO很容易脱落），再把塑料离心管中的ES1:3或1:4(视情况而定)传到铺好的STO皿中，前后左右垂直晃动几下，使干细胞分布均匀，置于培养箱中，每天换液，两到三天传代。 应该注意的问题：

1.STO不管是在ES传代还是换液过程中都可能因为加液体速度过快而脱落，所以最好靠近培养皿壁先一滴一滴加，避免液体直接打在STO上。 2.玻璃管拉得尽量细一些。 3.一定要把mitomycin洗干净

我养过很多细胞，肿瘤细胞和正常细胞都有，总的感觉是肿瘤细胞要比正常细胞好养。先介绍一下目前手头正在养的两株细胞。

SNU-398:人肝癌细胞，培养液是1640+10mmol/LHEPES+1mmol/L丙酮酸钠+1.5g/L碳酸氢钠+10％FBS

PLC/PRF/5：人肝癌细胞，培养液是EMEM+0.1mmol/L非必需氨基酸+1mmol/L丙酮酸钠+1.5g/L碳酸氢钠+10％FBS

消化液是0.25％胰酶+0.03％EDTA

两株细胞都是贴壁细胞，SNU－398消化时需先加入1ml（25cm2）消化液，使消化液均匀覆盖瓶底后倒掉，然后再加入1ml消化液，室温放置3分钟左右，加入培养液8ml中止消化，吹打使细胞分散（动作要轻，避免气泡），再分别将细胞液各3ml加入另外两个新瓶子，添加培养液至8ml/瓶，继续培养

PLC/PRF/5消化时只需加入1ml（25cm2）消化液，使消化液均匀覆盖瓶底后静置5分钟左右，轻拍培养瓶几下，然后加入培养液，一般也是一传三，操作同SNU-398。

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的消化及传代，RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢。 我得操作如下：

实验前将DPBS及DMEM加温到37度 使用Flask75培养瓶：

1、细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS10ml漂洗 一至两次；弃去 2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM培养液10ml复吹打混悬细胞 3.分入新的培养瓶；

4. 入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁 。 细胞生长很好。

我来谈谈HepG2细胞株的传代经验：

首先在倒置显微镜下观察生长融合达80%，不需要长满，就准备传代。倒掉旧的培养基，再用已经高压灭菌过的PBS洗1－2次，我用的是25平方厘米的培养瓶，加入1毫升已经配制好的0.25%胰蛋白酶－0.02íTA(0.25%胰蛋白酶是用D-Hanks配制后先用滤纸过滤，再用一次性过滤器过滤除菌，再分装成1ml的小包装，刚好每次用完一个，避免每次反复冻存，会使胰酶的活性下降），加入的量以刚好盖满瓶底为宜。放到倒置显微镜下观察变化，一旦发现细胞开始变园收缩，大约1－3分钟时间，必要时可以吹打帮助细胞分散，就立即加入培养基中和胰酶，如有EDTA最好要离心（800rpm,5min)，弃上清夜，再加入完全培养基吹匀，再分瓶，一般一瓶可以分2－3瓶。放入5%的CO2培养箱，37度培养24小时后观察。

细胞：vero(非洲绿猴细胞)

PK-15[猪肾细胞（表示要到第15代细胞才会稳定)] 类型：贴壁细胞

来源：购自武汉病毒所细胞保存中心

由四川农业大学动物生物技术中心繁殖保存 传代步骤：

弃去旧的生长液-->用无钙镁水(CMF)冲洗贴壁细胞数次(视细胞瓶的大小,3--5次)-->剩少许CMF,滴入 ATV 2--3滴-->摇匀细胞瓶中的液体,使ATV均匀的分布到瓶里的没个地方-->放入37度二氧化碳温箱中3--5min消化-->弃去ATV,加入生长液,拍打吸吹下细胞-->镜下观察-->分瓶-->作好记号,放入37度二氧化碳温箱生长

细胞特点:vero细胞生命力强,在很多其他细胞被污染的不能在继续做的时候,它还能顽强的活下去,但是它有个特点就是对ATV很敏感,一般陪的较好的ATV一下去它能在较短的时间内消化下来,这是在消化时要注意的问题;PK-15相对就没有那么好传了,它和 VERO刚好相反,它的消化要很长的时间.我在作实验时选择的最多的是MDBK,因为它张的最快;其次选择VERO因其生命力强;最后在选PK-15和IBRS、BHK21等这些细胞！！！

我养贴壁生长的细胞肿瘤细胞(A549,SKBR3,MCF7):

根据细胞生长状况3天左右传代一次。弃去培养液，并用不完全培养液洗一遍，再加入1~2ml 0.25% 胰酶和0.03% EDTA溶液，放到倒置显微镜下观察变化，一旦发现细胞开始变圆收缩，（A549大概要2分钟，MCF7大概十几秒，SKBR3要5分钟左右）就立即加入完全培养基终止消化，用滴管吹打培养瓶壁，至细胞全部从培养瓶脱落，离心（1200rpm,2min)，洗涤一次，弃上清液，再加入完全培养基吹匀，分至新的培养瓶中，加入完全培养液继续培养。

注意：加了EDTA的消化液一定要离心洗涤，否则会影响细胞生长状态

我养贴壁生长的细胞肺癌细胞(A549,PG)

传代步骤？：

弃去培养液，并用PBS洗一遍，再加入1~2ml 0.25% 胰酶和0.03% EDTA溶液，均匀分布于瓶底，在倒置显微镜下观察变化，一旦发现细胞开始变圆收缩，（A549大概要2分钟，PG要3分钟左右）,倒掉消化液，立即加入完全培养基终止消化，吹打培养瓶壁，至细胞全部从培养瓶脱落，洗涤一次，弃上清液，再加入完全培养基吹匀，分至新的培养瓶中继续培养。两种细胞均容易成团生长，在传代时要反复吹打。

我培养过VEC，KB-A-1/3等，现在养3T3-L1，讲一些“消化”经验值吧，总觉得养细胞除非特殊，否则都差不多的手法的，当然这里我不提不同培养基了。

我的通常做法：细胞弃去上清培养基，PBS洗3次，0.125%胰蛋白酶加1ml，平晃培养瓶润湿后立即倒去胰酶，接着就根据细胞不同性质等待消化的时间不同了，难消化的细胞（如KB）可以37度培养箱温育片刻，一般2-3min都可以了，然后用含血清的培养基终止消化稀释传代就行了。

关键是润湿后马上弃去胰酶，这样可以保证消化质量，也可以很大程度上避免消化脱落的细胞过后倒去胰酶是损失了。

神经细胞原代培养

(Primary dissociated cell culture)

从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备 1. 器械和器皿

器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等 各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60°C烘干，以防生锈。由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。

器皿：1) 玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖

用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。 2) 培养瓶、盖玻片

培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。 3) 移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

4) 塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。 辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2. 培养基和培养用液的配制

1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。本室目前常用分子量为7-140，000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。

2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。分装成小瓶，4°C保存备用（分装前需56°C灭活30分钟）。

5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4°C过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1~2ml冻存。用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。实际使用温度一般为37°C 20~30分钟。

6) 解剖溶液：由平衡盐水（D1-无钙镁离子的Puck氏液）、HEPES缓冲液和蔗糖－葡萄糖溶液组成称为D1-SGH。

D1平衡盐水：NaCl 8.0g、KCl 0.4g、Na2HPO4.7H2O 0.045g、KH2PO4 0.03g、酚红0.0012g、三蒸水50ml。

蔗糖－葡萄糖（SG）：蔗糖7.5g、葡萄糖3g、三蒸水50ml。

HEPES（H，0.352mM）：用25ml左右的三蒸水溶解2.35g的HEPES后，用NaOH或HCl调pH至7.3~7.4，加三蒸水至28ml。 将D1、SG和H三者合在 一起并稀释到1000ml即为解剖液，小瓶分装成5ml置4°C 备用。

二、培养细胞操作 1. 涂培养基

一般在细胞培养前1~2天，将使用的塑料培养皿（35mm）、24孔、96孔培养板或消毒的盖玻片涂上一层Poly-L-Llisine，置于超净台中备用。 2. 实验动物准备

动物的年龄和取材部位对培养细胞的成活率关系密切，需根据具体实验而定。如大鼠海马细胞培养，以18天胚胎或新生48小时内的大鼠为宜，而培养背根神经节与脊髓神经元以11~13天胚胎小鼠、大脑皮层以小鼠16~21天、小脑细胞取自临产或新生动物。 3. 进入培养室操作

1) 穿上消毒衣，戴上口罩和帽子。

2) 安放消毒的实验用具，如培养皿、解剖器械、玻璃吸管、培养板等于桌面适当的位置。 3) 将平衡盐水、解剖溶液、血清、胰蛋白酶等溶液放置于桌面上，同时准备一个冰袋和污

物盘。

4) 解剖动物以新生大鼠取海马组织为例：将新生大鼠投入80％的酒精中，消毒5~10分钟。用解剖剪断头，并移入玻璃器皿中，沿中间骨缝将头骨剪开（头骨外侧下沿也剪开），然后剥开头骨暴露大脑半球，去脑膜，沿中线将大脑半球往外翻开，暴露内侧面半月状的海马组织。用弯头镊子轻轻夹起，放入解剖液内（培养皿可置于冰袋上）。待数个动物均解剖后，将培养皿内的海马组织移至解剖镜下，仔细去除血管、膜及非海马结构（取材干净非常重要）后，再移至小培养皿中，加数滴D1-SGH液，并用虹膜剪剪碎或用虹膜刀切成小粒。 5) 在上述海马组织加入解剖溶液和0.25%胰蛋白酶各1ml，摇匀后置于37°C培养箱内消化25~30分钟。

6) 将消化好的细胞碎片移入2ml的离心管中，吸去剩余的胰蛋白酶溶液，加入含血清的全培养液2ml终止胰酶作用，约10分钟后，再更换一次全培养液以洗净胰酶。（全培养液成份为80％DMEM、10％胎牛血清、10％马血清或小牛血清，胎牛血清有助于细胞贴壁）。 7) 用口径较小的、在火焰上光滑过的玻璃吸管吸取细胞团，移入另一离心管，加入2ml培养液并吹打20次。将离心管斜放，让细胞碎片下沉5~10分钟后，吸取上层细胞溶液约1ml。离心管中再加入培养液1ml，同上吹打并吸取细胞，与第1次吸取的细胞混合一起后计数。

8) 按所需的细胞浓度接种在事先准备的塑料培养皿、细胞培养板中，用盖玻片则需滴满。接种后移入37°C的5％CO2培养箱，培养1天后可用无血清培养液，1星期换液2次。

三、细胞识别

根据细胞外形及内部结构进行细胞的识别。神经细胞具有显著的特征，培养中的贴壁的神经元突起很明显，特别是树突由粗而细，有分支，突起的末端有膨大的生长锥结构，正在不断变化；细胞体呈圆形、梭形、三角形或多角形不等，胞体较厚，具有空泡状核，有明显的核仁；立体感强，常见“晕”。

培养细胞中可包括几种神经元的类型和非神经元的“背景细胞”，即成纤维细胞、室管膜细胞和几种胶质细胞。

成纤维细胞贴壁最快，呈扁平状，胞核卵园形，有并列的两粒小核仁，从胞体两端发出细长突起。胶质细胞贴附在胶原上和成纤维细胞形成一层“地毯”。神经细胞贴壁较慢，落在“地毯”上生长迁移和分化。

培养的神经细胞可按一般Nissl法染色或免疫细胞化学特异性染色加以鉴别。

细胞冻存与复苏

细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

细胞的冻存 【用品】

（1） 5%胰蛋白酶

（2） 含10%~20%血清培养液

（3） DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒） （4） 吸管、离心管、冻存管 【步骤】

（1） 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生

长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。

（2） 用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。

（3） 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。

（4） 装完细胞后的冻存管即可直接冻存。以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。以后取出冻存管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。 细胞在液氮中储存时间理论上是无限的，但为妥善起见，特别是很多为被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。

细胞的复苏

【用品】培养液，吸管，离心管，培养瓶，37℃温水 【步骤】

（1） 从保存冻存管的支架中取出冻存管应直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。如果冻存管密封不严，在保存过程中液氮进入冻存管中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，可能会危及面部等。因此，存取冻存管时都要佩戴眼镜和手套。 （2） 从37℃水浴中取出冻存管，用酒精消毒后，拧开冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，在重复用培养液洗一次。 （3） 用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养。如果复苏时细胞密度较高要及时传代。

细胞复苏时细胞数可以做10~20倍稀释，接种密度以5×105/ml为宜。

细胞株的传代与培养

培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长细胞如COS-7、CHO等用消化法传代；部分贴壁生长的细胞如PC12用直接吹打即可传代。下面主要介绍贴壁细胞的传代。 一、用品

(1) 0.25％胰蛋白酶，全培养液

(2) 滴管，离心管，培养瓶(皿)，培养瓶盖，注射器，计数6 皮乳头 二、步骤

(1) 贴壁细胞的消化法传代： ① 吸除瓶内旧培养液。

② 以50ml培养瓶为例，向瓶内加入2-3ml胰蛋白酶，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。

③ 消化最好在37C或室温25C以上环境下进行。消化后把培养瓶放置显微镜下进行观察．发现胞质回缩、细胞间隙增大后。应立即终止消比，然后吸掉消化液后再加全培养液终止消化。 ④ 用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养瓶底的一端开始到另一端结束，以保证所有的底部都被吹到。吹打动作要轻柔同时尽可能不要出现泡沫。这些都对细胞有损伤。细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。 ⑤ 计数，分别接种在新的培养瓶内。

部分贴壁生长细胞，不经消化处理直接吹打也可使细胞从瓶壁脱落下来，而进行传代。但这种方法仅限于部分贴壁不牢的细胞，如Hela、PC12细胞等。直接吹打对细胞损伤较大，细胞常也有较大数目的丢失，因而绝大部分贴壁生长的细胞均需消化后，才能吹打传代。

我养卵巢癌细胞SKOV3,贴壁生长，传代步骤： 1.倒掉旧培养液，尽量倒净。

2.如果是50ml的培养瓶，加入约1ml0.25％胰酶中和残留培养液，倒出。也可用D-HANKS液洗一次，可以节约胰酶。

3.再加1ml0.25％胰酶消化，本人体会，新开瓶（指分装的小瓶）使用的胰酶消化能力强，可以减少用量至0.5－0.8ml,已用较久的胰酶如用少了就不管用。

4.镜下观察，如果80％以上细胞都回缩变圆，立刻将培养瓶竖起，防止过度消化。

5.倒掉胰酶，用含10％小牛血清1640培养液5ml加入瓶内，按顺序轻吹打，如瓶底由模糊变透亮，说明细胞已从瓶壁吹离。

6.此种细胞生长较快，所以一般按1传5－6传代，按瓶数补足培养液，吹匀后分别接种到新瓶中。

7.根据培养液颜色变化所提示的酸碱度变化，一般2天左右换液一次。

请不要重复发帖，谢谢配合、支持！ by victoh

liguofan wrote:

养平滑肌细胞，当细胞铺满瓶底，就可以传代了。一般6天左右传一代。先倒掉旧培养液，用pbs2ml洗两遍，再加入0.05%的胰酶+0.02edta，加入的量以能覆盖瓶底为准。加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底，然后在显微镜下观察，当细胞之间出现间隙且有大部分细胞呈现圆形后即可。倒掉，加入含低浓度血清培养液，然后吹打瓶底各处使细胞脱落。离心后去除上清液，加全培，再分2瓶，补加培养液。

特点是胰酶浓度低，不预温，消化后离心，不用pbs洗{细胞会失掉}

呵呵，看了这份帖子，我有点跟他不同的地方...也是平滑肌细胞，细胞融合后传代，原代要在5－7天融合，传第一代，之后一般4、5天传一代。弃去培养液，加1ml胰酶0.25％（用前37度预热），1min后弃去，重新加1ml胰酶，显微镜下观察，大部分细胞变圆但没有飘起来的时候加含血清的培养液终止消化，一般是3min，弃去胰酶，加2ml培养液；或不弃去胰酶，加3ml培养液，吹打细胞脱落并成单细胞悬液，将悬液直接移入新的培养瓶，原来的培养瓶再加3ml培养液，一起放入孵箱培养。

俺养时间最长的就是人外周血单个核细胞－－pbmc ，所以俺才会叫pbmc这个

网名，嘿嘿，扯远了

pbmc是混杂的细胞群体，我的目的细胞是T 细胞，实验记录如下 一，目的：pbmc的分离和培养

二，所有的试剂; 淋巴细胞分离液（TBD公司) ，小妞血清（四季青），RPMI

－1640 （GIBICO)，rIL-2(长春什么公司），二巯基乙醇（sigma），庆大霉

素（哪里产的都行),HEPES(忘记产地了），L-Glutamin（生工），丙酮酸钠（

生工），NaHCO3， HCL 三，实验步骤

1，培养液的配制： RPMI-1640干粉

二巯基乙醇 3.7 微升 丙酮酸钠 110 毫克 HEPS 1 克

L－glutamin 200 毫克 庆大霉素 5万 单位 NAHCO3 1 克

加3蒸水到1000ml,磁力搅拌器搅拌~~~~~~~~~ 调整ph植 2，淋巴细胞的常规分离（注意收集人血清备用！）

3，分离的pbmc的培养：按照1－2 x 10 6次方的浓度，放入24孔板内，每

孔加入细胞悬液1ml，加人血清200－300ul，rIL-2 50单位/孔，各种刺激剂按照

文献加入（抗CD3,抗CD4 ，PHA等等），第3天分孔并加入rIL-2 ，50单位/孔。

最近半年一直在养293T细胞，其实我养的293T是经过改良的，是斯坦福大学

nolan实验室的phenix 系列中的一种（大家自己去找找看吧，就在学校主页里面 有）

我养这细胞之前，也养过一批293T ,是从南京医科大学搞到的，可惜，由于没

有经验，被我养的半死不活，最终彻底完完了。

细胞拿来时候，我按照从网上和上找到的资料，用单独的EDTA消化，

结果细胞长的非常难看，好多细小的颗粒在细胞的表面，然后细胞贴壁的情

况就不是很好，然后细胞就逐渐死掉了。后来我用直接吹打的方法，结果传

代，动存，复苏，都没有问题，而且细胞状态非常的好。我用的是DMEM＋10

％NCS（胎牛买不起啊）。冻存液配方是 4：5：1 ＝DMEM：小牛血清：DMSO

1 弃去旧培养液，用D-Hanks液冲洗细胞两遍

2 加入0.25%胰酶与0.02íTA各10滴，置显微镜下观察，三分钟后倒去消化液，再用D-Hanks液冲洗细胞两遍。

3 加入0.25%胰酶10滴，再消化三分钟，加血清终止消化，吹打细胞（液体不够可适当加入D-Hanks液）

4 离心8分钟（1000转/分钟），去上清。加入D-Hanks液吹打混匀，再离心一遍。 5 加入培养基5毫升混匀细胞，按1：2分装传代！

忘记说了，我的是角质形成细胞的传代

不同细胞传代方法：

1.悬浮细胞：如k562，勿需消化离心，可直接由孵箱内取出---直立静置1-3分钟---吸取上层培养基1/3-2/3 --- 加入新配制的培养基（含双抗和10%小牛血清）--- 传代即可。 2.半贴壁细胞：如小鼠Lewis肺癌细胞，勿需消化离心，先倾出瓶内培养基---加入少量新配制的培养基（不含小牛血清）轻轻吹打均匀--- 加入新配制的培养基（应将吹打前加入的培养基体积考虑在内，使小牛血清浓度为10%，含双抗）--- 传代即可。

3.贴壁细胞：如L929，先消化离心---弃上清---加入少量新配制的培养基（不含小牛血清）轻轻吹打均匀--- 加入新配制的培养基（应将吹打前加入的培养基体积考虑在内，使小牛血清浓度为10%，含双抗）--- 传代即可。 注：操作过程应严格无菌，OK

本人培养的是DG-75细胞（B淋巴瘤细胞株），为悬浮细胞，使用1640加10％新生牛血清，未加双抗，当培养液转微黄时候，肉眼可见瓶内有细小颗粒，但整体清澈，倒置显微镜下可见细胞成葡萄状成串，有立体感，即液体各个层面都有大量细胞团，是传代的好时机。只需要吸取原培养液分装到3-4个新的培养瓶，原瓶稍有液体覆盖即可，各瓶再加培养液到8ml即可。

采用常规方法培养。人脐静脉内皮细胞株ECV304（购自上海细胞生物学研究所）在含体积分数为10%胎牛血清（FPS）的RPMI1640培养液，37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度条件下培养，3-4d换液传代一次。实验时采用对数生长期细胞。传代时先倒掉旧培养液，用pbs５ml洗两遍，再加入0.25%的胰酶+0.01íta，加入的量以能覆盖瓶底为准。加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底，然后大约半分钟左右看一次，对着光源观察瓶底细胞黏附面是否有裂缝（如有则在显微镜下可见细胞之间出现间隙且有大部分细胞呈现圆形），倒掉，加入含低浓度血清培养液，然后吹打瓶底各处使细胞脱落。离心后去除上清液，加全培，再分４瓶，补加培养液。这样操作步骤可大大简化，不需要将培养瓶拿出拿进操作台了． 附:消化缓冲液(0.25%)胰蛋白酶： 胰蛋白酶干粉1.25g，0.1gEDTA，溶于50ml 10×D-Hanks溶液中，调节至PH 7.6，定容至500ml，22um滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存备用。

请传授养气道平滑肌细胞的经验，第四代时大概可培养出多少细胞来

我也来谈谈我养过的细胞经验:

我养细胞肝癌细胞(H22),是采用体内传代法

把肝癌细胞(H22)株浓度调整为2*10 6次方,腹腔内接种0.08ml,一般一周内即可 见到腹水生成,随时间推移腹水逐渐增多.

这种方法养细胞保持细胞的各种特性,使用方便.

我养的也是vero（非洲绿猴肾cell):贴壁细胞。

传代步骤比较传统：倒掉培养液－>PBS洗2遍－>胰酶0.25%消化－>倒掉胰酶－>加培养基－>用吸管吹打均匀－>分瓶－>放置37度，5%CO2孵箱。 我的体会是（可能有不少不规范的地方，大家讨论，指正）：

1.消化时间和实验环境温度也有很大关系，我们实验室条件比较差，不能维持恒温（不过我想大部分实验室目前也还是做不到的）。夏天的时候，消化特别快。但是到了冬天，就很慢，要用手捂老半天。

3.消化到什么程度可以，经验很重要，如果每瓶消化都要通过显微镜观察来判断，首先效率太低，而且还很容易消化过头。对光观察培养瓶，当感觉到有些泛白，瓶角有少许细胞脱离的时候就可以了，倒掉消化液，用手轻拍培养瓶就能脱离了。

2.我们一般培养的时候，就用5%的小牛血清，只有刚传代的时候才用10％的。感觉这样，细胞不会长的特别快，3-4天换一次液完全没有问题。

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？！ by victoh

我说一下我养的人前列腺癌细胞株LNCaP：贴壁细胞 传代过程：（以25ml培养瓶为例） 1. 移除旧培养液；

2. 加入1ml PBS或胰酶（0.25%Trypsin+0.02íta)洗； 3. 加入1ml胰酶消化；

4. 镜下观察消化完全后，加入2-3ml培养液，反复轻轻吹打使细胞脱落并分散成单个细胞； 5. 转移到10ml离心管，800转4度下离心4分钟，吸去上层液，加入少量培养液，轻轻吹打使均匀；

6. 吸取1ml于新培养瓶中，加入9ml培养液于37度，5%CO2，饱和湿度下培养。

注意事项：

1. 培养液为10%胎牛血清（外国产）的RPMI1640，加双抗（最终100单位）。根据我的经验：胎牛血清浓度越高，细胞贴壁越牢；

2. LNCaP虽然是贴壁细胞，但贴壁不牢，而细胞间作用较强，不易分散。因此操作过程中，加PBS和胰酶动作一定要轻要慢，否则细胞易成片脱落；

3. 消化时加入胰酶后，避免晃动培养瓶，否则细胞易成片脱落，导致不易消化成单个细胞。尽可能消化完全（镜下观察细胞成单个圆形，也可置于37度培养箱中消化），这样才易吹打成单个细胞；

4. 不要等细胞长满再传代，传代比例一般一传三或一传四，传代周期一般为一周； 5. 不要用旧瓶旧皿传代，否则细胞不贴壁；

6. 传代后48小时内不要动，否则细胞不易贴壁；

7. 如果只要换液，新培养液最好在37度温浴，因为加冷培养液易使细胞悬浮起来。

我们实验需要养的是HELF(人胚肺成纤维细胞),这也是一种贴壁生长的细胞,所以传代培养时的大概方法没有什么不同.但这种细胞贴壁贴得不是很紧,所以消化过程中有几点注意事项(本人总结):

1.当倒出原有培养液时,最好将培养瓶反过来,即有细胞的面朝上. 2.如用EDTA消化,最好先让其消化3分钟,后每一两分钟看一次.

3.每次看时不要太过晃动瓶子,以防细胞成片脱落.如果细胞成片脱落了就比较麻烦了,因为细胞已经脱落,就不得不终止消化,但实际上细胞与细胞间的连接并没有完全断开,吹打也分不开,那样分出来的细胞也就成团,则不利于细胞贴壁及生长.

4.如果在终止消化前有细胞脱落,不要浪费,先加Hank's液终止消化,然后离心,收集细胞,再让其生长.

5.细胞生长状态好时,一般5-7天可以长满,其间换一次液就可以了.

6.但我也遇到过生长不太好的情况,细胞长了12天才长满,且其中有几天几乎没长或出现大量黑色死细胞团,这时不要放弃,只要活细胞不是太少,没有关系.之所以长的慢或有死细胞,大概是消化时EDTA的损伤造成的,细胞恢复活性需要一定时间,且一旦活性恢复,细胞将长得很快.

以上是本人实验中的一点小经验,希望有所帮助.

【专题讨论】

我仔细翻看了一哈，好像说人肝癌BEL-7402细胞的比较少，我做的就是这种细胞，下面谈谈我的传代步骤：

1. 弃去旧培养液（可用巴氏吸管吸去，也可直接翻转培养瓶，使培养面朝上，直接倒掉培养液）。

2.PBS冲轻缓漂洗细胞两遍，尽量洗去残余血清，弃PBS液。

3 加0.25%胰酶（以盖满瓶底为标准）于37度条件下消化，倒置相差显微镜下观察，细胞解离程度以细胞突起回缩，细胞间隙增大，细胞近乎缩成圆形为准。 4.直接加含血清的1640培养基（或血清)终止消化。

5.用弯头吸管均匀有序的吹打细胞，动作不宜过猛，防止起泡产生。

5. 离心5分钟（1000转/分钟），去上清。加入PBS液吹打混匀，再离心一遍。 6. 用含10％小牛血清的1640培养液重悬细胞，按1：3传代！ 7.补加培养液至所用培养瓶容积的1/10为准。 8.送孵箱培养。

【专题讨论】

我还做过骨髓间充质干细胞（MSC）的原代及传代培养，下面谈谈我的传代步骤： 1. 弃去旧培养液。

2.D-Hank's液轻缓漂洗细胞两遍，尽量洗去残余血清，弃去D-Hank's液。

3 加0.25%胰酶（以盖满瓶底为标准）于37度条件下消化，倒置相差显微镜下观察，以细胞突起回缩，细胞间隙增大，细胞近乎缩成圆形为准。 4.直接加含血清的LG-DMEM培养基（或血清)终止消化。

5.用弯头吸管均匀有序的吹打细胞，动作不宜过猛，防止起泡产生。 5. 离心5分钟（1000转/分钟），去上清。 6.加入D-Hank's液吹打混匀，再离心一遍。

7. 用含10％小牛血清的DMEM培养液重悬细胞，按1：2传代。

8.补加培养液至所用瓶容积的1/10为准。 9.送孵箱培养。

我也来说说肿瘤细胞鼠黑色素瘤B16细胞的培养，该细胞来源于C57B/L6小鼠。

该细胞比较好养，用10%新生牛血清(国产四季清的）+RPMI1640、5%CO2、37度培养。重要的是无菌操作。用0.25%胰酶消化，含0.02íTA。消化步骤如下：弃培养基——用1640洗一遍——弃培养基----加胰酶——镜下观察边晃动——细胞开始变形即可——弃胰酶-----加含血清的1640吹打———镜下看成单细胞悬液----离心---加适量培养基——继续培养。

【专题讨论】

我和师兄一起做过神经干细胞（NSC）的培养，下面谈一下NSC的传代步骤： 1.相差显微镜下观察，至细胞克隆生长较为密集时，开始传代。

2.机械分离（因为NSC是悬浮生长，可用巴氏吸管轻轻吹打细胞克隆）细胞克隆，制成单细胞悬液。

3.转移至离心管离心，1000rpm，离心10min。

4.弃上清，加无血清NSC培养基DMEM/F12(1:1）重悬。 5.1：2传代，补加培养基。 6.送孵箱继续培养。

我说一下HepG2 2.2.15细胞，它为转染乙肝病毒的肝癌细胞，培养液为MEM加10%胎牛血清，1%谷氨酰胺，380ug/ml G418, 5%CO2、37度培养,细胞生长较慢，3天传代一次。0.3%胰酶消化，该细胞不容易消化，易抱团，我是加胰酶37度2分钟，倒掉胰酶，将培养瓶倒置4分钟再加入培养液，吹打重悬。

S9混合液辅助因子有哪些？

内皮细胞瓶底的数量喽，满了就传代，要不然，细胞要自杀的，

细胞培养技术

出处：西京医院妇产科 --医海拾贝

一、细胞培养基本概念

细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。

在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞克隆的

细胞系其这一特征可以不明显。 二、细胞培养的环境

细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。 1、无污染环境

培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。 2、恒定的温度

维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。 3、气体环境

气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。 二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8时最适。

细胞培养液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止PH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值。 4、细胞培养基

培养是既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。

（1）合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。

（2）天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合志培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。常见使用最为5-20%。 三、细胞培养设施和基本条件 1、实验室设计

细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养工作包括：工作液配制、无菌操作（采样）、温育、无菌处理，细胞和用品贮存等。细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。

2、常用设施及设备

（1）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。

（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓部间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。

（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物品。 （4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。 （5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。 3、培养器皿

细胞培养以玻璃器皿为主，常准备最需是使用最的三倍。器皿应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品。常用的玻璃器皿有下面几种。

（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常以500ml、250ml、100ml生理盐水瓶或血浆瓶代替。

（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等几种。用于外周血培养的常用10ml普通圆瓶。两种培养瓶均要求选用优质玻璃制成。

（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径30mm、60mm、120mm等几种。 （4）吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。常用1ml和10ml两种。短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。

（5）离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为50ml、30ml、15ml；后者则多为10ml和5ml。

（6）其它：如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。 四、培养细胞形态

体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长。如羊水细胞为贴附型细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 1、成纤维型细胞

在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3厘米个长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。 2、上皮型细胞

此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有园形核，细胞紧密相连单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮型形态生长。 3、游走型细胞

本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细腻包形态。常见于羊水细胞培养的早期。 五、培养细胞形态分析

培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等，表明细胞代谢不良。

六、培养用品的清洗与消毒

目前我国细胞培养器皿主要仍使用能反复使用的玻璃器皿，清洗的主要目的为清除杂质和微生物，使在器皿内不残留任何影响细胞生长的成份。因而在组织细胞培养中清洗和消毒是一项极为重要的环节。 （一） 清洗

在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。因此对新使用和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同的清洗方法。 1、玻璃器皿的清洗

组织细胞培养中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、侵酸和冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿仅要求干净透明无油迹，而且不能残留任何物质。

（1）浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。新瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液（5）浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。

（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。

（3）浸酸：清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。清洁液去污能力很强。是清洗过程中关键的一环。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于6小时。 清洁液可根据需要，配制成不同的强度，常用的下列三种： 重铬酸钾（g） 浓硫酸（ml） 蒸馏水（ml） （A）强清洁液 63 1000 200000 B）次强清洗液 120 200 1000 （C）弱清洁液 100 100 100

清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。

（4）冲洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或洁液的残迹。冲洗最好用洗涤装置。即省力、效果又好。如用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每天水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5次，晾干备用。 2、胶塞的清洗

细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟，晾干备用。 3、塑料制品的清洗

塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。

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