PCR自测题

PCR自测题

一、名词解释 1.PCR 2.变性 3.退火 4.延伸 5.逆转录PCR 6.停滞效应 7.共享引物PCR 8.多重PCR 9.反向PCR 10.原位PCR 11.LCR

二、单项选择题

1．PCR反应中，所设计引物的长度一般为（ ）

A．5～10核苷酸 B. 15～30核苷酸 C. <50个核苷酸 D.长度任意 E. 以上答案均不对

2．引物设计时G＋C含量在引物中一般占（ c ）

A. 20～40﹪ B. 30～60﹪ C. 45～55﹪ D.越高越好 E.含量随意 3．以下说法错误的是（ e ）

A 引物中的碱基组成应该尽可能的随机分布。 B 引物自身不应该存在互补序列

C 设计引物时应考虑使3?端引物和5?端引物具有相似的Tm值 D 引物的5?和3?端必须和模板严格配对结合

E 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70﹪ 4．下列说法正确的是（ ）

C. PCR反应常用的缓冲液为10－50mmol/L的Tris-HCl（室温 PH 8.3－8.8） D. 10mmol/L的KCl能促进引物的退火 E. 加入的BSA有利于破坏模板的二级结构 F. 二甲基亚砜有利于保护TaqDNA酶的活性。 E. Mg2+能降低Taq DNA聚合酶的活性。 5. TaqDNA聚合酶活性需要以下哪种离子（ c ） A．K+ B. Na+ C. Mg2+ D. Ca2+ E. Cl-

6．适用于DNA序列中单个碱基突变的检测的方法是：( d ) A．筑巢PCR B. 多重PCR C. 锚定PCR D. LCR

7．以下哪种PCR技术广泛应用于组织胚胎学和肿瘤学的研究（ a ） A．原位PCR B．差异显示PCR C．不对称PCR D．反向PCR

8.已知一段设计好的引物的序列为GTGGATCCATGGCTCCTCTGAAGATTC,其Tm值为（ ）

A. 78 B. 80 C. 82 D. 84 E. 无法计算

9．以下哪种PCR技术可以克服序列未能全知的障碍而获取目的扩增片段（ c ）

A.共享引物PCR B不对称PCR C锚定PCR D.筑巢PCR 10．一位疑似杜氏肌营养不良症的患者，可以采用以下哪种方法协助诊断（ ）

A.原位PCR B.多重PCR C.不对称PCR. D. 锚定PCR 11．以下关于dNTP的说法错误的是（ e ） B. dNTP具有较强的酸性，使用时应将pH调至7.0-7.5

C. PCR反应中，四种dNTP必须按比例配制，以减少反应的错配率。 D. dNTP的浓度过高会增加碱基的错配率

E. dNTP的浓度低，反应速度下降，但特异性提高

12. TaqDNA聚合酶可以不要模板在ds DNA的末端加上一个( )碱基. A. dGTP B. dCTP C. dATP D. dTTP 13. 有关PCR的描述哪个不对( d )

A.是一种酶促反应 B.引物决定扩增的特异性 C.扩增的对象是DNA序列

A) D.扩增的对象是氨基酸序列

14. 催化PCR的酶是 ( c ) A. RNA聚合酶 B. DNA聚合酶 C. Taq DNA聚合酶 D. 反转录酶

15. PCR产物具有特异性是因为( c ) A. Taq DNA酶保证了产物的特异性 B. 合适的变性,退火,延伸温度 C. 选择特异性的引物 D. 引物的Tm值不同. 16．LCR的说法正确的是 ( ) A. 体系中采用DNA聚合酶 B. 须设计一对引物

C. 反应需经过变性,复性,连接

D. LCR中,酶将dNTP加到引物的3-OH端 E. LCR具有高度敏感性

三、多项选择题

1．下列关于退火温度说法正确的是（ ） A. 合适的退火温度应低于引物Tm值5℃左右。 B. 引物与模板的退火温度一般在45－55℃之间

C. 在Tm值允许的范围内，选择偏低的退火温度可以提高PCR反应的特异性。 D. 退火时间至少需要一分钟。

2．进行PCR实验时以下措施有助于防止污染和结果的假阳性（ ）

B 隔离不同的操作区

C 分装试剂，减少重复取样所致的污染 D 严格实验操作 E 设立实验对照

3．适用于扩增3?或5?端未知序列的PCR技术是（ ） A．反向PCR B. 锚定PCR C. 多重PCR D.不对称PCR 4． 以下关于PCR技术应用说法正确的是（ ）

B 筑巢PCR和共享引物PCR有利于增强PCR反应的特异性，适用于模板含

量极少的样品的检测

C 不对称PCR可以大量制备单链DNA，可用于DNA的序列测定 D 彩色PCR适用于基因诊断和自动化DNA序列测定 E 定量PCR可用于基因表达和调控的研究

F 差异显示PCR可用于筛选和克隆受发育，突变等各种因素影响下差异表

达的基因

5. 关于引物设计说法正确的是（ ）

B 为保证PCR反应的特异性，所设计的引物长度一般>30个核苷酸 C 引物设计时G＋C含量在引物中一般为45～55﹪

D 按经验，引物自身存在的连续互补序列一般不超过3个碱基 E 两个引物之间不应存在互补序列，尤其避免3?端的互补重叠 F 引物的3?端可以游离而不影响PCR反应的进行 6. 以下关于PCR的说法正确的是（ ） A PCR的模板可以是DNA也可以是RNA B PCR的模板必须从组织细胞中分离出来

C PCR反应的特异性取决于引物和模板DNA的结合位点。 D PCR反应初期，目的DNA片断的增加呈指数扩增。 E PCR反应一般需要含102－105拷贝的模板 7．以下关于PCR反应条件错误的是（ ）

B PCR缓冲液中加入二甲基亚砜有利于破坏模板的二级结构，提高反应的

特异性。

C Mg浓度过高会降低TaqDNA酶的活性，Mg浓度过低又会使酶催化非

特异性扩增增强。

D 4种dNTP应以等摩尔浓度配制，以减少错配误差。 E 引物浓度一般为0.5-1umol/L 8. PCR反应时应设立哪种对照（ ） A. 阴性对照 B. 阳性对照 C. 试剂对照 D. 以上答案都正确

9. 逆转录反应体系包括（ ） B. RNA模板，四种dNTP C. RNA酶抑制剂 D. 合适的缓冲液体系 E. 逆转录酶

F. 寡聚胸腺嘧啶核苷酸引物 10. 有关PCR的模板说法正确的是 ( ) A. 模板可以是DNA也可以是RNA

B. 大多数PCR反应中对DNA模板纯度要求不高 C. 模板用量低

D. 标本处理的基本要求是除去杂质

11. 以下有关RT-PCR反应的说法你认为正确的有( ) A. 反应体系一般有20μl

B. 反应体系中有缓冲液, 四种dNTP, MgCl2, DTT, 牛血清白蛋白, Oligo(dT)

引物RNA模板和逆转录酶

C. 逆转录于42℃进行,随后即进行PCR

D. RT-PCR的最终反应过程依然是以DNA为模板的PCR反应

12. PCR的产物累积的特征是( )

B. 反应初期,目的DNA片断呈指数扩增 C. PCR进行到一定时间出现反应中的停滞效应

D. 到达平台期的的PCR循环数取决于反应体系中酶的耗竭程度 E. PCR平台期的出现多数不可避免

F. 到达平台期时若扩增目的DNA片断不足,可继续加入模板,酶和缓冲液进行

PCR反应

13. 有关Mg2+在PCR中的作用说法不正确的是( ) A. Taq DNA 酶的活性维持需要Mg2+

B. Taq DNA酶的活性与反应体系中的Mg2+总浓度有关 C. Mg2+过低,酶催化非特异性扩增增加 D. Mg2+过高会降低酶的活性

E. 总量应低于dNTP的量, 常用1.5mmol/L 14. PCR中使用的底物dNTP应该是( ) A. 使用前应将pH值调至7.0-7.5

B. dNTP浓度高可以加快反应速度,但却增加了出错率 C. 降低反应速度可以提高反应特异性 D. PCR中, 4种 dNTP必须按一定比例配制 E. Mg2+会与dNTP结合,应注意二者浓度之间的关系 15. Taq DNA酶的特点是( ) A. 75-80℃时具有最高的聚合酶活性 B. 活性的维持需要Mg2+的参与

C. Taq DNA酶和klenow片断一样具有校正功能 D. Taq DNA酶的忠实性很高 E. 具有类似末端转移酶的活性 16. 有关引物的说法正确的是( ) A. 引物浓度一般为0.1-1.5μmol/L B. 引物与模板的的比至少为108:1

C. 引物浓度过高会引起错配和非特异扩增,降低扩增效率 D. 引物Tm值位于55-80℃较理想 17. PCR反应温度应该是( )

A. 为使DNA变性完全,变性温度越高,时间越长越好 B. 按模板DNA的复杂程度来调整变性温度和变性时间 C. 于反应管中加入1-2d 石蜡油防止反应液的蒸发

D. 温度越高时间越长, dNTP破坏增加,对PCR反应产生不利影响 18.有关退火温度正确的是( )

A. 引物与模板退火温度一般在45-55℃ B. 退火温度过低,使非特异扩增增加 C. 退火温度过高, PCR扩增含量下降 D. 退火时间一般为1-2分钟

E. Tm值的允许范围内,应该选择较低的退火温度 19.延伸温度应有如下特点( ) A. 一般为72℃

B. PCR延伸时间越长, 产物的得率越高 C. Taq DNA酶在延伸温度时有较高的酶活性 D. PCR延伸时间根据待扩增片断的长度而定 20.PCR循环次数设定时应注意( ) B. 应由最初靶分子浓度而定

C. 理论上20-25个循环后, PCR产物累积达最大值 D. PCR的循环次数一般为25-30次 E. 循环次数过多时会引起停滞效应 21.PCR样品制备时应注意( ) B. 应有专门的区域制备模板

C. 提取DNA样品和RNA样品时要带手套且经常更换 D. 纯化样品对污染有极大的影响

E. 普通分子克隆工具不能用做样品的处理和靶序列

F. 提取核酸所用的试剂要求新鲜配制或者适当储存未经使用的试剂. 22.操作中应该注意( )

A. 使用的溶液应该没有核酸,核酸酶 B. 试剂水都是高质新鲜蒸馏水

C. 工具(枪头,试管) 都是一次性并且高压灭菌 D. 应有专门的操作区 E. 试剂应该分装保存

23. PCR反应总为阴性时应该( ) A. 增加Taq DNA酶的浓度 B. 增加靶DNA的量

C. 增加扩增循环或者降低退火温度 D. 提纯样品

E. 取10μl扩增液再行PCR

24. PCR反应出现非特异产物时,应该采取的措施是( A. 增加退火温度 B. 降低Taq DNA酶浓度 C. 减少退火及延伸时间 D. 减少引物浓度 E. 减少扩增循环次数 25.PCR可以广泛应用于( ) A. 遗传性疾病的基因诊断 B. 检测癌基因 C. 检测病原微生物 D. 法医鉴定 E. DNA序列测定

26.对RNA的体外扩增过程,描述正确的是( ) A. 分为循环相和非循环相 B. 也具有变性,复性,延伸三步

) C. 反应体系中含有dNTP和NTP两种类型的核苷酸 D. 反应中含有两种特异性引物 E. 待测RNA作为模板进入循环相 27.RNA-PCR技术的特点为( ) A. 扩增效率高 B. 扩增时间短 C. 特异性不强 D. 需严防DNA的污染 28.下列说法错误的是( )

C. RNA-PCR中, 非循环反应与循环反应不处在同一反应体系 D. RNA-PCR中,扩增产物以2的指数递增

E. 反应温度一般为37-42℃, 时间一般为30分钟到1小时 F. RNA-PCR需采用25个循环达到需要量

G. 依赖于逆转录酶, RnaseH和T7RNA聚合酶共同作用 29. 利用PCR技术测序有下列哪几种方法( ) A. 双链直接测序 B. 基因扩增转录测序 C. 不对称PCR产生单链测序 D. 双链克隆后测序

四、填空题

1. PCR反应体系含有 ， ， ， 。 2. PCR反应的基本过程为 , , 3. 引物与模板的退火温度一般为 ，延伸温度一般为 4. PCR循环次数一般设定为 ，过多的循环次数会导致 的出现。 5. ， ， 可用于LCR产物的检测。 6. 引物3?端最佳碱基选择是 和 。 7. PCR的标本处理的基本要求是

8. PCR的反应体系一般选用 。

9. PCR反应的缓冲液提供了PCR反应 与 常用的为 10. PCR的反应体系中，Mg2＋的浓度一般保持在 ,常用的是 11. TaqDNA聚合酶具有 ，缺乏 因此无 。

12. 在变性过程中，为防止反应液的蒸发，可在反应管中加入 13. PCR反应时应设立以下实验对照： , , . 14. 定量PCR必须设立

五、简答题

1、简述PCR反应的基本步骤。 2、简述PCR模板的种类及制备方法。 3、简述PCR产物的积累规律。 4、简述PCR的基本反应。 5、简述PCR实验应注意的事项。 6、简述连接酶链反应的基本原理。 7、简述RNA体外扩增的特点。

六、论述题

1、试述PCR的基本原理及引物设计原则。 2、试述PCR技术的特点。 3、试述PCR反应条件的优化。

4、试述PCR的主要类型及其工作原理。

参考答案及题解

一、名词解释

1、PCR: 即聚合酶链式反应。在模板，引物，4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间的DNA区段地酶促合成反应。

2、变性：于PCR反应体系中，通过加热使温度至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。

3、退火： PCR反应中，经变性后将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA模板互补区域结合，形成杂交链的过程。

4、延伸：当反应体系温度升至70℃左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的5?→3?延伸反应，形成新生DNA链。

5、逆转录PCR：以mRNA为原始模板进行的PCR反应。

6、停滞效应：PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。

7、共享引物PCR：利用3条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种待扩增序列都互补，它与另两条引物分别组成两对PCR引物，此种PCR常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。

8、多重PCR：在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中不同序列的PCR过程。

9、反向PCR：利用连接酶将一段未知序列两端连接成环状，利用单一限制酶原点切开已知序列，据已知序列的碱基顺序设计3?端和5?端引物扩增未知序列。 10、原位PCR：以组织固定处理细胞内的DNA或者RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程，不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA。

11、LCR：连接酶链反应，又称连接酶扩增反应，是以DNA连接酶将某一DNA链的5?磷酸与另一相邻链的3?羟基连接为基础的循环反应, 特点是能准确分析基因序列中的单个碱基突变。

二、单项选择题

1、B PCR的引物设计长度一般为15～30个核苷酸，过短影响PCR特异性而过长却会提高相应的退火温度，并使延伸温度>TaqDNA聚合酶的最适温度，影响产物的生成

2、C 含量过低，反应的特异性不高。但是含量太高又会使引物的Tm值升高，不利于PCR反应的进行

3、D 引物的3?端碱基是延伸的起点，必须与模板严格配对结合，但是5?端的的碱基可以游离，而不影响引导新生DNA链合成 4、A

5、C TaqDNA聚合酶活性与反应体系中的游离Mg2+浓度相关

6、D LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5?磷酸与另一相邻链的3?羟基连接为基础的循环反应, 特点是能准确分析基因序列中的单个碱基突变 7、A 原位PCR不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA,经扩增后，大部分产物留在细胞内，再可以结合原位杂交或者PCR标记引物的显色技术而广泛应用于组织胚胎学和肿瘤学的研究 8、C Tm＝4（G+C）＋2（A+T）

9、B TaqDNA聚合酶缺乏3?→5?外切酶活性，因而没有校正功能

10、C 锚定PCR首先通过分离细胞的总RNA或mRNA，逆转录生成cDNA，后在cDNA3?末段加上poly尾。再通过poly锚定引物和与cDNA特异配对的引物共同进行PCR扩增

11、B 多重PCR可以扩增一份DNA样品中的不同序列，因此可以检测是否存

在某些基因片段的缺失和突变。

12、B PCR反应中，四种dNTP必须等摩尔浓度配制，以减少反应的错配率并

提高使用效率。

13、C Taq DNA聚合酶具有末端转移酶的功能, 能催化dNTP加到DNA的3-OH端, 但对dNTP的聚合能力不同, 对dATP的聚合能力高于其他三种核苷酸,故而PCR的产物末端总是带有两个A.

14、D PCR扩增位于两个特异性引物之间的DNA片断, 扩增的特异性由引物

特异性来决定. PCR反应本身符合酶促反应动力学, 是一种酶促反应 15、C Taq DNA聚合酶具有良好的热稳定性, 广泛应用于PCR反应. 16、C PCR反应的特异性由引物的特异性决定, 它特异地扩增位于两个引物间

的DNA片断.

17、C LCR需要设计两对引物, ,采用DNA连接酶,将某一DNA链的5磷酸与

另一链的3羟基连接.它并不具有PCR的高度敏感性.

三、多项选择题

1.A B 在Tm值允许的范围内，选择偏高的退火温度可以减少引物和模板的非

特异性结合，提高PCR反应的特异性；退火时间一般选择30秒－1分钟，足以使引物和模板结合完全

2.A B C D 隔离不同的操作区, 分装试剂，减少重复取样所致的误差, 严格实

验操作污染, 设立实验对照 3.A B 4.A B C D E

5.B C DA PCR的引物设计长度一般为15～30个核苷酸，过长会提高相应的

退火温度，并使延伸温度>TaqDNA聚合酶的最适温度，影响产物的生成。 引物的3?端碱基是延伸的起点，必须与模板严格配对结合 6. A C D E 原位PCR无需从组织细胞中分离模板

7.B DB Mg浓度过低会降低TaqDNA酶的活性，Mg浓度过高又会使酶催化非

特异性扩增增强。引物浓度一般为0.1-0.5μmol/L 8. A B C D 9. A B C D E

10. ABCD PCR反应的模板可以是DNA,也可以是RNA(先逆转录生成cDNA,

后行PCR反应), 大多数用途的PCR对DNA模板的要求并不严格(大量的实验数据表明存在一定量的蛋白质或者SDS对实验过程影响不大),并且模板用量很低但依然要达到一定的水平.对于PCR的标本处理最基本的就是出去杂质.

11.AD 反应体系中应该还包括RNA酶抑制剂, 当逆转录反应于42℃进行后,应

该将反应混合物加热再95℃5分钟,灭活逆转录酶,然后取2μl反应产物行以DNA为模板的PCR反应

12. BD PCR的扩增过程遵循酶的催化动力学原理,在PCR的反应初期, 目的D

NA片断呈指数扩增, 随着目的DNA产物的积累,酶的催化反应趋于饱和,出现平台期.并且到达平台期所需的PCR循环数目取决于样品中模板的拷贝数,PCR扩增效率,DNA聚合酶的种类和活性,以及非特异产物的竞争等因素.

13.BCDE Mg2+过低,会显著降低酶的活性, 过高又使酶催化非特异性扩增增强,

Taq DNA酶的活性与反应体系中的游离Mg2+有关, 而Mg2+又和引物,模板,dNTP分子中的磷酸基团结合从而使游离Mg2+浓度下降,所以Mg2+的总量应该高于dNTP的量.

14.ABCE PCR反应中,应该使四种dNTP等摩尔浓度配制,以减少错配误差和提

高使用效率

15. ABE TaqDNA酶没有3-5的外切酶活性因而没有校正功能.并且TaqDNA酶

体外扩增DNA的忠实性是所有已知忠实性的DNA聚合酶中最低的. 16. BCD 引物的浓度一般是0.1-0.5μmol/l

17. BCD 变性温度过高时间过长, TaqDNA酶容易失活, dNTP破坏增加,对PC

R反应产生不利影响

18. ABC 在Tm值的允许范围内,选择偏高的退火温度可以减少引物与模板之

间的非特异结合,提高PCR反应的特异性,退火时间一般为30秒至1分钟. 19.ACD 延伸时间过长易发生非特异性扩增

20. ABCD 理论上20-25次循环后PCR产物累积达最大值,但是实际上每次PCR

产物得率达不到100%, 所以一般设定为25-30次 21.ABCDE 22. ABCDE 23.ABCDE 24. ABCDE 25.ABCDE

26.ACD RNA的体外扩增不需经过变性,复性; 并且进入循环相的是反义RNA.

27.AB RNA-PCR技术的特异性很强,由于只有4-6次循环, 错配率减低了很多.

并且因为反应没有热变性,所以双链DNA不能作为模板扩增, 所以不必防止DNA的污染

28.ABD RNA-PCR中,循环相和非循环相处于同一反应体系,产物的扩增以10的

指数递增,所以只需要4-6次循环即达到所需量. 29. ABCD

四、填空题：

4 耐热的TaqDNA聚合酶，化学合成的寡核苷酸引物，四种dNTP，合适的缓冲液体系。 5 变性，退火， 延伸 6 45－55℃， 72℃ 7 25－30次， PCR反应“平台效应”。 8 核素标记法，荧光素标记法，地高辛标记法 9 G，C。

10 除去杂质，并部分纯化标本中的核酸 11 50－100ul。

12 合适的酸碱度，某些离子，，10－50mmol/L的Tris-HCl（室温 pH 8.3－8.8，72℃时为pH 7.2）。 13 0.2－2.5mmol/L, 1.5mmol/L 14 5?→3?聚合酶活性， 3?→5?外切酶活性，校正功能。 15 1－2滴液体石蜡 16 阳性对照，阴性对照，试剂对照 17 内参照

五、简答题

1. PCR反应的基本步骤包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。（1）变性（denaturation）：加热使双链DNA变为单链;（2）退火（annealing）：当温度

降至引物的Tm值左右或以下，引物与DNA模板互补区结合，形成杂交链，这一过程称退火。当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA的分子数大大超过模板DNA的分子数，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少；（3）延伸（extension）：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应。

1、 2. DNA和RNA均可作为PCR的模板。DNA可以直接作模板加入

反应体系进行扩增，RNA的扩增需要逆转录为cDNA后才能进行PCR扩增，故又称这种扩增方式为RT-PCR。

DNA模板的制备通常采用去垢剂破坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸或水煮沸溶解细胞。RNA模板的制备可采用RNA提取试剂盒、酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法、异硫胍氯化铯密度梯度分离法、SDS-酚-氯仿法。制备RNA模板时，要注意防止RNA水解。

3. PCR产物的积累规律：PCR反应过程遵循酶促动力学规律。在反应初期，反应产物以指数方式累积。随着反应的进行，体系中的各成分的比例发生变化，扩增速度逐渐放慢。反应后期，酶的催化反应趋于饱和，反应曲线出现拐点而进入反应的“平台期”。

达到平台期所需的PCR循环次数取决于反应体系中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶的种类和活性、引物质量、以及非特异性扩增条带的竞争等诸多因素。

4.（1）以DNA为模板的反应：反应体系一般选用50～100μl体积；其中含有缓冲液、MgCl、明胶或牛血清白蛋白、引物、4种dNTP、模板DNA、TaqDNA聚合酶。封上矿物油防止高温反应时液体的挥发，即可进行PCR反应。 （2）以mRNA为模板的反应：以mRNA为原始模板进行的PCR反应称为逆转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)。首先将mRNA逆转录生成cDNA，然后再进行PCR反应。逆转录反应体系一般选用20μl体积，其中含有RNA酶抑制剂、缓冲液、４种dNTP、MgCl2、DTT、牛血清白蛋白、oligo(dT)12-18引物，RNA模板、逆转录酶。

逆转录反应在42℃进行，随后将反应混合物加热在95℃，5分钟，灭活逆转录酶。取2μl反应产物，按DNA为模板的PCR反应步骤、进行扩增反应。 5. 由于PCR反应极强的扩增能力和检测的灵敏性，微量样品污染便有可能导致假阳性结果的出现。为此在实验操作中应谨防污染的发生，并设置严格的对照，以提高PCR结果的正确性。

在有条件的情况下，PCR实验室应设.样品制备区、PCR操作区及反应产物分析区；在进行PCR反应时，应设阳性对照、阴性对照和试剂对照；扩增反应总是阴性结果（无产物）时应采取的措施：⑴取10μl扩增混合液作模板再进行PCR扩增；⑵增加TaqDNA聚合酶的浓度；⑶增加靶DNA的量；⑷若模板为粗制品，提纯样品；⑸增加扩增循环次数；⑹适当降低退火温度；出现非特异性产物时应采取的措施：⑴增加退火温度；⑵减少TaqDNA聚合酶的浓度；⑶减少退火及延伸时间；⑷减少引物浓度；⑸减少扩增循环次数。

6. LCR的基本原理是设计两对引物，分别与模板双链DNA分子的一条链互补。然后用连接酶将两邻接的引物连接起来，如果模板链没有碱基突变，那么引物就可以与模板完全互补，两引物就通过磷酸二酯键连接成为下轮扩增的模板，如果模板链上有突变，在两个引物的连接处有一个或多个碱基不能配，那么两条引物就不被连接。因此没有连接产物就表明靶分子上至少有一个不配对碱基对。 7. RNA体外扩增特点：（1）反应中不需对核酸进行变性与复性；（2）其原理与PCR相似，反应分非循环相与循环相；（3）依赖于逆转录酶，RNase H和T7RNA聚合酶的共同作用；（4）反应体系中含两种特异性引物，分别用A，B表示，其中引物A含T7RNA聚合酶识别的启动子，它与待测RNA的3′端序列互补，引导合成cDNA的第一链。引物B与cDNA第一链的3′端序列互补，如果打算扩增全长的RNA，则引物B的序列与原始RNA的5′端序列一致。5.反应体系中含有dNTP和NTP两种类型的核苷酸，dNTP用于合成cDNA，NTP用于合成RNA。

六、论述题

1. PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外（试管、切片…）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。

PCR作为一个体外酶促反应，其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。引物设计一般遵循下列原则：

（1）引物长度一般为15~30个核苷酸。（2）碱基随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。G+C的含量为45~55%。3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54°C。（3）避免发夹结构形成，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。（4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补重叠。（5）引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。（6）引物3′端碱基一定要与模板DNA配对，最佳碱基选G和C。（7）引物的5′端可以修饰，如加限制酶位点，引入突变位点，起始密码子，终止密码子等。

2. PCR技术的特点：1）操作简便：完全自动化的操作，在循环期间，无须专人守侯，非常方便。

（2）省时：一个PCR反应周期，包括94℃～95℃变性30～60秒﹑50℃～65℃退火30～50秒﹑70℃～75℃延伸50～90秒；再加上预变性5～10分钟﹑最后一次循环后在70℃～75℃继续延伸10分钟，假设n=30个循环完成后，一般只需要2～2.5小时，就可完成扩增反应。

（3）灵敏度高：从理论上讲，一根头发，一个精细胞，一个二倍体细胞内的DNA都可得到扩增。单个细胞的PCR技术现已广泛地被采用。一般，PCR反应中模板的加入量约为102拷贝的靶序列,就可以进行PCR 反应。

（4）特异性强：特异性是指PCR发生错误引发的频率，特异性还反映了导致无关扩增产物的错配发生的频率。PCR反应只是在一对引物之间引发，因此，对反应液进行核酸电泳时，只能得到一条清晰的确定大小的条带。

（5）模板材料易获得：许多标本均能用于PCR反应，如细菌和病毒标本﹑血液或细胞标本、化石﹑鼻﹑咽﹑口腔及生殖器的拭子标本等。固定和包埋的石蜡或冰冻组织标本，拷贝数低﹑DNA已有损伤或降解的古化石标本均能进行PCR扩增反应。一般用于PCR反应的样品必须经过适当的处理，其目的有①去除能抑制Tag DNA聚合酶活性的杂质, ②使待扩增的DNA暴露，能与引物相结合。只要达到该要求即可，对纯度要求并不苛刻。

（6）有一程度的单核苷酸错误掺入：TagDNA聚合酶无3′→5′外切活性，对错误掺入的单核苷酸无校正修复功能，故PCR反应产物会有一定程度的碱基错误掺入。使用不同的DNA 聚合酶，其错掺率也不相同。

碱基错掺率的大小决定着PCR对模板序列忠实性的高低。在一个非常精确PCR反应体系中，硷基错配是可以忽略不计的。但是在进行PCR-Cloning 实验时，必须考虑由此带来的影响，是否会引起阅读框架的漂移或改变。 （7）PCR 扩增终产物3?端-OH的加尾：分析PCR产物两单链3?端的碱基，发现总带有一非模板依赖性的碱基，而这种多出来的“毛边”碱基几乎总是A。

可能由于Tag DNA聚合酶有末端转移酶活性，在扩增产物的3?端随机加上一种单核苷酸，而对A的加入具有优势。

利用这一特性，人们构建了一类新型的分子克隆载体—即3?端dT或ddT加尾载体，统称T载体，它可与末端携带dA的PCR产物进行连接，简化克隆步骤。 （8）PCR产物的积累规律：PCR反应过程遵循酶促动力学规律。在反应初期，反应产物以指数方式累积。随着反应的进行，体系中的各成分的比例发生变化，扩增速度逐渐放慢。反应后期，酶的催化反应趋于饱和，反应曲线出现拐点而进入反应的“平台期”。 3. PCR反应条件的优化：

（1）引物：引物设计及合成质量的好坏至关重要，合成的引物常用聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向层析柱进行纯化。冻干的引物可于-20℃下保存1～2年，液体

的引物在-20℃下保存6个月。在一个标准的PCR反应中，引物的终浓度为0.2～1?mol/L。

（2）缓冲液：目前常用的PCR缓冲体系为pH 8.3～8.8（20℃）的10～50 mmol/L Tris-HCI。pH变化于6.8～7.8之间。改变Tris浓度，有时会增加产率。 （3）Mg2+： Mg2+离子浓度影响Taq DNA聚合酶的活性和忠实性，还影响引物的退火﹑模板与PCR产物的解链温度﹑产物的特异性﹑引物二聚体的形成等。 （4）dNTP：TaqDNA聚合酶缺乏3?→5?端的外切活性，没有校错功能，会产生碱基的错误掺入。所用的四种dNTP的终浓度应该相等，以使错掺率降到最低。 （5）耐热DNA聚合酶：耐热Taq DNA聚合酶的引入是PCR实验成败及走向实用化的关键。除了耐热Taq DNA聚合酶外，还开发了其它耐热酶，如Pfu、Vent 和Tth 等，并且还用基因工程的方法生产了一些重组的耐热酶。 （6）温度循环参数：

退火温度??退火温度的优化首先采用计算引物-模板对的Tm 值。但其中一个单一碱基的错配大约降低Tm 值5℃。所以应将Tm 值看为估计值。 变性温度??典型的变性条件是95℃ 30秒，或97℃ 15秒。对于富含G+C的靶序列，温度高可能更有效，但是也会影响酶活性。最好采用薄壁的试管。

延伸温度??作为一般的规律，Tag DNA 聚合酶1分钟延伸1kb的长度。在通常选定的延伸温度下（70～72℃），Tag DNA 聚合酶将以每分钟3.5kb的速率延伸

（7）循环数：循环数决定着扩增程度，在其它参数都已优化的条件下，最适循环数取决于模板的初始浓度。在初始靶序列浓度为3×105 ﹑5×104 ﹑1×103 ﹑50个拷贝分子时,其循环数可分别为25～30﹑30～35﹑35～40﹑40～45 个循环。 （8）PCR促进剂：二甲基亚砜（DMSO）有变性DNA模板的作用，对Klenow 片段有利，但对Tag DNA 聚合酶有抑制作用，尽量不用。甘油有助于PCR反应的复性过程，尤对G+C含量高和二级结构多的模板以及扩增长片段（>1500kb）更适用，但并非对所有的PCR均有益。氯化四甲基胺（TMAC）可以去除非特异性扩增，促进PCR但又不抑制Tag DNA 聚合酶。

4.（1）筑巢PCR：筑巢PCR法是用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引物以大片段为模板扩增获取目的基因。筑巢法PCR反应中，由于模板必须与4个核苷酸引物结合才能获得阳性结果，因此特异性很高。

（2）共享引物PCR：利用3条引物来扩增两种不同的DNA序列。其中一条引物与两种DNA序列都互补，这条引物与另外两条引物分别组成两对PCR引物。 （3）多重PCR：即在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。 （4）不对称PCR：其原理是采用不同的引物浓度，经PCR扩增得到单链DNA。一般采用50～100：1比例的引物浓度，其中低浓度引物通常为0.5~1.0pmol/L。在PCR前25个循环中，主要生成双链DNA产物。在低浓度引物逐渐耗尽时，高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA，分离此扩增产物中单链DNA，利用原引物或扩增单链DNA序列内的另一条引物直接测序。

5、锚定PCR（anchored PCR）

通常采用的PCR反应必须知道欲扩增DNA或RNA片段的两侧的序列，锚定PCR可以帮助克服序列未知或序列不全知所带来的障碍。其主要原理分离细胞总RNA或mRNA，在逆转录酶作用下合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA 3′末端加上poly(dG)尾。设计一条与此poly(dG)相对应的锚定引物poly(dC)。在锚定引物和与基因特异配对的另一条引物参与下，可以扩增此带同源多聚物尾巴的DNA序列。

6、反向PCR（inverted PCR）

反向PCR可以扩增已知DNA序列两侧的未知序列，亦可用于未知DNA片段的测定。其主要方法是用一种或几种限制酶将基因组DNA完全消化，但已知序列内部不应有这些限制酶切割位点，经消化后的大大小小的DNA片段中就会有我们所需要的片段，用连接酶将这些片段连接成环状。用单一限制酶原点切割已知序列。根据已知序列的碱基顺序设计3′端引物和5′端引物扩增未知序列。当然也可直接以环状的DNA为模板，扩增未知序列。

7、彩色PCR（ color complementation assay）

又可直译为“着色互补性检测”或称荧光PCR 。荧光PCR的原理就是用不同的荧光染料，如红色的罗丹明（POX）和绿色的荧光素FAM等分别标记PCR引

物的5′端，进行PCR扩增后的产物就会有不同色彩的染料，可发出不同颜色的荧光。用荧光激发灯观察电泳结果，可见到彩色产物，并可彩色照相。

彩色PCR可用于基因诊断，也可用于几种可疑病毒感染的诊断。 8、原位PCR（in situ PCR）

将原位杂交的细胞定位技术和PCR的高灵敏度相结合，产生了原位PCR技术。其原理是以组织固定处理细胞内的核酸或RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程。与其它PCR方法不同的是，原位PCR不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA。用探针与PCR扩增产物原位杂交或与PCR标记引物的显色技术结合，原位PCR成为检测靶基因的细胞定位，组织分布及靶基因表达的重要手段。应用于肿瘤发生学，胚胎学，RNA转运和病毒学检测等。

9、定量PCR（quantified PCR）

其原理是以mRNA为模板合成cDNA后，再在同一反应管内同时加入参照基因和待测基因，参照引物和待测基因引物进行PCR扩增，以参照基因的扩增产物为基础，观测待测基因产物的相对量。内参照采用报告基因的RNA，如β肌动蛋白，3-磷酸甘油醛脱氢酶，rRNA基因等。设内参照的目的是消除反应中存在的各种因素对PCR反应结果的影响，同时去除采用不同反应管所发生的试管效应。常用于mRNA定量。

10、差异显示PCR（differential display PCR）

差异显示PCR又称差异显示逆转录PCR（DDRT-PCR）。是一种筛选和克隆受发育，突变、各种因素影响下差异表达基因的方法。其原理是将两种mRNA的样品逆转录成cDNA的第一链。然后加入两种引物进行PCR反应,一种为锚定引物，另一种为10聚体的随机引物。锚定引物12种，随机引物24～26种，按随机组合共有288个PCR反应，那么两种mRNA就有576个RT-PCR反应，这样能将哺乳动物细胞内任何一种cDNA中的一个片段扩增出来。PCR产物作为相应mRNA的代表，采用变性或不变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相互比较，可以发现两种样品PCR产物的差异片段。再将这些差异片段进行扩增，与mRNA进行杂交分析，同时进行克隆和序列分析，最后确定差异表达的基因。

11、重组PCR（recombinant PCR ）

重组PCR说得简单一些就是PCR参与的体外基因突变过程或基因融合过程。 基因突变：即在基因需要突变的位点，按照位点的前后核苷酸序列设计一个与目的基因靶序列互补，但改变了其中一个或几个核苷酸的引物，用该引物进行PCR，扩增的目的基因上都带有改换过的核苷酸，即是说目的基因靶序列处的核苷酸改换了。

基因融合：即在两个PCR扩增体系中，两对引物中分别由其中之一在其5′末端和3′末端引物带上一段互补的序列。混合两种PCR扩增产物，经变性和复性，两种PCR产物通过互补序列发生粘连，其中1条重组杂合链能在PCR条件下发生延伸反应，产生1个包含两个不同基因的杂合基因，即融合基因。

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