血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定

一、实验目的

1. 掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法； 2. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法； 3. 了解柱层析技术。

二、实验原理

血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。

本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋白质分离教果。

1．盐析

蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。盐析法的原理是：中性盐如硫酸铵((NH４)２SO4)等对蛋白质作用破坏了蛋白质表面水化膜，并且中和了部分电荷，从而使蛋白质相互聚集而析出。由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不同，因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀，利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来，即在半饱和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解，由此达到分离清蛋白和白蛋白的目的。

2．脱盐

盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐，

常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。本实验采用凝胶层析法脱盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。

3.纯化（离子交换层析）

离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。

本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的点正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和伽马球蛋白分离出来。

4.纯度鉴定（电泳）

血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

三、材料与方法：以流程图示意

1.实验材料

人血清、葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、0.3mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/l的PH6.5醋

酸铵缓冲液、0.02mol/l的PH6.5醋酸铵缓冲液、1.5mol/l的NaCl-0.3mol/NH4AC溶液、20%磺基水杨酸、1oCl2溶液、电泳仪、电泳槽。 2.实验方法 1) 实验流程 盐析法进行 2) 实验步骤

① 盐析：中性盐沉淀步骤 步骤 （1）盐析 操作 取离心管一个，加入0.8mol人或动物血清，边摇边缓慢滴入饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀后室温下放置10min，离心10min（4000r/min）。用滴管小心吸出上清液置于试管中，作为纯化清蛋白之用 （2）溶解沉淀 向离心管的沉淀加入0.6mol蒸馏水，振摇使之溶解，作为纯化γ球蛋白用 注意：上层清夜尽量全部吸出，但不可吸出沉淀物。 ② 脱盐：过凝胶层析柱步骤 粗分离 葡聚糖凝胶层析 DEAE纤维素离子交换层析 醋酸纤维素薄膜电泳 粗 提 脱 盐 纯 化 鉴 定

步骤 操作 （1）调节层析柱葡萄糖凝胶G-25层析柱经0.02mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液流洗液面 平衡后，取下恒压储液瓶管塞，小心控制柱下端螺旋夹，使层析柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床液面 （2）加样品 用细长滴管吸取上述经盐析所得的粗制蛋白质溶液，小心而缓慢的加入凝胶床上面，柱下端用10ml刻度离心管接液，拧松柱下螺旋夹，调节适当流速，使样品进入凝胶床，至液面降到凝胶床表面为止 （3）洗层析柱 小心用0.02mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液洗涤层析柱内壁，以洗涤粘在柱壁上的蛋白质样品液 （4）洗脱 待样品液进入凝胶床内，继续用0.02mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液流洗，同时注意流出液量

（5）检测及收集 在黑色反应板凹孔内加2滴0.92mol/L磺基水杨酸，随时检查蛋白质 流出液是否含有蛋白质，①滴流出液1滴黑色反应板凹孔内接触到磺基水杨酸溶液，若出先白色混浊或沉淀，表示已有蛋白质流出（当凝胶床体积为5.5ml时，流出的液体量约为2ml就可能有蛋白质流出），立即收集流出的蛋白质溶液。②收集约12滴后，滴流出液1滴于预先加有1滴0.05mol/L(1%)BaCl2的黑色反应板凹孔内，一旦见出现白色沉淀（表示有SO42-），立即停止收集 收集的蛋白质溶液即可分别过DEAE纤维素柱，进行离子交换层析 (6)层析柱再生平衡 收集蛋白质溶液后的凝胶层析柱继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液流洗，用BaCl2液检测层析柱流出液，当流出液用BaCl2检查SO42-为阴性后，继续洗涤2~3ml。凝胶层析柱即可再生平衡，可再次使用 注意：a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时，不要使液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查硫酸根的氯化钡混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失。e.葡萄糖凝胶价钱昂贵，要回收再生避免损耗，严禁倒掉。

③ 球蛋白的纯化：过DEAE纤维素阴离子交换层析柱

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