2011分子生物学实验学生用 1

实验一植物基因组DNA提取

一、目的与原理

DNA是绝大多数生物(除少数RNA病毒外)储存、传递信息的生物大分子。为了进行DNA分子的体外重组，必须提取具有天然结构并具有一定长度的DNA大分子。提取分离DNA大分子，有酚法，氯仿一异丙醇法、酶法、SDS法、CTAB法等方法。主要操作都是围绕如何尽可能除尽结合蛋白质和多糖等杂质，本实验的目的是介绍CTAB法。

CTAB 法提取基因组DNA 原理：CTAB 是一种非离子去污剂。CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐（＞0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1－0.5 mM NaCl）下CTAB－核酸复合物就因浓度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB－核酸复合物再用75％酒精浸泡可洗脱掉CTAB。 二、实验材料、仪器和试剂 (一) 实验材料：

新鲜的植物叶片（水稻叶子），适量液氮 (二) 试剂：

(1)EDTA溶液(0.5M、pH=8.0、500 mL) (2)Tris·HCl溶液(1.0 M、pH=8.0、500 mL) (3)2％CTAB抽提液(pH=8.0、500 mL)

①称取CTAB粉末10.000 g，NaCl粉末40.908 g，PVP 405.000 g；②0.5M EDTA溶液20 mL；1.0M Tris·Cl溶液50 mL；③定溶至500 mL，121℃高压灭菌后，常温放置，待用。 (4)1×TE缓冲液(pH=8.0、200 mL) (5)RNase(10 mg/mL)

1.5 mL离心管(121℃高压灭菌)，加入0.015 g RNase，15μL 1M Tris·Cl溶0.001305 gNaCl(几小粒)，无菌ddH2O(重蒸水)定容至1.5 mL，100℃煮15min；低温放置，待用。(RNaseA，Sigma，M=487.5)。 （三）仪器

通风橱、天平、离心机、摇床、微量移液器、水浴锅、研钵 三、植物组DNA提取步骤

1.准备工作。各种试验工具的高压真空消毒灭菌：研钵(棒)、刮铲、尖底离心管(mL)、镊子、吸头(5000μL，1000μL，100～200μL，20μL，10μL)等。另外备有记录笔、纸、计时器、离心管架等以及-20℃预冷的70﹪乙醇、无水乙醇等。

2.提前打开水浴锅，加热至65℃，把2﹪CTAB放入，预热10 min以上。在以后的使用过程中，最好不再取出。

3.将幼叶放入液氮冷却的研钵内，再加一次液氮，冷却叶片，同时冷却刮铲。

4.充分研磨幼叶，用刮铲将研磨好的粉末加入1.5 mL的离心管中，加入600μL预热的CTAB溶液，漩涡混合器混均，然后放在65℃水浴锅水30min。

5.水浴时间到后，加入600μL氯仿：异戊醇(24:1;V:V)，轻轻颠倒数次，将离心放入冰中，直到一次离心所需样品处理完毕。

6.在4℃下，10000转，离心10 min。

7.将上清液转移到另一个1.5 mL的尖底离心管中。

8.加入和上清液等体积(或1.5倍体积)的预冷的无水乙醇和然后放入-20℃的冰箱中30～60 min。 9.在1.5 mL离心管上及盖上写好编号，把析出物直接轻轻拨到1.5 mL离心管中 10．70%乙醇900μL清洗2次，每次5～10 min。 11.然后用1000μL无水乙醇沉淀5～10 min。

12.37℃风干后，溶于650μL 1×TE缓冲液或者ddH2O中。

13.待溶解后，加入2μL RNase(10 mg/mL)，37℃放置至少1 h后。 四、注意事项

1.药品配制时，注意调节EDTA溶液和Tris·HCl溶液的PH值在6.0～8.0之间，但接近8.0时提取效果较好，且使用前溶液和设备要灭菌。

2.研磨叶片时一次性加满液氮，将叶片充分冷冻，然后快速研磨，直至粉末呈灰白色。

3.实验所有步骤要轻柔，以防止DNA分子破碎；加入提取液和抽提液时应将离心管倾斜，缓慢倒入。 4.氯仿：异戊醇抽提时，最后一次抽取上清液时应尽量避免将杂质混入。 5.加入预冷无水乙醇沉淀时，应缓慢倒置几次。

6.挑取DNA沉淀时，如DNA未成絮状，可适当短时间离心。 五、复习思考题

提取的DNA呈褐色的原因及解决办法？

实验二、琼脂糖凝胶电泳 一、目的与原理

溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB就插入DNA分子中形成荧光结合物。使发射的荧光增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将己知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。

在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒DNA样品用单一切点的酶酶切后，在已知分予量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知该样品的分子量大小。凝胶电泳不仅可以分离不同分子量的DNA，也可以鉴别分子量相同但构象不同的DNA分子。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA (SC)的一条链断裂，变成开环状(OC)分子，如果二条链发生断裂，就转变为线状分子。这三种构象的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型(SC)迁移速度最快，其次为线状(L)分子，最慢的为开环状(OC)分子。

提取到的质粒DNA样品中，如还有染色体DNA或RNA，在琼脂糖凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此分析样品的纯度。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动的，有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构象有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电何，在电场中间正极移动。在用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高了分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增强而提高分辨率。 二、实验材料、仪器和试剂 (一) 仪器

微波炉或水浴锅；稳压电泳议；凝胶成像系统；水平式电泳槽；水平仪；Eppendorf管架子; (二) 器皿：

(三) 实验样品 植物基因组DNA或PCR产物 (四)试剂

(1) 10毫克/毫升EB溶液

(2) 溴酚蓝指示剂溶液：0.2％溴酚盐、40％蔗糖

配制方法：0.2克溴酚盐，40 克蔗糖，加dd H20至100毫升 (3) TAE电泳缓冲液：

40m Tris-HCI (pH 8.0)，20mM NaAC， 2mM EDTA。

配制方法：吸取母液10倍的电泳缓冲液90毫升加dd H20毫升 (4) 琼脂糖。

四、琼脂糖凝胶电泳操作步骤

1．选择合适的水平式的电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。

2．选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端。使点样梳底部离电泳槽水平面的距离为0.5～1.0 mm。

3．制备琼脂糖凝胶：可按0.8～1.2％ 琼脂糖量制胶。本实验琼脂糖浓度为1%。

4．取少量凝胶溶液将电泳槽四周密封好，防止浇凝胶板时出现渗漏。然后在凝胶溶液中加EB(EB最终浓度为 0.5微克／毫升)，摇匀，待凝胶溶液冷却至45℃左右时，轻轻倒入电泳槽水平板上,除掉气泡。 5．待凝胶冷却凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，大电泳槽约需1200毫升，小电泳槽约180毫升。然后取出点样梳，保持点样孔的完好。

6．待测的DNA样品中加l／10体积的溴酚蓝指示剂。混匀后小心地进行点样，记录样品点样次序与点样量。 7．打开电源开关，DNA的迁移速度与电压成正比，与琼脂糖含量有关。最高电压不超过8V／cm (大电泳槽不超过120V, 小电泳槽不超过80V), 当琼脂糖浓度低于0.6％，电泳温度不能太高。

8．电泳时间看实验的具体要求而异。在电泳中途可用紫外灯直接观察，待DNA各条区带分开后，电泳结束。一般1小时即可，取电泳凝胶直接在手提式紫外检测仪(254nm) 或Chemi-smart 2000/3000型化学发光及凝胶成像系统下观察DNA谱带。 五、注意事项

1.琼脂糖电泳检测是分子生物学中基本检测手段，简便快速，但要注意实验操作安全，EB是DNA突变的诱变剂，可以嵌入DNA，使DNA发生突变，致癌。有累积效应，可以被皮肤吸收，不要直接接触，做实验的时候一定要带手套；并且要注意通过呼吸摄入，因此保证实验环境要通风，向凝胶中加入EB溶液时一定要注意凝胶温度，以防通过呼吸进入体内。

2.凝胶成像系统使用后，应及时清理仪器中残留的溶液，规范使用操作。 复习思考题

琼脂糖凝胶电泳除了可以检测DNA浓度和纯度外，在分子生物学试验中还有那些应用？ 实验三、聚合式酶联反应（PCR）扩增目的基因 一、目的与原理

PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。

PCR包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。

PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成：1. 变性：通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；2. 退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；3. 延伸：将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。以上三部为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。 二、实验材料、仪器和试剂 （一）材料：

植物基因组DNA（水稻） （二）试剂：

Taq酶，dd H20，Buffer，MgCl2 (25 mM)，引物，dNTP (10 mM)，液体石蜡 （三）仪器

PCR仪，离心机，微量移液枪 三、PCR基因扩增的操作方法 1．25μL反应体系的PCR

在0.5m1的离心管内，加入如下试剂：

dd H20 14.3微升 10×Buffer 2.5 微升 MgCl2 (25 mM) 1.5微升 dNTP (10 mM) 0.5微升 两种引物(1 μM) 各0.5 微升 DNA (50 ng) 5微升 Taq酶（5U/ μl ） 0.2微升 将试剂混匀，并覆盖75 μL的液体石蜡。 2．PCR反应程序

94℃预变性3min 1 94℃变性30s 2 51℃退火40s 3 72℃延伸40s 4

2-4 35个循环 72℃延伸8min 5 4℃保存 6 四、PCR操作中的注意事项

1．防止样品的污染。如果样品污染了，特别是扩增系统中混入了以前扩增的靶序列，将会与样品一样大量的扩增，使试验结果难以区别。

2．设对照试验。即除不加入模板DNA之外，试验的全过程与本实验完全相同的条件同步进行。扩增之后，对照试验不出现扩增电泳带，说明PCR操作过程中没有受到污染。

3．隔离操作。PCR扩增仪应与PCR操作场所分开。

4．试剂的配制，分装与保存都应在无PCR产物的环境中进行。引物的合成和纯化也要在无PCR产物的环境中进行。试剂分装的量及其浓度应与操作的用量、浓度基本一致，避免再次分装造成污染。 5．使用PCR专用的加样器。PCR专用的微量加样器不可兼作另用。EP管和Tip头也应用新品。移液时应慢吸慢吹出不能过快。

6．应细心操作。离心管开盖或上盖时都要非常小心，谨防溶液雾化或外溅。加液的离心管开盖前应先离心一下。 复习思考题

1. PCR操作防止污染，有哪些注意事项？

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