一株高产胞外蛋白酶菌株的选育

一株高产胞外蛋白酶菌株的选育

摘要：本实验采用的菌株来源于XXX大学动科院养牛场中的土壤，通过设置不同的培养基来筛选具有产胞

外蛋白酶能力的菌株。以酪素培养基平板产生的透明圈的直径/菌落直径的大小作为选择标记，经初筛选择出比值大的菌株为出发菌株。经紫外线诱变处理，培养获得两种未知高产胞外蛋白酶菌株。对其进行形态观察和生理生化鉴定，结果表明突变菌株w1的形态、生理生化特性符合芽孢杆菌属的特征，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。

关键字：细菌；胞外蛋白酶；筛选 ；鉴定

蛋白酶（Protease）是催化蛋白质水解的一类酶，微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌生产。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适应性宽，被广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌（如黑曲霉、根霉）；碱性蛋白酶生产菌（如地衣芽孢杆菌）；中性蛋白酶生产菌（如枯草芽孢杆菌）。本实验以养牛场土壤中筛选得到的蛋白酶生产菌株为出发菌株，采用紫外线照射诱变方法育种，以筛选得到高产胞外蛋白酶菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样：河北农业大学西校区养牛场中的土壤 1.1.2 培养基：（表中数据均为1000mL培养基中所含物质量） 筛选培养基： 酪素培养基 干酪素 1g 酵母膏 0.25g 甘油 1.25g dH2O 250mL K2HPO4 0.125g 琼脂 4g pH 8.0 营养培养基： 肉汤培养基 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g NaCl 5g H2O 1000mL pH 7.4 鉴别性培养基 淀粉培养基 蛋白胨 10g 明胶培养基 蛋白胨 5g

牛肉膏 13g 明胶 120g dH2O 1000mL pH 7.2—7.4 NaCl 5g 牛肉膏 5g 可溶性淀粉 2g dH2O 1000mL 琼脂 16g 葡萄糖发酵培养基 蛋白胨 10g 蛋白胨 5g NaCl 5g 葡萄糖 5g K2HPO4 0.2g K2PO4 2g dH2O 1000mL 1.6%溴甲酚紫 1—2mL dH2O 1000mL pH 7.2—7.4 pH 7.2—7.4 葡萄糖蛋白胨培养基 乳糖发酵培养基（已配好） 柠檬酸盐培养基（已配好） 半固体培养基（已配好） 三糖铁培养基（已配好）

1.2 方法

1.2.1 菌种的筛选

1.2.1.1 培养基的配置及灭菌

按上述方法分别配置肉汤培养基和酵素培养基，配置完成后放入高压灭菌锅于120℃下灭菌20min。取6只试管，分别加入9mL蒸馏水，向试管中加入10个玻璃珠，盖好胶塞，进行灭菌。

1.2.1.2 涂布分离

称取9g土样，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分震荡5~8min，静置10min。 取1mL上清液进行逐步稀释，分别稀释到浓度为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7。在酒精灯附近进行无菌操作，取10-5,10-6,10-7三个浓度梯度的稀释液各100μL于无菌的酪素培养基平板上进行涂布。每个浓度梯度下设置两个平板。待培养基凝固后贴好标签，在30℃的培养箱中倒置培养6d。 1.2.1.3 菌种的纯化

观察平板上菌落的形态特征，挑选出具有透明圈的菌落，用直尺测量其菌落直径C和透明圈直径H，从中选出两个H/C较大的菌落进行接种。

采用分区划线法在酪素平板上对菌株进行分离纯化。每次都从上一次划线的末端开始划起，保证菌落被逐步稀释，最后得到单个菌株。将纯化的菌株接种盛有肉汤培养基中的锥形瓶中，在37℃条件下振荡培养。 1.2.2 紫外线诱变育种 1.2.2.1 悬浮液的制备

用移液器吸取1mL肉汤培养基，加入到Ep管中，在12000r/min的条件下离心2min；去上清液，加入1mLH2O使其悬浮，再次离心并去上清，重复三次。将12个Ep管中的悬浮液加入平皿中混匀。 1.2.2.2 紫外诱变

取培养皿中溶液1mL，作为对照组，不做任何处理。其他在紫外光下分别照射30'' ,1'30'' 和2'。照射后分别取1mL按以下方法进行梯度稀释（此项操作在黑暗处进行）：

照射时间 浓度梯度

0： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8 3''： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6 1'： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6 1'30''： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6 2'： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6

稀释完成后，取后三个梯度各0.1mL进行涂布，每个梯度下设置两个平皿。之后置于

30℃的培养箱中培养7d。观察菌落中透明圈的大小，并计算出胞外蛋白酶菌株菌落数目。 1.2.3突变菌株的鉴定 1.2.3.1 生理生化鉴定

配置鉴别性培养基并进行高压灭菌处理。

根据各鉴别培养基对所选育的菌种进行生理生化鉴定，如下表所示：

菌种生理生化鉴定表 项目 接种 方法 测定 方法 乳糖 葡萄糖发酵 发酵 液体接种 滴加 2—3d MR MR 实验 淀粉 水解 柠檬 酸盐 明胶 液化 动力 实验 三糖铁实验 穿刺并划线 H2O2酶实验 挑一环菌苔滴加3% H2O2 划线接种 穿刺接种 冷藏30 分钟 明胶沿穿刺线逐渐分解 滴加 碘液 黄色（有或 反阳无气泡） 应性 结果 阴紫色（无气泡） 性 红色 变色菌 蓝色 扩散 生长 沿穿刺线生长 黄色（变黑有气泡 /气泡） 红色 葡萄糖、 蔗糖和 乳糖利用能力 无气泡 黄色 无色菌 草绿色 不分解 细菌利用柠檬酸盐产碱（pH>7.6） 鉴定原理 细菌发酵糖是否产酸产气（pH<5.2） 混合酸发酵（pH<4.2） 分解 淀粉 分解明胶 有无 鞭毛 有无H2O2酶 1.2.3.2 革兰氏染色

（1）取菌：用滴管在载玻片上滴一滴蒸馏水，用接种环取菌，涂抹均匀； （2）固定：将载玻片放于火焰上方（注意不要太近），使其干燥； （3）初染：结晶紫染色1min； （4）水洗：蒸馏水冲洗；

（5）碘液媒染：滴加2滴碘液，染色1min； （6）水洗；

（7）脱色：95%乙醇脱色30s； （8）复染：番红染色3min; （9）水洗；

（10）干燥：自然干燥或放于酒精灯附近； （11）镜检

2 结果与分析

2.1菌株的分离与筛选

菌落透明圈直径与菌落直径比值表 1号 2号 稀释倍数 透明圈直径H 10-7 10-7 10-6 10-5 1.6 1.1 1.1 1.9 菌落直径C 0.4 0.5 0.4 0.3 H/C比值 4 2.2 2.75 6.3 经比较选择H/C比值大的为出发菌株: 1号 2号 10-7 10-5 1.6 1.9 0.4 0.3 4 6.3

1号出发菌株 2号出发菌株 2.2诱变育种后菌株的致死率

诱变育种后菌株的致死率与H/C表 对照0秒 30秒 1分 1分30秒 2分 菌落数 1.85×108 2×108 1.8×105 8.6×107 2×105 致死率 0 0.999 0.027 0.535 0.999 H/mm 13 17 15.6 9.25 11.0 C/mm 1.6 2.1 2.3 2.05 2.0 H/C 8.125 8.095 6.783 4.512 5.500

致死率曲线

2.3菌种的鉴定

2.3.1菌种的细胞形态 经革兰氏染色后，在显微镜下对其形态特征进行观察：大肠杆菌此菌为两端钝圆的短小杆菌, 无芽孢、革兰氏阳性;w1为杆状，有芽孢、革兰氏阴性；金黄色葡萄球菌为球状、无芽胞、革兰氏染色阳性；w2为杆状，无芽孢、革兰氏阴性。 2.3.2生理生化特征鉴定

生理生化鉴定结果 葡糖白培基 + - + - 萄蛋胨养三糖铁培养基 乳糖柠檬发酵酸钠培养培养基 基 + - - - - - - 明胶液化培养基 - - - - 动力培养基 葡萄糖发酵培养基 + - - 淀粉水解培养基 - + - 大肠杆菌 W1 金黄色葡萄球菌 W2 +↑ + - - - + - +（-） + +（-） - 注：阳性+ 阳性有气体生成+↑ 阳性无气体生成+（-） 阴性-

3 讨论

本实验从XXX大学西校区养牛场的土样中筛选两筛选得到的蛋白酶产生菌株为出发菌株，采用紫外线照射育种，得到高产胞外蛋白酶菌株。并对其进行形态和生理生化确定为：突变菌株w1为芽孢杆菌属，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。本实验旨在了解微生物菌株选育的过程，由于过程不是很严密，因此不能准确鉴定到种。

在分离菌种的过程中，本实验遵循的原理是能分泌胞外蛋白酶的菌株可在酪素平板上形成肉眼可见的蛋白水解圈, 在对特定产酶菌株进行诱变时, 由于条件相对统一, 比较选择平板上形成的蛋白水解圈的大小是对正变菌株筛选的有效手段。但因为蛋白水解圈是非选择性标记, 筛选工作量十分庞大, 人们也尝试采用其它易于选择的标记物如营养缺陷型、抗生

素抗性等作为非直接选择措施, 以淘汰大量的没有发生突变的野生菌株。

诱变育种是提高产酶力的重要手段，随着基因工程的普及，我国在纤维素酶和碱性蛋白酶的研究上也取得了很大成效。近几年来，高通量筛选技术的确立使筛选效率得以大大提高。诱变育种存在的主要问题是有益突变频率仍然较低，变异的方向和性质尚难控制。因此提高诱变效率，迅速鉴定和筛选突变体以及探索定向诱变的途径，是当前研究的重要课题。 参考文献：

赵丛.N+注入诱变选育中蛋白酶催化高产菌株及其发酵条件的研究.工业微生物.2008（3） 胡学智.蛋白酶生产和应用的进展.工业微生物. 2008（4）

陈向东, 彭珍荣, 沈萍.碱性蛋白酶高产菌株的选育.武汉大学学报.2003,12

伍欣, 张晓昱, 武龙.产碱性蛋白酶嗜碱芽孢杆菌的筛选及其研究.微生物学杂志.2005,3 薛林贵,冯清平.紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究.兰州大学学报 张晶,王战勇,韩玉,等.碱性蛋白酶产生菌种的筛选及鉴定.化学与生物工程.2006

鲜莹,谢从新,何旭刚,等.产胞外蛋白酶菌种的筛选及环境因素对其产酶活性的影响.淡水渔业,2010，3

素抗性等作为非直接选择措施, 以淘汰大量的没有发生突变的野生菌株。

诱变育种是提高产酶力的重要手段，随着基因工程的普及，我国在纤维素酶和碱性蛋白酶的研究上也取得了很大成效。近几年来，高通量筛选技术的确立使筛选效率得以大大提高。诱变育种存在的主要问题是有益突变频率仍然较低，变异的方向和性质尚难控制。因此提高诱变效率，迅速鉴定和筛选突变体以及探索定向诱变的途径，是当前研究的重要课题。 参考文献：

赵丛.N+注入诱变选育中蛋白酶催化高产菌株及其发酵条件的研究.工业微生物.2008（3） 胡学智.蛋白酶生产和应用的进展.工业微生物. 2008（4）

陈向东, 彭珍荣, 沈萍.碱性蛋白酶高产菌株的选育.武汉大学学报.2003,12

伍欣, 张晓昱, 武龙.产碱性蛋白酶嗜碱芽孢杆菌的筛选及其研究.微生物学杂志.2005,3 薛林贵,冯清平.紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究.兰州大学学报 张晶,王战勇,韩玉,等.碱性蛋白酶产生菌种的筛选及鉴定.化学与生物工程.2006

鲜莹,谢从新,何旭刚,等.产胞外蛋白酶菌种的筛选及环境因素对其产酶活性的影响.淡水渔业,2010，3

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