转染实验方法（全）

转染实验方案

1. LB培养基的配制：500ml（5皿+2锥形瓶）

准备：500ml玻璃瓶1个，250ml玻璃瓶2个，500ml容量瓶一个，平皿5个 称取：酵母浸提液 5.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 10.0g 实验操作：

混合后加去离子水（或注射用水）水400ml，待充分溶解后加水定容至500ml，取100ml做固体培养基用装入A瓶，余下装入500ml B瓶中（400ml/瓶） 称取1.5g琼脂粉加入A瓶中

另取一瓶（C瓶）接100ml水（稀释氨苄西林用） 将以上3瓶高压灭菌：121°C , 30min 取氨苄西林一支：规格：1g/支

加水于安瓶中溶解后，移入C瓶中，浓度：10mg/ml 按照50μg/ml氨苄西林的浓度加到A B C三瓶中

A瓶：0.5ml（即为LB固体培养基）——松弛型100μg/ml,严紧型50μg/ml B瓶：2ml（即为LB液体培养基）

将A瓶按20ml/平皿，分别移到5个平皿中，待冷却后即为固体培养基。 用膜封口放入4℃保存。

2. 感受态转化与培养（TOP10）

准备：37℃摇床，37℃烘箱，10cm培养皿（LB琼脂凝胶+氨苄=50 ml LB+0.75 g琼脂+50μl氨苄），冰盒，42℃水浴,无菌牙签，氨苄溶液40~60 μg/ml

实验前：水浴调至42℃，SOC培养液放至室温，LB加氨苄培养皿于37度烘箱中加热半小时

实验操作：

1) 将质粒短暂离心后迅速放入冰浴中 2) 冰上解冻TOP10

3) 吸取1到10μl质粒加入TOP10中，轻轻敲打混匀（切记不可用移液枪混匀）。剩

余的质粒可储存于-20℃中

4) 冰上孵育TOP10离心管30min。 5) 42℃水浴30s（精确），不要晃动离心管

6) 迅速转入冰浴2-3min，加入250μl预热的soc溶液，保证过程无菌 7) 37℃摇床水平225 rpm摇1h

8) 吸取200μl用三角耙铺板（最好同时做不同加入量的2个皿，LA培养皿预热），

剩余溶液储存于4 ℃

9) 正置20min，倒置37 ℃培养过夜

10) 第二天取出平皿，观察菌落，选择较大菌落，用牙签挑取菌落放入对应的试管中，

加入15 μl氨苄西林（C瓶母液），最后加3ml LB液体培养基，试管放架子上37 ℃摇4-6 h（预培养）

11) 按照培养基：菌液=200ml：2ml进行转菌，剩余菌液放入EP管中-20℃保存（复苏

加时100μl菌液预培养）。37℃摇床过夜（约12h），收集菌体。

3. 质粒提取（PureLinkHiPure Plasmid Filter Midiprep Kit中提试剂盒）

准备：250 ml锥形瓶、50 ml（4）/15 ml（1）离心管、异丙醇、70%乙醇、胶头滴管

实验前：将柱子夹持器安装好，放入锥形瓶口。根据瓶子标签说明加入适量RNase到重

悬液R3中，充分混匀并做标记RNase A 100μg/ml，保存于4 ℃。检查溶菌液L7是否有沉淀，若有，将其短暂加热到37 ℃溶解

实验操作：

1) 加入15 ml EQ1溶液平衡柱子，直到溶液排完

2) 在柱子平衡期间收集细胞，4000×g离心10min，倒掉培养液（50 ml离心管分4管离心）

3) 加入10 mlR3溶液（含RNase A）重悬细胞，轻摇离心管直到重悬均匀，胶头滴管吸取菌液到另外一个离心管重复以上操作直到4管全部溶于10ml R3溶液中。

4) 加入10 ml L7溶液，盖上管盖，轻轻上下颠倒直到混匀。室温孵育5 min（不能超过5min）

5) 加入10 ml沉淀液N3溶液，快速颠倒直到彻底混匀

6) 上柱，全部液体转移到过滤柱里过滤（10~15 min），直到滤液小于1滴/10s即可，加入10 ml洗涤液W8溶液洗涤柱子，弃去滤液

7) 立即弃去内层滤柱，加入20ml W8溶液洗涤柱子，直至溶液全部滤过排干，弃去滤液

8) 在柱子下放置一个无菌的15 ml离心管，加入5 ml洗脱液E4溶液，直至溶液全部洗脱，不可强制让剩余溶液流出。弃去柱子 9) 加入3.5 ml异丙醇，混匀，室温孵育2 min，>12000×g离心30 min（4℃），小心地弃去上清液 10) 加入3 ml 70 %乙醇，重悬DNA沉淀 11) >12000×g离心5 min（4℃），小心地弃去上清液 12) 大约10 min风干DNA 13) 加入100μl TE溶液重悬DNA（若有沉淀，高速室温离心1 min，上清转移至另外一个离心管，不影响质量）

14) 分装质粒，储藏于-20℃中 15) 测浓度：取3 μl含质粒TE溶液加入到300 μl去离子水中，将稀释溶液加入到测定质粒专用的96孔板中，所质粒浓度（μg/μl）=（测得吸光度 - 空白板）×5，A260/A280>1.80则杂质少，可用于下一步实验

4. 细胞转染（jetPRIME-Polyplus）

准备：带爬片24孔板（60%~80%密度细胞，0.5ml种植液，提前一天养）、1.5 ml EP管 实验操作：

1) 用50 μl jetPRIME buffer稀释0.25 μg DNA，涡旋10 s，离心沉淀 2) 加入0.5 μl jetPRIME reagent, 涡旋10 s，离心，室温孵育10 min 3) 往含血清培养液的细胞中加入孵育好的混合液 4) 4 h后更换新培养液，孵育24 h后做后续实验

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