Inoue法制备化学感受态细胞及注意事项
更新时间:2024-01-19 21:12:01 阅读量: 教育文库 文档下载
- inoue制备感受态原理推荐度:
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1试剂的配制
⑴ 5mol/L的KOH: 10mL
称取KOH(南京化学试剂有限公司)2.8055g 加无菌的Mill-Q水至10mL ⑵ 0.5mol/L的PIPES pH:6.7
称取PIPES固体(进口Sigma)3.775g 加无菌的Mill-Q水至25 mL 用5mol/L的KOH调pH至6.7 并过滤除菌。 ⑶ Inoue转化缓冲液的配制:500mL
试剂 需要量/500mL 终浓度 MnCl2.4H2O(国药集团化学试剂有限公司) 5.44g 55mmol/L CaCl2.2H2O (AMRESCO) 1.1g 15 mmol/L KCl(南京化学试剂一厂) 9.325g 250 mmol/L PIPES(0.5mol/L, pH:6.7) 10mL 10 mmol/L H2O 补水至500 mL 过滤除菌 4℃冰箱存放备用
2 .DH5a化学感受态细胞的制备
⑴第一天 划平板:DH5a从-80℃冰箱冻存管划线至LB平板,37℃培养箱培养,约12hrs. ⑵ 第二天 接种子瓶:从平板挑单clone至种子瓶20mLLB Media中,37℃,220rpm摇床过夜.
⑶ 第三天 接子瓶:从种子瓶吸取一毫升DH5a种子菌液至子瓶中,25℃,220rpm摇床培养,约6~7hrs.
⑷ 测OD:待OD值约为0.6时开始制作(离心机事先预冷)
① ② ③ ④
将培养好的菌液转移至灭菌的50mL离心管中,置于冰上10min至菌液冰冷.
4℃,2500g离心10min.
弃上清,将离心管倒扣于滤纸上吸干剩余液体.
向50mL离心管中加约16mL的Inoue转化缓冲液,重悬细菌沉淀(轻轻
重悬,不要用振荡器或吹吸混匀)。 ⑤ 4℃,2500g离心10min。
⑥ 弃上清,将离心管倒扣于滤纸上吸干剩余液体. ⑦ 每管各加入5mLInoue缓冲液,轻轻悬浮。 ⑧ 每管各加入375uLDMSO,混匀,冰上10min. ⑨ 每管110uL,快速分装并冷冻。-80℃,备用。
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