CRISPR系统
更新时间:2023-12-22 12:30:01 阅读量: 教育文库 文档下载
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最近几年基因编辑技术异常火爆,CRISPR/Cas9技术面世以后,弥补了传统基因编辑技术的诸多不足,使得基因的“任意编辑”变得越来越容易。也因此,CRISPR/Cas9技术当仁不让的成为基因编辑技术的“王牌”,大有一副取而代之的势头。所以这里就给大家简单介绍一下CRISPR/Cas9的技术原理! 一、CRISPR/Cas9系统的构成
CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中,CRISPR系统共分成3类,其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可,这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前,来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,使DNA双链断裂。 研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具,又进行了优化和改造。Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下,将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。通过这种简化,CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素:Cas9蛋白和sgRNA(single guide RNA)。因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。
二、CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制
CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割,造成DNA双链断裂(DSB, double strand break)。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制,主要包括两种途径:
一是低保真性的非同源末端连接途径(NHEJ,Non-homologous end joining),此修复机制非常容易发生错误,导致修复后发生碱基的缺失或插入(Indel),从而造成移码突变,最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变,从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现,使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物,且已成功应用于小鼠[5]、大鼠[6]、猪[7]、灵长类[8]、果蝇[9]等等。
第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复(HR, homology-directedrepair),
这种基于同源重组的修复机制保真性高,但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下,靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍[10]。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑,如:条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。
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