第十三章 紫外可见光谱分析 - 图文

第十三章 紫外可见光谱分析

13.1概述

紫外-可见光谱法（ultraviolet-visible molecular absorption spectrometry,UV-VIS）是研究在200至800nm光区内的分子吸收光谱的一种方法。它广泛地用于无机和有机质的定性和定量测定，灵敏度和选择性较好。紫外-可见光谱法使用的仪器设备简单，易于操作。

分子吸收紫外-可见光获得的能量足以使价电子发生跃迁，因此，由价电子跃迁产生的分子吸收光谱称为紫外-可见光谱或电子光谱。紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，所以又称为电子光谱。由于电子跃迁的同时，伴随着振动能级和转动能级的跃迁，故紫外光谱为带状光谱。紫外吸收光谱的波长范围是10-400nm(纳米), 其中10-200nm 为远紫外区（这种波长的光能够被空气中的氮、氧、二氧化碳和水所吸收，因此只能在真空中进行研究，故这个区域的吸收光谱称真空紫外），200-400nm为近紫外区, 一般的紫外光谱是指近紫外区。波长在400～800nm范围的称为可见光谱。常用的分光光度计一般包括紫外及可见两部分，波长在200～800nm（或200～1000nm）。

紫外-可见分光光度法有如下特点：①仪器和操作简单、费用成本低、速度快。②灵敏度高。最低检出浓度可达 10-6g/mL。③精密度和准确度较高。其相对误差可达到1%～2%。这满足了对微量组分的测定要求。④选择性较好。⑤用途广泛。广泛用于化工、环境等方面。

紫外-可见光谱不仅可以进行定量，定性及结构分析，还能进行配合物的组分及稳定常数、官能团鉴定、相对分子质量测定等等 13.2 紫外可见光谱基本原理

紫外可见吸收光谱遵从朗伯－比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即

A= ΚC l （13-1）

式中：κ-吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关；C-吸光物质浓度；l-为透光液层厚度。

朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。 13.2.1 理论基础

紫外可见吸收研究的是分子内原子在平衡位置附近的振动、分子绕其重心的转动和价电子运动。故分子的能量E等于以上三项之和：

E?Ee?Ev?Er （13-2）

式中，Ee、Ev、Er分别代表电子能、振动能和转动能。

分子从外界吸收能量后，就引起分子能级的跃迁，即从基态能级跃迁到激发态能级。分子吸收能量具有量子化的特征：

?E?E2?E1?h??hc? （13-3）

紫外吸收光谱是由于分子中的电子跃迁产生的。按分子轨道理论，在有机化合物分子中这种吸收光谱取决于分子中成键电子的种类、电子分布情况，根据其性质不同可分为3种电子：①形成单键的σ电子 ；②形成不饱和键的π电子 ；③氧、氮、硫、卤素等杂原子上的

未成键的n电子。如图13-1所示。

图13-1 基团中的σ，π，n成键电子

当它们吸收一定能量ΔE后，将跃迁到较高的能级，占据反键轨道。分子内部结构与这种特定的跃迁是有着密切关系的，使得分子轨道分为成键σ轨道、反键σ*轨道、成键π轨道、反键 π* 轨道和n轨道，其能量由低到高的顺序为：σ<π

图13-2 分子轨道中的能量跃迁示意图

因而将这些跃迁分为：

（1）N→V 跃迁：由基态轨道跃迁到反键轨道（包括σ→σ*跃迁和π→π*跃迁）； （2）N→Q跃迁：分子中未成键n电子激发跃迁到反键轨道（包括n→σ*跃迁和n→π*跃迁）；

（3）N→R跃迁：σ 键电子逐步激发到各个高能级上，最后脱离分子，使分子成为分子离子的跃迁（光致电离）；

（4）电荷迁移跃迁：当分子形成配合物或分子内的两个大?体系相互接近时，外来辐射照射后，电荷可以由一部分转移到另一部分，而产生电荷转移吸收光谱。

因此，化合物价电子可能产生的主要跃迁为σ→σ*、n→σ*、n→π*和π→π*。各种跃迁所需能量大小为：

σ→σ*＞n→σ*≥π→π*＞n→π*

n? ? *跃迁: 当不饱和键上连有杂原子（如羰基、硝基）时，杂原子上的n电子能跃迁到π*轨道。n→π*跃迁是四种跃迁中所需能量最小的，它所对应的吸收带位于200～400nm的近紫外区。如果带杂原子的双键基团与其它双键基团形成共轭体系，其n→π*跃迁产生的吸收带将红移，例如丙酮的n→π*跃迁在276nm，π→π*跃迁在166nm，而4-甲基-3-戊烯酮的两个相应吸收带分别红移至313和235nm。但是n? ? *跃迁是禁阻跃迁，所以吸收强度很

弱。

? ? ? *跃迁: 不饱和键中的π电子吸收能量跃迁到π*反键轨道。π→π*跃迁所需能量较n? ? *跃迁的大，吸收峰波长较小。孤立双键的π→π*跃迁产生的吸收带位于160～180nm，仍在远紫外区。但在共轭双键体系中，吸收带向长波方向移动（红移）。共轭体系愈大，π→π*跃迁产生的吸收带波长愈长。例如乙烯的吸收带位于162nm，丁二烯为217nm，1，3，5－己三烯的吸收带红移至258nm。这种因共轭体系增大而引起的吸收谱带红移是因为处于共轭状态下的几个π轨道会重新组合，使得成键电子从最高占有轨道到最低空轨道之间的跃迁能量大大降低。

n ? ?*跃迁: 是氧、氮、硫、卤素等杂原子的未成键n电子向σ反键轨道跃迁当分子中含有－NH2 、－OH、－SR、－X等基团时，就能发生这种跃迁。n电子的n→σ*跃迁所需能量较大，偏于远紫外区，一般出现在200nm附近，受杂原子性质的影响较大。

?? ?*跃迁: 是单键中的σ电子在σ成键和反键轨道间的跃迁。因σ和σ*之间的能级差最大，所以σ→σ*跃迁需要较高的能量，相应的激发光波长较短，在150～160nm范围，落在远紫外光区域，超出了一般紫外分光光度计的检测范围。

电荷迁移跃迁: 用光照射化合物时，电子从给予体向与接受体相联系的轨道上的跃迁称为电荷迁移跃迁。这种跃迁谱带较宽，吸收强度大。

无机化合物产生的跃迁主要为电荷迁移跃迁和配位场跃迁。

一般的紫外光谱是指近紫外区（200-400nm），就只能观察 n? ? *和? ? ? *跃迁，也就是说只适用于分析分子中具有不饱和结构的化合物。如图13-3所示。

图13-3 电子跃迁所处的波长范围及强度

13.2.2 紫外光谱中常用的名词术语

（1）发色团（chromophore）：也称生色团，是指在一个分子中产生紫外吸收带的基团，一般为带有π电子的基团。有机化合物中常见的生色团有：羰基、硝基、双键、三键以及芳环等。发色团的结构不同，电子跃迁类型也不同，通常为n→ π *、π→π*跃迁，最大吸收波长大于210nm。

（2）助色团（auxochrome）：有些基团，本身不是发色团，但当它们与发色团相连时，可以使含有发色团的有机物的颜色加深, 这类基团称为助色团。助色团通常是带有孤电子对的原子或原子团，如：－OH、－ NH2、－NR2、－OR、－SH、－SR、－X（卤素）等。在这些助色团中，由于具有孤电子对的原子或原子团与发色团的π键相连，可以发生p－π

共轭效应，结果使电子的活动范围增大，容易被激发，使 π→π*跃迁吸收带向长波方向移动，即红移。

（3）红移（red shift）：也称向长波移动（bathochromic shift），当有机物的结构发生变化（如取代基的变更）或受到溶剂效应 的影响时，其吸收带的最大吸收波长（λmax）向长波方向移动的效应。

（4）蓝移（blue shift）： 也称向短波移动（hypsochromic shift），与红移相反的效应，即由于某些因素的影响使得吸收带的最大吸收波长（λmax）向短波方向移动的效应。

（5）增色效应（hyperchromic effect）：或称浓色效应，使吸收带的吸收强度增加的效应。

（6）减色效应（hypochromic effect）：或称浅色效应，使吸收带的吸收强度减小的效应。

（7）强带：在紫外光谱中，凡摩尔吸光系数大于104的吸收带称为强带。产生这种吸收带的电子跃迁往往是允许跃迁。

（8）弱带：凡摩尔吸光系数小于1000的吸收带称为弱带。产生这种吸收带的电子跃迁往往是禁阻跃迁。

（9）末端吸收（end absorption）： 指吸收曲线随波长变短而强度增大，直至仪器测量的极限（190nm），在该极限处测出的吸极为末端吸收。

（10）肩峰：指吸收曲线的峰的吸收稍微增加或降低，或者峰在下降或上升处有停顿，主要是因为化合物不纯。

13.2.3 紫外吸收光谱与分子结构的关系

根据电子跃迁讨论有机化合物中较为重要的一些紫外吸收光谱，由此可以看到紫外吸收光谱与分子结构的关系。

1.饱和有机化合物

饱和碳氢有机化合物只有σ键电子，只产生σ→σ*跃迁，所需能量最大，吸收带在远紫外区。

当饱和单键碳氢化合物中的H被含孤对电子的O、N、X、S等杂原子取代时，产生能量低于σ→σ*跃迁的n→σ*跃迁，吸收波长向长波分析移动。所以饱和有机化合物中含有－NH2、－NR2、－OH、－OR、－SR、－Cl、－Br、－I等助色团时，有红移现象。

当生色团为P－π共轭系统时，产生n→π*跃迁的R带吸收。R带所需能量最小，是禁阻跃迁，因而吸收强度最小，波长最长，甚至进入可见光区。

2.不饱和脂肪族有机化合物

不饱和碳氢化合物含有π键电子，产生π→π*跃迁，吸收波长在175～200nm范围。当化合物中存在－NH2、－NR2、－OR、－SR、－Cl、－CH3等助色团时，也有红移现象，并使吸收强度增大。当不饱和脂肪族有机化合物含有共轭双键时，由于形成大π键，产生K带吸收，红移明显，并且吸收强度很大（ε≥104）；共轭双键越多，红移越显著，溶液甚至产生颜色，同时吸收强度也越大。

3.芳香族化合物

苯环结构中有三个乙烯的环状共轭体系，在185nm和204nm产生两个很强的E带吸收；在254nm产生中等强度的B带吸收的精细结构。若苯环含有取代基，B带吸收的精细结构消失，但吸收强度增加，并发生红移。助色团使E带吸收红移，生色团使E带吸收与K带吸收合

并，并红移。

13.2.4 紫外光谱中的几种吸收带

吸收带(absorption band): 在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。

1.K带

当分子中两个或两个以上双键共轭时，π→π*跃迁能量降低， 吸收波长红移，共轭烯烃分子如1，3-丁二烯的这类吸收在光谱学上称为K带（取自德文：共轭谱带， konjuierte）。K带出现的区域 为210～250nm，εmax>104（lgεmax>4），随着共轭链的增长，吸 收峰红移，并且 吸收强度增加。共轭烯烃的K带不受溶剂极性的影 响，而不饱和醛酮的K带 吸收随溶剂极性的增大而红移。

2.B带和E带

芳香族化合物的π→π*跃迁，在光谱学上称为B 带（benzenoid band，苯型谱带）和E带（ethylenic band，乙烯型谱带），是芳香族化合物的特征吸收。所谓E带指在封闭的共轭的体系中（如芳环），因π→π*跃迁所产生的较强或强的吸收谱带，E带又分为E1和E2带，两者的强度不同，E1带的摩尔吸光系数ε大于104(lgε>4)，吸收出现在184nm；而E2带的摩尔吸光系数ε约为103，吸收峰在204nm。两种跃迁均为允许跃迁。B带指在共轭的封闭体系（芳烃）中，由π→π*跃迁产生的强度较弱的吸收谱带，苯B带的摩尔吸光系数ε约为200，吸收峰出现在230～270nm之间，中心在256nm,在非极性溶剂中芳烃的B带为 一具有精细结构的宽峰，但在极性溶剂中精细结构消失。当苯环上有发色基团取代并和苯环共轭时，E带和B带均发生红移，此时的E2带又称为K带。特点：为芳香族化合物的π→π*跃迁，B带：峰弱，吸收波长长；E带：峰强，吸收波长短。

3.R带

指连有杂原子的不饱和化合物（如羰基、碳氮双键等）中杂原子上的n电子跃迁到π*轨道，这种跃迁在光谱学上称为R带（取自德文：基团型，radikalartig），跃迁所需能量比n→σ*的小，一般在近紫外或可见光区有吸收，其特点是在270～350nm之间，ε值较小，通常在100以内，为弱带，该跃迁为禁阻跃迁。随着溶剂极性的增加，吸收波长向短波方向移动（蓝移）。特点：为n→π*跃迁，吸收波长长，峰弱。

13.3 仪器基本构成及其工作原理

13.3.1 仪器基本构成

紫外可见分光光度计的基本结构如下图13-4所示：

光源→单色器→吸收池→检测器→信息处理与显示系统

↑ 样品

图13-4 紫外可见分光光度仪的基本结构

1.紫外可见光光源

对光源的基本要求是应在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射，有足够的辐射

强度和良好的稳定性，而且辐射能量随波长的变化应尽可能小。

在紫外可见分光光度计中有热辐射光源和气体放电光源两类光源。热辐射光源用于可见光区；如钨丝灯、卤钨灯和汞灯，可用范围在340-2500nm。气体放电光源用于紫外光区，如氢灯、氘灯和氙灯，可在160-375nm范围内产生连续光源。氘灯一般是紫外光区应用最广泛的一种光源。

2.单色器系统

单色器是一个完整的色散系统，并组成仪器的核心部分，作用是将光源发出的白光色散成不同波长的单色光，并从出射狭缝中导出照于样品上，其决定着仪器的主要光学特性和工作特性。仪器除了棱镜或光栅色散元件外，还有入射、出射狭缝及一组反射镜。分别选用不同的单色器如棱镜或光栅分光，双联，滤色片分光等等。

1）滤光片 在仪器中，滤光片的作用通常是用来消除单色器的杂散光。其特性可以用最大透光波长和谱带半宽度来表征它。它是最简单、最廉价的单色装置。但基于单色性不理想，大大限制了测定精度。滤光片分为：通带滤光、中性滤光、干涉滤光、截止滤光以及标准滤光片五种。

2）单色器

从宽波长的光源辐射中分出单一波长的光学装置叫单色器。由色散元件、入射狭缝、出射狭缝、和准直镜等部分组成。单色器质量的优劣决定于色散元件的质量。

(1) 狭缝

狭缝是由具有很锐刀口的两片金属片精密加工制成的，包括入射和出射狭缝，是单色器的重要组成部分之一，关系到分辨率的优劣，当光源的光进入色散系统前，要先经过一个入射狭缝，使光称为一条细的光束照射到准直镜上，反射后成为平行光投射到棱镜或光栅上进行色散。出口狭缝出来的光并不是某一单波长的光，狭缝越宽所包含的光波越多，狭缝月越窄杂散光的影响越小，但是光的亮度也越弱。

(2) 棱镜

棱镜是从紫外到中红外区的比较合适的色散元件，其光谱纯度主要决定于棱镜的色散特性和光学设计。紫外范围内通常采用硅。可见范围内常用光学玻璃代之。本生(Bunsen)和利特罗(Littrow)是常用两种形式的棱镜单色器，棱镜的主要缺点是色散波长的非线性分布。

(3) 光栅

光栅分透射光栅和反射光栅，是用于紫外、可见、近红外范围内十分重要且应用范围很广的色散元件。透射光栅的母光栅的生产是需要很精密的装置，要在一块透明材料或玻璃上刻一系列平行的紧紧相靠的凹槽，较贵。故而用较便宜的复制光栅代替，性能上虽次于母光栅，但能满足应用。反射光栅则是喷涂铝薄膜于复制光栅表面制成。光栅的单位长度刻线越多，分辨率越高，色散也越大。另外在闪耀光栅中，闪耀波长内光栅有最大能量输出。由于光栅有次级光谱干扰的缺点，因此常配虑光片以去除杂散光的影响。光栅单色器的排列方式尽管有几种，但通常采用的一种是埃伯特1889年发明的使波长通过选择旋转光栅来实现的排列方式。因其昂贵，现代仪器常采用采尼(Czerny)和特纳(Turner) ，一种结构紧凑的用两个小球面镜来代替大而昂贵的埃伯特球面。

3.吸收池

吸收池又称比色皿或比色杯，紫外可见分光光度计常用的吸收池有石英和玻璃两制材料制成。石英吸收池可用于紫外光区和可见光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。

吸收池的种类很多，其光径可在0.1~10cm之间，常用的石英吸收池光程一般为1cm，玻璃吸收池有0.5cm、1cm、2cm、5cm等多种。

同一台分光光度计上的比色杯，其透光度应一致，在同一波长和相同溶液下，比色杯间的透光度误差应小于0.5%，使用时应对比色杯进行校准。

4.检测器

检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计常用的检测器是光电接收元件，有光电倍增管（利用外光电效应与多级二次发射体相结合而制成的光电器件，可达108倍的放大倍数）、光敏电阻和光电池作为检测器。

5.信息处理与显示系统

显示系统是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表获取信息并显示出来的装置。

常用的信号显示装置有直读检流计、微安表、电位调节指零装置，以及自动记录和数字数字显示器和计算机等。检流计和微安表可显示透光度（T%）和吸光度（A）。数字显示器可显示T%、A和C（浓度）。 通过计算机与分光光度计相联，光谱数据可立即显示，绘制谱图，而且还可进行多种类型的数据处理。 13.3.2 仪器的工作原理

分子中的电子跃迁需要的能量在 1.6Χ10-19 ~ 3.2Χ10-18 J 之间，其对应的吸收光的波长范围大部分处于紫外和可见光区域，通常将分子在这一区域的吸收光谱称为电子光谱。不同的分子中的电子跃迁需要的能量不一样，吸收光谱也就不同。为了测量一种物质的吸收光谱，用经过分光后的不同波长的光依次透过该物质，这种物质可以是液体，也可以是固体或气体，但大多数情况都是具有一定浓度的溶液。通过测量物质的吸光度（物质对不同波长光的吸收程度），再以吸光度为纵坐标，波长为横坐标作图，就能得到该物质在该波长范围内的吸收曲线。这种体现了物质对不同波长的光度吸收能力的曲线，称为吸收光谱。

根据物质对光的吸收程度的不同来确定未知液体的物质浓度含量，一般采用标准曲线法，也有采用标准加入法的。即在紫外可见光区的一个特定的波长，利用朗伯比尔定律可进行定量分析。

紫外可见分光光谱仪的光度系统分为单光束系统（图13-5）和双光束系统两种（图13-6）。 现代的自动分光光度仪多采用双光束法来实现比较测量。用两种不同波长的单色光束交替照射到样品溶液上，不需要使用残壁溶液，测得的是样品在两种波长下得吸光度之差。双光束光度系统大大提高了测定准确度，可完全扣除背景；可用于微量组分的测定；可用于混浊液和多组分混合物的定量测定。

双波长分光光度计具有两个检测器，更适合应用于双波长光谱分析方法。双单色器可明显减少杂散光，提高仪器的分辨能力。

图13-5 单光束的光路图 （721型分光光度计光学系统示意图）

1－光源；2，9－聚光透镜；3－色散元件（棱镜）； 4－准直镜；5，12－保护玻璃；6－狭缝；

7－反射镜； 8－光栅；10－吸收池；11－光门；13－光电管

图13-6 双光束的光路图

1，8，9，12，15，16，20－凹面反射镜；2－钨灯；3－灯交换平面镜；4－氘灯；

5－入口狭缝；6，17－平面反射镜色散元件（棱镜）；10，11－出口狭缝； 13－调制板；14－斩光器；18－参比池；19－样品池；21－光电倍增管

13.4 实验技术

13.4.1 结构分析

被测物质的溶液浓度不宜过高，一般为mg/L级。分析是的注意事项如下：

（1）在紫外区测定必须配对使用洁净的石英吸收池，量瓶、移液管均应校正、洗净后使用。

（2）应正确取吸收池，装盛样品以池体的2/3～3/4为度，手指应拿毛玻璃面的两侧，透光面要用擦镜纸由上至下擦拭干净，直至无溶剂残留。使用挥发性溶液时应加盖，吸收池放入样品室时应注意方向相同，用后用溶剂或水冲洗干净，晾干防尘保存。

（3）采用1cm石英吸收池，测定时应以配制试品溶液同批溶剂为空白对照（另有规定除外），在规定的紫外可见波长范围内进行扫描，绘制波长—吸光度吸收曲线，以便于进一步进行结构分析。

注意：没有颜色的溶液在紫外光谱区没有吸收峰。 13.4.2 定量分析

紫外可见吸收光谱法进行定量分析是依据是朗伯－比尔定律。该法不仅可以直接测定那些本身在紫外可见光谱区有吸收的无机物和有机物，还可以通过适当的显色反应使被测物质生成在紫外可见光谱区有强烈吸收的产物，从而进行定量分析。

1.测量条件的选择

1）入射光波长的选择

定量分析时为了获得较高的测量灵敏度，入射波长应该选择被测物质的最大吸收波长。如遇干扰时，可选购用灵敏度稍低，但能避免干扰从而进行定量分析的其他波长。如果无法获知被测组分的适宜定量分析的吸收波长，可通过对被测物质在紫外可见光谱区的波长——吸光度吸收曲线，确定该物质的最大吸收波长，或适宜的定量分析测定波长。

2）控制适当的吸光度范围

定量分析时其吸收度在0.3～0.7之间时测量精度较好，吸光度值最好不要超过0.2～0.8。可以从两方面提高测量精度：控制溶液浓度；选择不同厚度的吸收池。

3）选择适当的参比溶液

如果显色剂和所用的其他试剂均无色，而且被测试液中又无其他有色离子存在，可用蒸馏水作参比；如果显色剂无色，而被测试液存在其他有色离子时，应采用不加显色剂的被测

试液作参比溶液；如果显色剂和试剂均有颜色，可在一份试液中加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不与显色剂作用，然后按试液测定加入显色剂及其他试剂，以此作物参比溶液。

2.显色剂及显色反应

用于分析的显色剂中，无机显色剂不多，主要有硫氰酸盐、钼酸铵和过氧化氢。有机显色剂种类繁多，可与金属离子生成及其稳定的螯合物。常用的有机显色剂包括磺基水杨酸、丁二酮肟、邻二氮菲、二苯硫腙、偶氮胂（铀试剂Ⅲ）、铬天菁S、结晶紫等。

显色反应的类型有配位反应，氧化还原反应以及增加生色团的衍生化反应等，其中配位反应应用最广。

1）显色反应一般应满足下列要求：

（1）灵敏度高，反应的产物须在紫外可见光谱区有强烈的吸光能力，即吸光系数ε大。 （2）选择性好，干扰少，或干扰容易消除。 （3）产物组成恒定，符合一定的化学反应式。

（4）产物化学性质足够稳定，至少在测量过程中溶液的吸光度变化很小。 （5）产物与显色剂直接的颜色差别大。 2）影响显色反应的因素有：

（1）显色剂用量：一般需加入过量显色剂，以保证反应尽可能进行完全。

（2）溶液的酸度：影响显色剂的浓度和颜色：不少显色剂是有机弱酸，因此溶液的酸度将影响显色剂的离解，并影响显色反应的完全程度；有许多显色剂具有酸碱指示剂的性质，更应注意选择适当的酸度条件。

影响被测离子的存在状态：有些金属离子，随着水溶液酸度的降低，除了以简单的金属离子形式存在外，还可能形成一系列的羟基或多核羟基络离子，可能进一步水解生成沉淀。

影响配合物的组成：某些生成逐级配合物的显色反应，酸度不同，配合物的配合比不同，色调不同。

显色反应的最适宜酸度，可通过实验确定：在不同酸度下测定被测物同一浓度的吸光度，以pH值为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制A～pH关系曲线。曲线的平直部分（吸光度恒定）所对应的pH值区间就是最适宜的酸度范围。

（3）显色时间：根据实验结果选择合适的显色时间

（4）反应温度：根据反应的具体情况选择合适的反应温度。

（5）溶剂：可根据实际情况加入适当溶剂。一般有机溶剂能降低有色化合物的离解度，提高显色反应的灵敏度。

（6）溶液中共存离子的影响：如果共存离子本身有颜色，或能与显色剂等反应生成有色化合物，会使测定结果偏高。如果共存离子和被测组分或显色剂生成无色配合物，将降低被测组分或显色剂的浓度，从而影响显色剂离子与被测组分的反应，使结果偏低。

常用消除干扰离子影响的方法有：控制溶液的酸度；加入合适的掩蔽剂；利用氧化还原反应改变干扰离子的价态；选择适当的波长；利用参比溶液消除显色剂和某些有色共存离子的影响；将被测组分与干扰离子分离。

3.实验操作技术

定量分析时其吸收度以在0.3～0.7之间为宜（除该品种已有注明外）， A、B 操作过程同三、实验技术中1 结构分析的（1）和（2）。 C、规定的吸收峰±2nm内，采用1cm石英吸收池，在规定的波长附近自动扫描测定或测几个点的吸收度以核对样品吸收峰位置是否正确，然后以吸收度最大波长作为测定波长

（除另有规定外，否则均应在±2nm以内）。

D、样品一般应取2份进行平行操作，每份结果对平均值的偏差应在±0.5%以内

E、对于大部分被测样品，使用2nm缝宽。仪器狭缝宽度的选用应小于样品吸收带的半宽度，否则测得的数值偏低，选择原则应以减少狭缝宽度时样品的吸收度不再增加为准。 13.4.3 比色皿的使用方法：

1）拿比色皿时，手指捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。 2）装盛样品以池体的2/3～3/4为度，使用挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视透光面应完全干燥透明。吸收池放入样品室时应注意方向相同。

3）测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。

4）清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。如比色皿被有机物沾污，可用盐酸-乙醇混合洗涤液（1:2）浸泡片刻，再用水冲洗。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，以免损坏。也不能用毛刷清洗比色皿，以免损伤它的透光面。

每次做完实验时，应立即洗净比色皿。 13.4.4 溶剂效应

溶剂对紫外可见吸收光谱也产生一定影响：一是的极性影响吸收波长红移和蓝移，以及吸收强度和精细结构；二是溶剂本身有一定的吸收带，表13-1是紫外可见吸收光谱分析中常用溶剂的最低波长极限，低于此波长时，溶剂吸收不可忽略。

表13-1 溶剂的使用最低波长极限

溶剂 乙醚 环己烷 正丁醇 水 异丙烷 甲醇 甲基环己烷 96％硫酸 乙醇 2,2,4－三甲戊烷 对二氧六环 正乙烷

最低波长极限（nm）

220 210 210 210 210 210 210 210 215 215 220 220

溶剂 甘油 1,2－二氧乙烷 二氯甲烷 氯仿 乙酸正丁酯 乙酸乙酯 甲酸甲酯 甲苯 吡啶 丙酮 二硫化碳 苯

最低波长极限（nm）

220 230 233 245 260 260 260 285 305 330 380 280

13.4.5 紫外可见光谱仪的使用

每种物质有其特定吸收光谱曲线，所以根据其特征波长下的吸光度确定该物质的含量，

这就是分光光度定性、定量分析以及研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。

图13-7所示的为美国热电公司 Evolution 220紫外可见分光光谱仪，1.0nm的分辨率，双光束（Double-Beam）配置。在测量的过程中任何时候当样品发生变化，双光束分光光度仪都能提供最准确的数据。在每一个数据点都是把样品对比参考光束（reference beam）进

行测量，从而减少了因改变样品发生的变化对结果的影响。这对动力学研究，长时间过程的监测，以及复杂样品的分析尤为有效。

图13-7 Thermo Scientific EV 220紫外可见分光光谱仪

1.实验方法的选择

紫外吸收光谱分析方法主要是依据分子内部原子间的相对振动和分子转动等信息进行测定。常用的紫外光谱附件：石英比色皿，智能恒温单池转换器，智能恒温8联池转换器，镜面反射附件，ISA-220 附件（反射模式的ISA-220附件，透射模式的ISA-220附件），积分球固体紫外附件等。

本实验室使用的美国热电公司 Evolution 220紫外可见分光光谱仪的具体结构如图13-8 和图13-9 所示：

图13-8 Thermo Scientific EV 220紫外可见分光光谱仪的具体结构

快速开启顶盒：独特的配有开启按钮的滑动样品仓开启门为双手已无空闲的操作员提供了极大的方便。

光学汇聚技术Application Focused Beam Geometry（AFBG）AFBG技术能依照您的使用要求来优化一些光学特性。Evolution 220系统的AFBG技术适用于固体样品、光纤、以及微量池的应用。配合我们材料研究和光纤应用附件进行优化，使这些附件发挥到最高的性能。另外，从Micro AFBG发出的高度集中的细小光束，能让80%的光线通过一个2Χ2mm光径的40μL微量池。

可屏蔽的样品检测器：很多附件是自己提供检测器的，因此可依照您自己分析需要，使用额外独立的检测器。

样品仓：因不受环境光线影响，使样品仓能够在测量的过程中打开，从而使分析工作具有多样化，更便利，并可以使用其它特定附件。

图13-9 Thermo Scientific EV 220紫外可见分光光谱仪的具体结构

彩色触摸屏：利用内置计算机提供的强大操作控制功能，采用触摸屏本机控制的EV 201和220分光光谱仪，用手指便可以进行常规操作，还和采用手写笔、键盘和USB鼠标来执行更为复杂的操作。

键盘：仪器可由本机控制或计算机控制。集成的按键能够和INSIGHT软件之间进行信息传递。按下Run和Zero/Baseline按键即可进行测量。还可以通过其他四个可编程的按键，启动客户订制环境（CUE）软件及其他应用程序。

触发信号连接：触发信号能够帮助您与外界进行互动。不管是当您需要一个触发信号输出引导步骤中其它部分，还是等待一个触发信号开始进行测量。

USB接口：可以通过USB接口外接计算机，从而通过INSIGHT软件进行仪器控制、数据分析、以及存储。也可以通过带有USB接口的存储设备备份您的分析方法和数据，可

以连接鼠标和键盘，或者通过这个接口连接打印机输出数据和报告。

单色仪：在保证波长准确前提下，我们精密的单色器能够实现快速扫描功能。扫描速度从<1到6,000 nm/min，有充分灵活的选择来获取实验数据。

汞灯端口：Evolution 201 & 220分光光度计是这类仪器中唯一提供汞灯校准附件的仪器。这个附件可提供全波长范围的波长准度和波长再现性的校准。在某些特殊的情况下，如需重做波长校准，即可用此附件测量并存储校正数据，就像我们在出厂前所做的一样。

闪烁氙灯光源：闪烁氙灯仅在进行测量的时候发出强烈的闪光。长效闪烁氙灯能够保证持续工作3年，具有使用成本低廉，维修间隔周期长，在可见光区和紫外区都具有很高强度的优点。最重要的是，闪烁氙灯不需要预热，能够适时进行测量。

2.仪器的操作步骤

1）开机

顺序开启紫外可见光谱仪电源（仪器开机后即进入自检）、计算机主机。 2）启动软件

A. 开启计算机主机开关后，计算机会根据配置进入Windows 或Vista操作系统。 B．双击桌面【thermo insight】快捷键后，进入thermo insight工作站。 3）仪器初始化

Evolution 220开机后即进入自检，大概5-10min后自检结束，仪器可由本机控制、计算机控制、或者把本机控制和计算机控制结合起来。一般我们选择由计算机控制具体的操作：用触摸笔点击触摸屏界面的thermo insight软件的system setting system instrument control 中的computer，完成仪器的控制由仪器本身到计算机的转换。进入计算机的thermo insight工作站界面后，仪器即可测试，不需预热。

4） 参数设定

计算机的thermo insight工作站界面上的HOMO菜单有四种相应的测试方法：Fixed; Scan; Quant; Rated.选择相应的测试方法，然后进入相应的 setting 菜单设置相应的测试参数即可测试

5） 光谱测定

A. 空白的紫外光谱：一般紫外测试的样品不论是固体还是液体测试，都需要空白样的测试，液体用相应的溶剂做空白，固体测试透过或者反射紫外可见光谱都有相应的空白配件。打开样品室盖，将空白对照放入样品室的样品池，盖上样品室盖。点击【measure scan】菜单界面下的“baseline”，进行背景扫描。

B.样品的紫外光谱：被测物质为液体的话溶液浓度不宜过高，一般为mg/L级，固体粉末则放入相应的固体粉末池连接积分球测试。

打开样品室盖，取出空白对照，将经适当方法制备的样品放入样品室的样品架上，盖上样品室盖。点击【measure scan】菜单界面下的“measure”，弹出对话框【confirm sample list】显示sample number，确认后点击【continue】进行样品扫描。数据采集完成后，弹出“数据采集完成”窗口，点击“是”。

C. 保存样品光谱数据：数据采集完成后，选择【file】菜单栏下“save workbook”，出现“enter workbook file name”窗口，输入保存文件名，点击“保存”。

样品的保存设置在【options】菜单下面的【data store】下可以按要求设置

D. 测定下一样品的紫外光谱：重复2）～4）操作，如果体系相同则采用同一背景，体系不同则1）～4）操作。

6) 扫谱结束

取下样品池，小心取出盐片。洗去样品（千万不要用水洗）。然后，再于红外灯下用滑

石粉及无水乙醇进行抛光处理。最后，用无水乙醇将表面洗干净，擦干，烘干按要求将模具、样品架等擦净收好，石英比色皿，或者积分球配件晾干收好。

7) 关机

A. 选择【file】>【exit】，退出程序；

B. 从计算机桌面的开始菜单中选择关机，出现安全关机提示。 C. 关闭计算机电源。 D. 关闭仪器电源。

3.样品测试的一般步骤

将待测样品放于样品池中。样品是液体的话，溶解在适当的溶液中放入石英比色皿的智能恒温8联池转换器或者智能恒温单池转换器样品池中，固体测紫外可见吸收光谱的话更换积分球配件，放在相应位置测量固体的透过或者反射紫外可见光谱。

1）积分球的实验原理

从样品表面反射回来的辐射能量大小。反射率定义为：

R% = I/I0×100 （13-4）

I为反射的辐射强度，I0为标准表面反射回来的辐射强度。

反射光谱的测定是在紫外-可见分光光度计上加一可进行反射操作的附件。光学积分球，一般将一根内径为60-150毫米的铝棒切成两半，技术比较精细复杂哦，然后将其挖成空心球，在球的内壁上涂上硫酸钡或熏上二氧化镁。这时，在球心放上被测试的样品，则在球内壁的任何地方的漫反射强度都相等，积分球内表面涂有高漫反射材料的BaSO4，可以使反射能量均匀化，在球内任一给定点反射光的强度都与空间分布无关，而与样品的漫反射率成正比，这就是积分球的工作原理，如图13-10所示。

图13-10 积分球的工作原理

左图中两个对角镜用于反射从样品反射过来的光线。右图是用于反射光谱测定的积分球附件。从单色器过来的双光束通过两个窗口进入积分球，照射在样品及参比上，反射光进入光电倍增管后交互测定样品及参比的漫反射。

2）使用积分球附件的注意事项:

a 无论使用透过样品还是反射样品,都要使样品紧密贴紧积分球开口,如有间隙会使测

量值产生误差.

b 如副白板表面被污染,可用细砂纸轻轻磨干净，并将副白板保存在干燥的容器中. c 测试粉末样品时，禁止倒置以将粉末或粉尘弄入积分球内 d 不能用手触摸镜面

e 当积分球不使用时，把积分球和反射筒（reflector）放回附件箱内

f 清洁事项：对于镜片，用干燥清洁的压缩空气或氮气清洁；对于涂层表面，先用干燥清洁的压缩空气清洁，接着用蒸馏水洗净，再用压缩空气干燥；对于附上的灰尘，用细度为220—240目的砂纸除去，再用蒸馏水洗净，最后用压缩空气干燥。

3）液体样品的测量

被测物质为液体的话溶液浓度不宜过高，一般为mg/L级，在进行定量测试时要精确计算加入的量，作为标准曲线或者判断化合物的一种手段。在进行大量的样品测试时，可以用智能恒温8联池转换器代替智能恒温单池转换器快速的进行紫外光谱的测试。下图是智能恒温单池转换器和可屏蔽的样品检测器以及石英比色皿。可屏蔽的样品检测器可依照自己分析需要，使用额外独立的检测器。石英比色皿采用1cm石英吸收池，智能恒温单池转换器对于少量的样品测试方面快捷，附件示意如图13-11所示。

图13-11 石英比色皿及吸收池，智能恒温单池转换器附件示意图

下图13-12是智能恒温8联池转换器示意图。8联池联动对于大量的样品测试，省时省力。具体的操作在每个测试技术的【setting】设置里有详细说明。

图13-12 智能恒温8联池转换器

4）固体样品的测量

固体样品的紫外测试用积分球配件来进行测试。光散射物质存存在于各种各样的样品中，比如自然水样以及生物匀浆等等。面对传统测量方法很难准确测量的散射物质以及混浊溶液，Evolution 220系统都能轻松实现。Evolution 220分光光度计的积分球附件(ISA-220)通过收集并整合散射的光线，能够把这些很难测试的样品准确地测量出来。ISA-220积分球附件是在同类价格仪器中性能最为突出和优秀的。它是60mm直径的Spectralon (R)球和10mm硅光电二极管，以及一个专用的AFBG光学系统的组合，能提供连续和准确的数据。在传统实验中，因为溶液中的悬浮微粒而产生的散射光造成人为的高吸收读数。由于采用散射测量. 利用ISA-220积分球捕获所有的正向散射光，提高数据质量并减少测量误差。

在作为反射附件时，ISA-220附件安装在样品仓的右侧，从而能让您的样品位于测量光束的焦点处。您还可以调整样品的位置，选择采用或者不用8度的角来测量全反射（SPIN）或者漫反射（SPEX）。采用较小的反射口，能够把单光束带来的误差最小化，选择INSIGHT软件中的自动纠偏功能，这种误差则基本上能被消除。ISA-220附件为科研和常规的反射测量提供了卓越的性能。ISA-220是为测量反射而设计的，样品正好完全在积分球光束的焦点上， 此外，为方便拿取样品采用了弹簧样品夹设计。

固体样品的测试一般分为测试固体样品的透射性能和反射性能，对于固体样品的透射性能的测试，要求样品尽量的透明成膜，对于不透明的固体一般做其反射性能。积分球及其配件如图13-13所示，右边带有数据接口的是积分球的主体部分，圆柱形的样品池或样品空白放在其左边的带有弹簧夹的槽中进行测试。旁边的三个圆形配件从上往下分别是固体样品的透射性能测试的空白标准，固体样品的反射性能测试的样品池，固体样品的反射性能测试的空白标准。

图13-13 积分球及其配件示意图

在测试固体样品的反射性能时，先测试空白标准，测试完成后，换入固体样品的反射性能测试的样品池，固体样品的反射性能测试的样品的制作：把待测固体在研钵中研磨成粉末，均匀的平铺在样品池表面，然后旋紧待测。固体样品的透射性能测试的样品的制作：不同于固体样品的反射性能测试，透射测试的空白标准是夹在积分球左边的弹簧夹的槽中，待测样则放入积分球前段的光路上并且不取下空白进行测试。

5）EV 220分光光谱仪的几种测试方法

本实验室的Evolution 220分光光度计共有 Fixed; Scan; Quant; Rated.等测试方法：仪器采用模块化设计，在智能恒温8联池转换器、智能恒温单池转换器和积分球之间可以互相更换，根据测试条件的不同，选择不同的部件进行测试，更换的端口如图13-14和图13-15所示，第一幅是分光光度计放置智能恒温8联池转换器、智能恒温单池转换器和积分球的地方，第二幅是数据接口接入的位置。

图13-14 智能恒温8联池转换器、智能恒温单池转换器和积分球更换端口

图13-15 数据接口接入端口示意图

（1）Fixed 法

Fixed：固定波长测量一般是用来测试液体样品在特定浓度下的吸光度的测试方法。 a、紫外可见吸收光谱遵从朗伯－比尔定律：

IA?log(0)??bc （13-5）

I式中：A：吸光度；I0、I分别为入射光、透射光的强度；c： 溶液的摩尔浓度；l： 样品池长度； ?： 在c用摩尔浓度、l用厘米为单位表示时称摩尔吸光系数，而当浓度或液层厚度用其他单位表示时就称吸光系数，常用 k 表示。

因此，对于单一溶质溶液，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，即可求出溶液中物质的浓度和含量。该法不仅可以直接测定本身在紫外可见光谱区有吸收的无机和有机物，

还可以将采用适当的试剂与吸收较小或非吸收物质发生显色反应，生成对紫外可见有强烈吸收的产物，从而对它们进行定量测定。

当溶液中含有多种对光产生吸收的物质，且各组分之间不存在相互作用时，则该溶液对波长λ的吸光度A总λ：

???????A总?A1??A2?A3???An?(?1?c1??2c2??3c3????ncn)b（13-6） 偏离朗伯－比尔定律的原因有：①非单色光引起的偏离-入射光为非单色光；②散射光引起的偏离，常由溶液的不均性引起，实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可吸光质点的吸光特性变化大；③化学原因引起的偏离；④光程的不一致性。光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。

b 、定量分析时一般使用标准曲线法。

标准曲线法就是取已知浓度的样品在一定入射波长的条件下的吸光度的值，平衡的测量几组值，绘制标准曲线。从而在测量改物质的未知浓度的样品时可以通过样品吸光度得到样品浓度。

在定量分析时为了获得较高的测量灵敏度，入射波长应该选择被测物质的最大吸收波长。如遇干扰时，可选购用灵敏度稍低，但能避免干扰从而进行定量分析的其他波长。如果无法获知被测组分的适宜定量分析的吸收波长，可通过对被测物质在紫外可见光谱区的波长——吸光度吸收曲线，确定该物质的最大吸收波长，或适宜的定量分析测定波长。定量分析时其吸收度在0.3～0.7之间时测量精度较好，吸光度值最好不要超过0.2～0.8。可以从两方面提高测量精度：控制溶液浓度；选择不同厚度的吸收池。

在【Fixed】菜单下选择【setting】设置中的【instrument】，其中【date mode】中的数据模式有absorbance、%transmittance、%reflectance、log(1/R)、log（abs）可以根据不同的需要选择相应的数据模式。 在【sample】中设置相应的待测样品个数。测试完成后软件会自动形成标准曲线。

(2）Scan 法

Scan扫描测量是测量液体或者固体紫外可见连续曲线光谱，一般从200~800nm。在【Scan】菜单下选择【setting】设置中的【instrument】，有基本的参数设置【date mode】中的数据模式一般选择absorbance，其他的参数可以根据待测样品要求进行，一般【bandwith】、【integration time】、【data interval】选择默认值如图13-16所示。

图13-16 Scan法扫描测量参数设置

在【correction】菜单中做通过测试时，一般选择100%T baseline。在参数设置结束后便可以测量。

(3）Quant 法

Quant：定量分析主要用来定量测试，紫外可见吸收光谱遵从朗伯－比尔定律，具体原理参见fixed部分。Evolution 220分光光度计提供6种不同方式进行便捷的定量分析：

a、 手工输入因子、 b、 测量单一标准、 c、 标准曲线、

d、 双波长的标准曲线、 e、 高级标准曲线、 f、 高级无标准分析。 可以进行多次计算分析，在一种分析方法中攫取不同的参数，从而为特定的分析方法提供完整的答案。用定量分析方程计算复杂应用定量分析时一般使用标准曲线法。对于标准曲线的形式在【Quant】菜单下选择【setting】设置中的【type】中一般选择standard curve，在【standards】中根据标准曲线的形式可以有不同种选择，在【curve fit type】中有linear、linear through zero、 2nd order polynomial等。选择样品个数便可以测量。

(4）Rated 法

Rated：动力学分析一般用的较少。在动力学分析，每个样品池每秒可以采集到100个数据点，从而让动力学分析有充分的数据支持，可分段测量，并配合不同的采样密度和采样时间，利用驻留时间（Dwell time）特性，在每次测量中采集到更多的数据，并得到快速反应的曲线，适用于零级、一级和二级反应，以及连续反应机理的研究 ， 数据分析亦可采用分段处理，使全部分析更具灵活性。

6）Evolution 220分光光谱仪的主要技术性能指标：

? 光谱带宽: 1 nm，2nm

? 光源: 氙灯(使用寿命10年 ，3年保修 ) ? 检测器: 硅光二极管

? 波长范围: 190 –1100 nm；波长精度: ± 0.8 nm (全波长) ；波长重复性: < 0.1 nm

? 扫描速度: <1 to 6,000 nm/min; ? 回转速度: 31,000 nm/min ? 吸光度范围: > 3.5 Abs

? 吸光度精度: 0.5 A: ± 0.004A;1A: ± 0.006A; 2A: ± 0.010A; ? 噪音: 0A: <0.00015 A; ? 漂移: < 0.0005 A/小时

? 杂散光: KCl, 198 nm: <1%；NaI, 220 nm: <0.05% ；基线平直度: ±0.0010 A (200-800 nm; 范围)

13.5 实验结果解析

目前，紫外可见吸收光谱分析应用非常广泛，可用于紫外区范围有吸收峰的物质的检定即结构分析。其中主要是有机化合物的分析和检定。物质的紫外吸收光谱基本上是其分子中生色团及助色团的特征，而不是整个分子的特征。如果物质组成的变化不影响生色团和助色团，就不会显著地影响其吸收光谱，如甲苯和乙苯具有相同的紫外吸收光谱。另外，

610～700nm≤±6nm

2）线性误差检查

以不同浓度的K2Cr2O7、CoCl2和CuS04（所有K2Cr2O7、CuS04溶液稀释时，要使用0.05mol／L H2SO4为溶剂）按下表所示波长进行测定。(测CoCl2液A值时用0.10mol／L HCL液作空白，测K2Cr2O7 和CuS04 液时以0.05mol／L H2SO4液为空白)

用仪器分别测量以上各个溶液的吸收度，每一浓度的溶液必须重复测量3次，取其平均值，

将记录的吸收度与对应溶液浓度，按下列公式计算各点的线性误

对于WFZ-800-D2型紫外-可见分光光度计在吸收度为0.3-0.8(即透光率为80%～16%)的范围内，用符合Beer定律的溶液进行测定。其吸收度与溶液浓度的误差应符合以下规定：

吸收度范围线性误差：

0.1—0.3≤6% 0.3—0.6≤3％ 0.6—0.8≤4％

3）灵敏度检查 按下表浓度在指定波长下用仪器分别测量吸收度，设每种溶液的两个浓度间的变化值为 △C，测得相应吸收度值的变化值为△A，则：

灵敏度＝△A/△C

对于WFZ-800-D2型紫外-可见分光光度计，仪器的灵敏度应符合下表的规定：

4）重现性检查

将波长固定在690nm，用2000μg／ml CuS04溶液，以0.05mol／L H2SO4溶液为空白，连续重复测定七次该溶液的透光率。

对于WFZ-800-D2型紫外-可见分光光度计，仪器在同一工作条件下，用同一种溶液连续重复测定七次，其透光率最大读数与最小读数之差不应大于0.5%。

数据处理(Data processing)

将有关实验数据分别填入下表，计算结果，给出结论。 （5）波长精度检查

波长精度=实测值-理论值=______-510=_______ 6）结论

线性误差检查结果

灵敏度检查结果

重现性检查结果

5.思考题(Problem)

(1) 试写出在某一波长下，以蒸馏水为空白测定某一样品溶液吸收度的主要步骤。 (2) 线性误差为何在不同范围要求不一样?

(3) 解释为什么灵敏度测定要采用三种不同物质的溶液进行测定。

(4) 指出你所使用的这台仪器和几个基本部件的名称，弄清它们在仪器中的作用。 (5) 如果所检查的某些项目不合格，你认为可以用什么方法校正仪器后，继续使用？

13.7.2 实验二 氟试剂分光光度法测定水体中的氟化物

1.实验目的和要求

(1) 理解用氟试剂分光光度法测定水体中的氟化物； (2) 掌握EV220分光光度计的使用及测定方法 2、实验仪器与试剂

仪器： Ev220紫外可见分光光谱仪， 30mm或10mm吸收池，pH计 试剂：新制备去离子水或无氟蒸馏水

盐酸：分析纯

盐酸溶液（c=1mol/L）：取8.4mL盐酸溶于100mL去离子水中。 氢氧化钠：分析纯

氢氧化钠溶液（c=1mol/L）：称取4g氢氧化钠溶于100mL去离子水中。 丙酮：分析纯 硫酸：分析纯

硫酸（处理后）：取300mL硫酸放入500mL烧杯中，置电热板上微沸1h，冷却后装入瓶中备用。

冰乙酸：分析纯 无水乙酸钠：分析纯 氟化钠：优级纯

氟化物标准贮备液：称取已于105℃烘干2h的优级醇氟化钠（NaF）0.2210g溶于去离子水中，移入1000mL容量瓶中，稀释至标线，混匀贮于聚乙烯瓶中备用，此溶液每毫升含氟100μg。

氟化物标准使用液：吸取氟化物标准贮备液20.00mL，移入1000mL容量瓶，用去离子水稀释至标线，贮于聚乙烯瓶中，此溶液每毫升含氟2.00μg。 氟试剂溶液（c=0.001mo/L）：称取0.193g氟试剂[ALC,C14H7O4·CH2(CH3COOH)2]，加5mL去离子水湿润，滴加1mol/L氢氧化钠溶液使其溶解，再加0.125g乙酸钠，用1mol/L盐酸溶液调节pH至5.0，用去离子水稀释至500mL，贮于棕色瓶中。 硝酸镧：分析纯 硝酸镧溶液（c=0.001mol/L）：称取0.443g硝酸镧，用少量1mol/L盐酸溶解，以1mol/L乙酸钠溶液调节pH为4.1，用去离子水稀释至1000mL。

缓冲溶液（pH＝4.1）：称取35g无水乙酸钠溶于800mL去离子水中，加75mL冰乙酸，用去离子水稀释至1000mL，用乙酸或氢氧化钠溶液在pH计上调剂pH为4.1。

混合显色剂：取0.001mo/L氟试剂溶液、缓冲溶液、丙酮及0.001mo/L硝酸镧溶液，按体积比3:1:3:3混合既得。临用时配制。 3. 实验原理

氟离子在pH值为4.1的乙酸盐缓冲介质中与氟试剂及硝酸镧反应生成蓝色三元络合物，络合物在620nm波长处的吸光度与氟离子浓度成正比，定量测定氟化物（以F-计）。

4.实验内容与步骤

（1）样品的采集与保存：测定氟化物的水样，应用聚乙烯收集和贮存。

（2）试样的制备：除非证明试样的预处理是必不可少的，可直接制备试样进行比色，否则应按《中华人民共和国国家环境保护标准HJ 488-2009 水质 氟化物的测定 氟试剂分光光度法》附录A进行预处理蒸馏。

（3）校准曲线

于留给25.0mL容量瓶中分别加入氟化物标准使用液0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00mL，加去离子水至10mL，准确加入10.0mL混合显色剂，用去离子水稀释至刻度，摇匀，放置30min用30mm或10mm吸收池于620nm波长处，以纯水为参比，测定吸光度。扣除试剂空白（零浓度）吸光度，以氟化物含量对吸光度作图，既得校准曲线。

（4）测定

准确吸取1.00～10.00mL试样（视水中氟化物含量而定）置于25.0mL容量瓶中，加去离子水至10mL，准确加入10.0mL混合显色剂，用去离子水稀释至刻度，摇匀。以下按（3）进行。经空白校正后，由吸光度值在校准曲线上查得氟化物（F-）含量。

（5）空白试样

用水代替试样，按测定样品步骤进行测定。

5.数据处理

试样中氟化物（以F-计）含量按下式计算：

??m V式中，ρ——试样中氟化物（以F-计）含量，mg/L m——校准曲线查得的试样含氟量，μg V——分析时试样体积，mL。 计算结果表示到小数点后两位。 6.实验注意事项

（1）本方法适用于地表水、地下水和工业废水中氟化物的测定。 （2）本方法的检出限为0.02mg/L，测定下限为0.08mg/L。

（3）在含5μg氟化物的25mL显色液中，存在下述离子超过下列含量（单位：mg），对测定有干扰，应预先进行蒸馏：Cl-30；SO42-5.0；NO3-3.0；B4O72-2.0；Mg2+2.0；NH4+1.0；Ca2+5.0。

7.思考题

（1）为什么氟离子在乙酸盐缓冲介质中与氟试剂及硝酸镧反应生成蓝色三元络合物，能在可见光区显色？

（2）显色剂于待测试样反应是否一定要在可见光区显色？为什么？在可见光区显色有什么优势？

13.7.3 实验三 紫外可见分光光度计法测定苯酚

1.实验目的

（1）了解紫外可见分光光度计的结构、性能及使用方法 （2）熟悉定性、定量测定的方法 2.仪器与试剂

(1)紫外可见分光光度计

(2)容量瓶(1000ml、250ml) (3)比色管(50ml)

(4)吸量管(5ml、10ml) (5)苯酚(AR)

准确称取苯酚0.010g于200ml蒸馏水中，溶解后定量转移到1000ml的容量瓶中，作为储备液。

于5支50ml的比色管中，用吸量管分别加入0.5 ml、2ml、5ml、10ml、20ml的10ug/ml苯酚标准溶液，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。

3.实验原理

苯酚是一种剧毒物质，可以致癌，已经被列入有机污染物的黑名单。但在一些药品、食品添加剂、消毒液等产品中均含有一定量的苯酚。如果其含量超标，就会产生很大的毒害作用。苯酚在紫外光区的最大吸收波长λmax=270nm。对苯酚溶液进行扫描时，在270nm处有较强的吸收峰。

定性分析时，可在同一条件下，对标准样品和未知样品进行波长扫描，通过比较两者光谱图样进行鉴定。在没有标准样品的情况下，可与标准谱图进行比较。

定量分析是在270nm处，通过测定不同浓度苯酚的标准样品的吸光值绘制标准曲线。再在此条件下测定未知样品的吸光度，从标准曲线中得出未知样中的含量。

4.实验数据处理

（1）最大吸收波长的选择

在标准系列溶液中任取一种，以水为参比，分别在波长200~300nm之间以10为间隔测定其吸收波长，在吸光度最大值附近以间隔2为单位测定，直至找到最大吸收波长。

（2）标准曲线绘制

在已筛选的最大波长下，以水为参比分别测定上述标准溶液的吸光度，画出C-A曲线，写出回归曲线方程。

（3）苯酚浓度的测定

在相同情况下，测定其吸光度。根据回归曲线方程计算出待测苯酚浓度。

5.问题讨论

（1）紫外可见分光光度法的定性、定量分析的依据是什么？ （2）紫外可见分光光度计的主要组成部件有哪些？ （3）说明紫外可见分光光度法的特点及适用范围。

13.7.4 实验四 使用积分球测定阻燃布样品的镜反射和漫反射光谱

1.实验目的和要求

紫外可见分光光度计广泛应用于化学、材料、光学和生命科学等测试领域。积分球是紫 外可见分光光度计最为重要的附属装置，由于积分球的使用，大大扩展了光度计可以测定的样品形态和种类，比如悬浊样品和不透明类样品。本实验以实际测定为例，介绍了样品镜面反射和漫反射光谱以及色度的测定方法。

2.实验原理

当光线照射到样品上时，一部分光在样品表面产生镜面反射，该光线反射角等于入射角， 满足反射定律，另一部分光经折射进入样品内部经样品折射、散射和吸收后，最后光线

由样品表面辐射出来，这部分光由于散向各方而称为漫反射。如图13-17所示

图 13-17 镜面反射和漫反射

积分球又称为光通球，是中空的完整球壳。内壁涂白色漫反射层，反射层通常是 BaSO4 或聚四氟乙烯，要求球内壁涂层涂敷均匀。图13-18是积分球的原理图。

图 13-18 积分球的原理图

3.实验内容

1）薄凹凸透镜的漫反射和镜面反射测定 a.、漫反射测定。

样品凹面涂黑，测定凸面的漫反射光谱，两块标准 BaSO4 白板校正仪器基线，样品放积分球0o侧，以BaSO4白板做参比，如图13-19 所示放置样品。得样品的漫反射光谱，如图中下面的曲线。

图 13-19 漫反射测定示意图

b、 镜面反射测定。

使用 S/R 切换功能，切换分光光度计的样品和参比光束，标准铝镜放积分球8o入射侧，BaSO4 白板放参比侧，校正仪器基线。然后用样品取代铝镜，如图13.20所示放置样品得镜面反射光谱，如图 13-21 中上面的曲线

图 13-20 镜面反射测定示意图

图 13-21 凹凸透镜的漫反射和镜面反射光谱

2）阻燃伪装布光谱性能测试

纺织品的光谱特性是积分球很典型的测试项目，本例通过积分球测定伪装布表面各斑点颜色的光谱性能。 该样品表面由灰、 绿、 棕和黑4种颜色斑点组成， 剪裁每种颜色斑点15mm×25mm大小，放置样品于积分球0o侧，测定各颜色斑点的反射光谱，如图 13-22所示。

图 13-22 各颜色斑点的反射光谱图

4.使用积分球附件的注意事项:

（1）无论使用透过样品还是反射样品,都要使样品紧密贴紧积分球开口,如有间隙会使测量值产生误差；

（2）如副白板表面被污染,可用细砂纸轻轻磨干净，并将副白板保存在干燥的容器中；（3）测试粉末样品时，禁止倒置以将粉末或粉尘弄入积分球内； （4）不能用手触摸镜面；

(5）当积分球不使用时，把积分球和反射筒（reflector）放回附件箱内；

(6）清洁事项：对于镜片，用干燥清洁的压缩空气或氮气清洁；对于涂层表面，先用干燥清洁的压缩空气清洁，接着用蒸馏水洗净，再用压缩空气干燥；对于附上的灰尘，用细度为220—240目的砂纸除去，再用蒸馏水洗净，最后用压缩空气干燥。

5.思考题

（1）积分球如何安装和使用？

（2）积分球安装和使用过程中那些因素可以产生实验误差，如何消除？ 13.7.5 实验五 三波长光度法测定植物中总黄酮含量

1.实验目的和要求

（1）了解三波长分光光度法的测定原理。 （2）掌握总黄酮含量的测定方法。 2.实验仪器和试剂

仪器：

（1）紫外可见分光光度计(波长扫描范围在200～600nm)1套。 （2）超声波清洗器。 试剂：

芦丁标准品溶液：称取105℃干燥至恒重的芦丁(中国药品生物制品检定所)20.30mg，用70% 乙醇溶解定容至100mＬ。

70%乙醇。 1%三氯化铝。 石英砂。

植物叶和果：洗净，自然干燥后加石英砂充分研磨备用。 HCl-Mg溶液、AlCl3溶液、Pb(Ac)3溶液。

2mL带刻度移液管1支，10mL容量瓶7个，100mL容量瓶若干，带塞玻璃瓶若干。

3.实验原理

1）总黄酮含量的测定原理

黄酮类化合物主要是在紫外吸收光谱带I（300～400nm）和带II（240～280nm）范围内吸收。而植物果和叶中含有的其他成分刚好在带I和带II内有一定程度相同的吸收，这对总黄酮的含量测定会产生干扰，因此通常选择铝配合物显色体系来测定样品中总黄酮的含量。这是因为铝盐可以和黄酮类化合物形成稳定的化合物，使吸收带I产生明显红移，大大增加了吸光度。

2）测定的基本原理

采用三波长分光光度法测定黄酮类化合物的基本原理如图 13-23 所示。

图13-23 三波长光度法原理示意图 1- 待测成分; 2- 混浊; 3 - 1 + 2

图13.24 三波长光度法消除干扰示意图

由于三角形λ1Nλ2 和λ1 Pλ3 相似，故任一吸收曲线上，任意选择3个波长λ1、λ2 和λ3 ，测定的吸光度为A1、A2 和A3：

?A?Q?2?(N?2?MN)

∵ △Rλ1 P≌△MNP

∴ 测定的A1、A2 和A3 具有下列函数关系：

mA1?nA3(?2??3)A1?(?1??2)A3??2m??1?n??3?A?A2??A2??????m?n?1??3m?n?????c?L?

式中: L -光程，m- 波长λ2 和λ3 的差值， n- 波长λ1 和λ2的差值，c为待测物的摩尔浓度，ελ、ελ、和ελ分别为待测物在3个波长处的摩尔吸光系数。因 ΔA值与待测物浓度成正比，而用于待测物浓度的测定。

由图13.23可以看出，当ΔA值为零时，所选3个波长处，测得的相应吸收光谱上3点在一条直线上。因此，任选3个波长测定，使干扰成分产生的吸收光谱为一条直线，这样测得的

1

2

3

ΔA值与干扰物的浓度无关。如果干扰物的吸收光谱如图13.24中曲线2所示的形状，则只要在曲线上找到同一直线上的3点的相应波长处测定，便可消除干扰成分。

4.实验步骤

1）黄酮的定性分析 在进行含量测定之前，首先取粉碎后植物的叶和果溶于70% 乙醇中，与HCl-Mg、AlCl3、Pb(Ac)3 反应，如果测试结果均为阳性，表明其中含有黄酮类化合物。

2）植物果叶中总黄酮的提取

研磨后准确称取植物叶、果各2.000g，加入70%的乙醇50mL，室温浸提24h后，在50℃的条件下超声波振荡提取1h，离心分离，取上清液备用，重复操作三次，减压浓缩后，精确转移至100mL容量瓶，70%乙醇定容备用。

3）测定波长的确定

将植物果和叶的提取物及芦丁标准品在适当的介质条件下，与1% AlCl3反应形成络合物而显色。与标准品溶液的吸收光谱对照，如果在417nm 处均有最大吸收峰，则表明可用芦丁作为标准品测定植物果叶中黄酮的含量。

准确吸取芦丁标准储备液1.0mL分别注入10mL容量瓶中，加1%的AlCl3溶液，充分混合至刻度，用1c m的比色皿在波长200～532nm范围内扫描，绘制出其吸收曲线，用作图法确定三个测定波长分别为λ1=463nm、λ2=417nm、λ3=382nm。

4）标准曲线的绘制

准确吸取芦丁标准溶液1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL分别置于10mL容量瓶中，加1%AlCl3 溶液，充分混合至刻度，在波长λ1=463nm、λ2=417nm、λ3=382nm 下分别测得吸光度，计算ΔA值，并计算ΔA与浓度关系的回归方程。

5）样品中总黄酮含量的测定

取植物叶和果的提取物，测定用1%的AlCl3溶液定容过的黄酮溶液在测定波长下的吸光度值，根据ΔA值，计算总黄酮含量。

5.数据处理

（1）绘制植物叶和果的提取物及芦丁标准品与1% AlCl3显色反应的吸收曲线确定测定波长。

（2）按照公式计算标准曲线的各ΔA值，计算ΔA与浓度关系的回归方程。 （3）由标准曲线计算植物叶和果中的总黄酮含量。

6.注意事项

（1）黄酮类物质广泛存在于各类植物体内，一般采集的各类水果、蔬菜、药材等均含有黄酮类物质。为确定采集的植物体内确有黄酮类物质，可先按照实验步骤1进行黄酮的定性分析。

（2）本实验中的吸收光谱图以刺五加的叶和果与芦丁对照绘制，并确定了λ1、λ2和λ3

的测定波长。实际测定的植物样品，可根据植物提取物与芦丁标准品的吸收光谱图选择各自合适的λ1、λ2和λ3的测定波长。

（3）1% AlCl3溶液的用量在0.5～2.5mL范围内几乎不影响测定结果。

7.思考题

（1）详细推导三波长分光光度法ΔA值的计算公式。

（2）将三波长分光光度法应用于实际样品测定时，如何选择λ1、λ2和λ3的测定波长？

参考文献

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[2] 黄君礼，鲍治宇．紫外吸收光谱法及其应用[M]，北京：中国科学技术出版社，1992． [3] 陈结，宋启泽．有机波谱分析[M]，北京：北京理工大学出版社，2008． [4] 钱沙华，韦进宝．环境仪器分析[M]，北京：中国环境科学出版社，2004． [5] 张剑荣，戚苓，方惠群．仪器分析实验[M]，北京：科学出版社，2002．

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