细胞信号转导研究方法

细胞信号转导研究方法

信号转导的研究方法

细胞信号转导研究方法

生物样品的处理

组织样品

采集：新鲜、未污染，剥去脂肪和筋皮等结缔组织若保存，液氮速冻，-80℃冻存

蛋白质成分的保护通常在生物样品中加入适量的蛋白酶抑制剂：PMSF(苯甲

磺酰氟)、EDTA、胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂和亮抑蛋白酶肽。

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低温保存：根据蛋白质的用途决定保存温度：4、

-20还是-80,特殊要液氮

冻溶： -20或-80→4(一天) →室温

均匀摇晃，勿产生气泡，减少沉淀

组织提取物的制备：提取可溶蛋白(尽可能选

择含目标蛋白高的组织)

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步骤及注意事项：1、切成小块，放入预冷匀浆器，加入预冷缓冲液(2倍体积)

2、匀浆1-3min,若较长时间，则间隔1min3、匀浆方法选择：有的组织在匀浆前先冷冻后有利于破碎；

人工匀浆

4、缓冲液的选择：使用中性PH、离子强度适当 5、抑制蛋白酶的加入：根据蛋白质的可能降解情况加入(酶 抑制剂价格昂贵)

6、低温高速或超速离心 7、超声的方法

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细胞破碎与分离

破碎方法：

机械法： 非机械法：溶胞作用：酶溶法、化学法、物理法

酶溶法：用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解 常用：溶菌酶、β -1,3葡聚糖酶、蛋白酶等； 缺点：价格高，通用性差

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化学渗透法：化学药品改变细胞壁或膜的通透性

有机溶剂(苯、甲苯)、表面活性剂(SDS、 TritonX-100)、金属螯合剂(EDTA)、变性剂 (尿素)

微波加热法：适用于热稳定的产物其他：反复冻融法、渗透压法、干燥法

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信号转导的研究方法受体

突变株的筛选(遗传学方法) 受体提纯(亲和层析) 标记配体法检测受体：

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受体与配体相互作用研究方法 ：力(K)以及结合位点的密度(Bmax);

(1)饱和实验，用于测定放射性配体对受体的亲和

(2)抑制实验，用于测定未标记的竞争配体与受体 的亲和力(Ki); (3)动力学实验，用于测定放射性配体与受体的结 合速率常数(K+1)和解离速率常数(k-1)。

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饱和实验常用于确定受体密度(受体的数目)在实验干预(如药物治疗)时的变 化。保持受体数不变而改变放射配体浓度可得到饱和曲线。从该实验中 可估计受体最大结合量(Bmax)和受体对放射性配体的解离常数 (Ka)。

饱和实验的结果以结合配体数(与受体结合的放射性配体的浓度)为y 轴，游离配体数(未与受体结合的放射性配体的浓度)为x轴作图。当 放射性配体浓度增大时结合配体数逐渐增加，当达到某一点以后，再增

多放射性配体量也不引起结合配体数的显著增加。

饱和曲线的最高趋近点

所对应的y值，亦可代表所研究组织中的受体密 度。Kd为占据受体50%结合位点时的配体浓度。

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亲和标记法分离表面受体亲和标记(affinity labeling)是常用的分离细胞表面受体的方法

原理： 将细胞与超量标记的激素(配体)混合，以饱和所有特异受体的激素结合位点。洗去多余的激素，然后加入能 够与受体和配体结合的共价交联剂将激素与受体进行共价交 联。

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亲和标记胰岛素受体

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大多数交联剂含有两个可与蛋白质中自由氨基相互作用的基 团， 当表面受体与配体结合后，配体和受体上各自的自由

氨基的距离靠近到足以被小分子的交联剂结合时，受体和配体就会被交联在一起。

与交联剂共价结合的配体和受体能够耐受去垢剂和变性剂的 处理。

因而可用去垢剂和变性剂溶解细胞质膜，分离膜蛋白通过电 泳进行分析。

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与自由氨基反应的位点

交联剂的分子结构及与受体和配体的共价交联

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核受体作用的DNA元件研究方法 Chip on Chip

纯化的受体制备抗体→ CHIP →特异核酸 序列与已知序列的基因芯片杂交→受体结 合的核酸序列

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G蛋白

药理学激活剂及抑制剂 非水解的GTP类似物激活剂：γ -S-GTP、β ,γ -亚氨基GTP, 与活化G蛋白混合，使G蛋白持续活化状态

细菌毒素-霍乱毒素激活剂：ADP核糖基共价结合α 亚基，不可逆修饰，结合GTP,但不能水解

GDP类似物抑制剂：GDP β S,结合α 亚基的鸟苷酸位点，广泛应用

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生化实验检测特异性？

GTP结合实验：用GTP类似物[ γ -32P]GTP,检测G蛋白的存在，几种G蛋白的

免疫印迹实验：抗体 GTPase活性实验：不同反应底物：同位素标记法([γ -32P]GTP);级联反应荧光法(NADH,GTPase、丙酮酸激酶和LDH)

分子遗传学手段获得突变株)

借助G蛋白突变株(功能缺失突变株、显性负突变株、功能

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环核苷酸信使系统

cAMP/cGMP定性及定量测定3H/125I标记cAMP/CGMP竞争结合分析系统

酶联免疫方法(ELISA) 色谱分离-质谱测定 细胞内实时测定：荧光共振能量转移(FRET)及生物分子 荧光互补(BIFC)

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cAMP[3H]分析系统，优点是放射性半衰期长，可用于大量样品的分析；

cAMP[125I]分析系统，用于小量样品的分析；

cAMP ELISA测定方法，测定简便、敏感性高(特异受体) 。

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cAMP信号系统常用药理学试剂

cAMP类似物：竞争性结合PKA调节亚基上的cAMP结合位 点，PKA的竞争拮抗剂，PDE不能水解，Rp-cAMP、SpCAMP

与PKA的底物结合位点竞争的抑制剂：结合C亚基的ATP结合位点，抑制专一性低，异喹啉衍生物H89、KT5720

蛋白激酶抑制剂(PKI):结合C亚基的底物结

合位点，细 胞内源：α 、β 、γ 三种亚型，人工合成PKA抑制肽(高浓 度时对PKG的影响)

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cGMP信号系统常用药理学试剂 人工合成的cGMP类似物：8-Br-cGMP,直接激活 PKG

sGC抑制剂：NS2028PKG抑制剂：KT5823

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脂质代谢的常用方法

同位素示踪：通过标记32P 磷脂分子的定性和定量：色谱、质谱的应用脂组学

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