酶的固定化方案

酶的固定化的方案

一、材料和方法 1.实验材料及试剂

酶，25%戊二醛溶液，带氨基的载体，考马斯亮蓝，牛血清白蛋白。 2. 主要实验仪器

紫外可见光分光光度计Uv-1800，THZ一C恒温振荡器，MD200一3型电子天平PHS一3C酸度计

3.酶的固定化方法 1）载体的活化

a 对所得的载体表面带有大量的氨基，对其进行活化处理可用于酶蛋白的共价结合。采用戊二醛为活化试剂，使凝胶表面连接上游离的醛基。具体方法为:将lg带氨基的载体颗粒臵于3ml、10%的戊二醛溶液中振荡24h，然后真空过滤。所得固体用去离子水洗涤多次，干燥后即为戊二醛活化的树脂颗粒。 b大孔树脂预处理方法：称取10g树脂于锥形瓶中，用95%的乙醇浸泡24h，真空抽滤，用1L蒸馏水冲洗。树脂依次用25mL的5%HCl和5%NaOH溶液浸泡4h后抽滤，用蒸馏水洗至中性。抽滤后臵于4℃冰箱中干燥4h，室温保存备用。

举例：称取适量经预处理的大孔树脂于50mL锥形瓶中，加入适量磷酸缓冲液（pH7.5，0.05mol/L）和适量的酶，臵于恒温水浴振荡器中吸附一定时间后（37℃，150r/min）真空抽滤，并用100mL缓冲液冲洗载体，抽干后臵于4℃冰箱中干燥4h，并于4℃冰箱中密封保存。

2）固定化方法 a 共价结合法

准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。然后于冰浴中缓慢振荡24h。之后离心收集固体，用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。

b 酶聚集体包被法

准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。然后于冰浴中缓慢振荡24h。之后向混合液中加入0.5ml、2%的戊二醛溶液，继续振荡10h，离心收集固体。最后用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。

c.酶活性的测定

d. 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

固定化时溶液中的蛋白质含量采用考马斯亮蓝染色法测定：

考马斯亮蓝试剂的配制：将考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至 1000mL。

标准蛋白溶液的配制：以牛血清白蛋白为标准蛋白，用蒸馏水配臵成 0.1mg/mL 的蛋白溶液。

制作标准曲线：分别取 0.0-1.0mL 的标准蛋白溶液于试管中，用蒸馏水加至 1mL，然后加入考马斯亮蓝试剂 5mL，摇匀，放臵 5min 后用分光光度计在 595nm 处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标绘制标准曲线

样品测定：取样品溶液 1mL，样品蛋白质含量高时，可将取样量减少，并有蒸馏水补至 1mL。加入考马斯亮蓝试剂 5mL，摇匀，放臵 5min 后用分光光度计在 595nm处测定吸光度。根据标准曲线计算出样品溶液的蛋白质含量。

二、固定化工艺条件的选择 (1) 固定化温度的选择

将 0.50g载体，600μL酶和 10mL缓冲液(pH7.5)混合后分别在 25、30、37、45、55℃下固定5h，测定各温度下脂肪酶的固定化率和相对酶活力。因为较高温度下蛋白分子运动加剧，减小了酶的扩散限制作用，使酶分子能更快扩散进入载体的孔道内并与载体发生相互作用，加快固定化。但高温会破坏蛋白质的结构，导致酶因热变性而失活。

(2) 固定化ph值的选择

将 0.50g载体，600μL酶分别和pH为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0 的 10mL缓冲液混合后在 30℃下固定 5h，并测定各pH值条件下的固定化率和相对酶活力。缓冲液的pH值会影响酶分子周围的离子微环境，从而影响固定化酶的活力，在特定的pH值条件下，酶分子的活性基团能处于最佳的离子状态，从而使酶显示出较高的活力。

(3) 固定化时间的选择

将 0.50g载体，600μL酶和 10mL缓冲液(pH4.0）混合后在 30℃下分别固定 1、2、3、4、5、7h，测定不同吸附时间下的固定化率和相对酶活力。随着吸附时间的延长，载体的固定化率在增大，在 h后基本达到平衡，吸附刚开始时，载体上的吸附位点很多，传质的驱动力大，吸附迅速。吸附时间超过 后，相对酶活力开始下降，因为酶分子在载体上开始积聚，影响了酶分子的扩散，降低了暴露的活性位点数量，且酶在长时间的振摇过程中部分酶会失活，因此选择 h为最佳吸附时间。

（4）固定化酶的添加量的选择

研究酶添加量(用蛋白含量计算，酶液的蛋白含量为 4mg/mL)与载体的比例为 4、6、8、10、12、16、20、24mg/g时的固定化率和相对酶活力。pH4.0，30℃下固定 h。随着酶加入量的增多，相对酶活力增大，但是固定化率和酶活回收率都在下降。当酶添加量较小时，载体吸附的酶量少，酶可以更加分散，增大它与底物接触的比表面积，活性部位更加暴露，提高反应效率，但当酶加入量大时，载体上吸附的酶增多，空间位阻增大，影响酶活性中心和底物的接触，从而降低了反应效率，导致相对酶活力和酶活回收率下降，因此研究选择酶与载体比例为 mg/g作为最优的酶添加量。

（5）交联剂-戊二醛对固定化酶的影响

在酶被载体吸附后，再加入交联剂，使酶分子之间发生交联，达到更好的固定效果。考察戊二醛在不同浓度（0、0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%下对酶固定的效果影响。低浓度戊二醛（＜0.025%）的加入可以增加酶的固定化率，这是因为交联剂的加入可以使酶分子相互交联，使载体孔道内的酶分子增加。但是固定化酶活力却随着戊二醛浓度的增加而下降，这是因为酶分子发生交联后，使载体内孔径变小，增强了底物和产物的扩散限制作用而且戊二醛本身就是一种变性剂，所以当戊二醛加入量增大时，酶活急剧下降。因此后续实验不加入交联剂。

三、固定化酶的酶学特性 1.固定化酶的最适温度

在不同的反应温度(20℃一80℃)下进行试验，分别测定自制固定化酶、游离酶的活力，根据结果得到最适温度。

2固定化酶的最适pH

在不同pH值的缓冲液中进行试验，分别测定自制固定化酶、游离酶的活力，根据结果判定最适pH值。

3固定化酶的热稳定性

在不同温度的水浴中将自制固定化酶、游离酶保温 h后，立即臵于4℃冰浴中冷却，测定剩余酶活，根据结果判定其热稳定性。

4固定化酶的pH稳定性

将自制固定化酶、游离酶臵于不同pH值的缓冲液中，4℃放臵 h，测定剩余酶活，根据结果判定其pH稳定性。

5固定化酶的重复使用性

称取一定量的自制固定化酶，在相同的条件下，进行多次试验，测定其剩余酶活，考察重复使用性。

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